狐貍MC1R基因編碼區(qū)c.40A>C和c.41C>T相鄰變異研究

徐桂利，張文香，段玲欣，鞏元芳*，葛慕湘，劉謝榮，王書朋，果新苓，劉錚鑄*

(1.河北科技師范學院動物科技學院，秦皇島 066004； 2.河北東光縣農業(yè)局，東光 061600)

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狐貍MC1R基因編碼區(qū)c.40A>C和c.41C>T相鄰變異研究

徐桂利1，張文香1，段玲欣1，鞏元芳1*，葛慕湘1，劉謝榮1，王書朋2，果新苓2，劉錚鑄1*

(1.河北科技師范學院動物科技學院，秦皇島 066004； 2.河北東光縣農業(yè)局，東光 061600)

為了檢測狐貍MC1R基因多態(tài)性及其與毛色表型的相關性，本研究采集兩個狐屬12種毛色共計163只狐貍的皮膚組織樣，利用PCR擴增和產物直接測序的方法獲得狐貍MC1R基因1 054 bp長的核苷酸序列，并進行了SNPs篩查。用PopGen32和SHEsis軟件對突變位點進行了群體遺傳學分析，用PANTHER軟件評估了突變對基因產生的功能影響，用SPSS二元變量相關統(tǒng)計方法分析了多態(tài)位點與毛色表型間的相關性。結果表明，狐貍MC1R基因編碼區(qū)40(c.40A>C)和41 位點(c.41C>T)存在2 個相鄰錯義突變，導致其編碼的第14位氨基酸發(fā)生了變異：當?shù)?0 位點為A時，氨基酸由蘇氨酸(Thr)轉變?yōu)楫惲涟彼?Ile)；當?shù)?0 位點為C時，氨基酸由脯氨酸(Pro)轉變?yōu)榱涟彼?Leu)。北極狐屬狐在41 位點基因型全部為TT型，而狐屬狐大部分個體均為CC型，不存在TT型，推測該位點可能是區(qū)分狐貍屬間的一個重要功能位點。PANTHER預測獲知第41 位點突變導致的氨基酸替換(p.Pro14Leu)對MC1R功能有顯著影響。SPSS二元變量相關分析結果表明，41 位點多態(tài)性與狐貍毛色表型存在顯著低度相關性，推測狐貍MC1R基因編碼區(qū)第41位點可能是參與其毛色形成的一個相對重要功能位點。

狐貍；MC1R基因；40和41位點；多態(tài)性；毛色

毛色是動物表型的一種，對于狐貍來說毛色是衡量其毛皮經濟價值的一個重要指標。動物的毛色是由黑色素基因控制的。黑色素主要包括兩大類：一類為真黑色素，另一類為褐黑色素，隨著黑色素的種類和含量不同，動物毛發(fā)的顏色也會發(fā)生相應變化，真黑色素和褐黑色素所含比例大小決定了毛色的深淺程度[1]。目前，世界上人工飼養(yǎng)的狐貍大約有40多種不同色型，分類學上歸屬于兩個屬：狐屬(Vulpes)和北極狐屬(Alopex)[2-3]。

有關狐貍黑素皮質素受體1(Melanocortin 1 receptor，MC1R)基因多態(tài)性及其與毛色表型的相關性研究很少，目前僅有少量報道[4-5]。D.I.V?ge等[4]1997年報道，MC1R基因編碼區(qū)373位點的突變(c.373T>C)能引起狐屬狐銀黑色毛的產生，該課題組2005年又發(fā)現(xiàn)MC1R基因編碼區(qū)13和839兩個位點的錯義突變(c.13G>T和c.839T>G)可阻滯藍色北極狐冬季藍色被毛的表達[5]。近年來，國內外有關人類和哺乳動物MC1R基因多態(tài)性與毛色表型的相關性研究較多，但大多數(shù)都是針對基因單個位點的突變與毛色表型的相關性研究，J.S.Palmer等[6]和E.E.Bashmakova等[7]均報道，人類MC1R基因編碼蛋白151、160和294(Arg151Cys、Arg160Trp和Asp294His)的變異與紅發(fā)有關。M.Abitbol等[8]報道驢MC1R基因編碼區(qū)629位點的一個單堿基突變(c.629T>C)與紅色毛有很強的相關性。李洪濤等[9]報道哈薩克羊MC1R基因218位點突變(T218A)對黑色毛有顯性作用。郭多等[10]報道家犬MC1R基因編碼第306位氨基酸的密碼子存在一個由CGA到TGA的終止突變，使MC1R基因的翻譯終止，導致黃色毛的形成。有關兩個相鄰位點的變異及其與動物毛色表型的相關性研究目前鮮有報道。

鑒于以上研究背景，本研究擬采用PCR擴增和產物直接測序的方法，分析MC1R基因的多態(tài)性及其與狐貍毛色表型的相關性。研究結果將為探明MC1R基因調控狐貍毛色機理以及在生產上培育出滿足人類需求的更多彩色狐貍奠定分子理論基礎。

1　材料與方法

1.1試驗動物

本研究所用163只成年狐貍來自河北省秦皇島市昌黎縣金島“狐、貉、貂育種場”，其中赤狐18只、銀黑狐28只、白銀狐14只、巧克力狐9只、黑理石狐6只、紅理石狐5只、銀十字狐11只、金十字狐2只、琥珀狐5只、日暉狐2只、藍色北極狐47只、白色北極狐16只，其中藍色北極狐和白色北極狐歸屬于北極狐屬，其余毛色狐貍均歸屬于狐屬。

樣品采集：11月底至12月初，從受試狐貍體側無菌手術采集1 cm2左右的皮膚組織塊，去毛，投至已滅菌的1.5 mL離心管中，然后將離心管迅速投入液氮中冷凍并置于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.2基因組DNA的提取

基因組DNA的提取采用傳統(tǒng)的酚—氯仿抽提法[11]，TE溶解，-20 ℃凍存。

1.3引物設計和PCR擴增

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中登載的赤狐MC1R基因序列(序列號：X90844)，用Primer3(http：//www.genome.wi.mit.edu/cgibin/primer/primer3-www.cgi)設計擴增產物包含整個編碼區(qū)、大小為1 055 bp的1對引物，其上游序列為：5′-GAACTG-AGCGAGACACCTGA-3′，下游序列：5′-ATCACC-ACCTCCCTTTGCCCA-3′。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

PCR擴增反應體系為50 μL：基因組DNA 1 μL(75 ng·μL-1)，10×LA PCR Buffer Ⅱ(Mg2+Plus)5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 8 μL，上游引物(20 μmol·L-1)1 μL，下游引物(20 μmol·L-1)1 μL，TaKaRa LATaq?聚合酶(5 U·μL-1)0.5 μL，滅菌dH2O 33.5 μL。

PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，64 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳并在凝膠自動成像儀上檢測。

1.4PCR產物回收、測序

對于效果良好且量足夠的擴增產物，回收純化后，由上海生工生物技術服務有限公司進行測序。

1.5SNPs篩查及多態(tài)性分析

將163個不同毛色狐貍個體MC1R基因所得序列與網上登載的赤狐相應序列(X90844)用BioEdit (v7.0.5.2)[12]和DNAMAN(5.2.2.0)軟件進行比對及相似性分析。變異位點的等位基因、基因型以及單倍型及其頻率的分析，分別用PopGen32(version 1.31)[13]和SHEsis軟件[14]計算完成。

1.6功能預測

編碼區(qū)突變對基因產生的功能影響采用PANTHER軟件[15-16]進行評估。該軟件根據(jù)已知功能蛋白質家族多條序列的比對信息，分析蛋白質家族中不同位置氨基酸發(fā)生變化時，對蛋白質功能產生的影響程度?？赡墚a生的影響用特定位置取代進化保守值(Substitution position-specific evolutionaryconservation score，subPSEC)來衡量，該指標進一步表述為異義替換SNP 對蛋白質功能損害的概率(Pdeleterious)。subPSEC值或Pdeleterious越小(即越是趨向負值方向)表明越有可能對蛋白質功能產生損害。

1.7統(tǒng)計分析

利用SPSS16.0軟件中二元變量相關分析法統(tǒng)計分析狐貍MC1R基因多態(tài)位點與毛色表型的相關性。

2　結　果

2.1PCR擴增結果

利用所設計的引物，以其中1只供試銀黑狐基因組DNA為模板進行PCR擴增，結果見圖1。

1.PCR產物；M.DNA 相對分子質量標準1.PCR product；M.DNA marker DL 2000圖1　狐貍MC1R基因的PCR擴增Fig.1　Agarose gel electrophoretogram of fox MC1R PCR product (1 054 bp)

從圖1可以看出，PCR條帶接近于1 000 bp，且整齊、清晰、亮度也較好，初步說明擴增產物就是預期的目的條帶。

2.2測序結果分析

將以上銀黑狐的擴增產物回收純化后委托上海生工生物技術服務有限公司進行雙向測序，測序結果經BioEdit(v7.0.5.2)和DNAMAN(5.2.2.0)拼接整理，獲得1 054 bp長的一段核苷酸序列，該序列與GenBank上登載的赤狐MC1R基因相應序列比對后，相似性高達99.53%，說明所得序列就是銀黑狐MC1R基因的序列。進一步分析獲知該序列包括5′UTR區(qū)54 bp、編碼區(qū)954 bp和3′UTR區(qū)46 bp。

2.3SNPs篩查及分析

以上所得銀黑狐序列加上剩余162只狐貍的PCR產物測序后，用BioEdit(v7.0.5.2)軟件進行比對分析，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)第40(c.40A>C)和41位點(c.41C>T)存在2個相鄰的錯義突變，導致其編碼的第14位氨基酸的變異：當?shù)?0 位點為A時，氨基酸由蘇氨酸(Thr)轉變?yōu)楫惲涟彼?Ile)，當?shù)?0 位點為C時，氨基酸由脯氨酸(Pro)轉變?yōu)榱涟彼?Leu)。另外，對于第40位點，狐屬狐(包括赤狐、銀黑狐等10種毛色狐)存在3種基因型：AA、AC和CC，而北極狐屬狐(包括藍色北極狐和白色北極狐2種毛色狐)只有CC 一種基因型。對于第41位點，狐屬狐(包括赤狐、銀黑狐等10種毛色狐)存在2種基因型：CC和CT型，而北極狐屬狐(包括藍色北極狐和白色北極狐2種毛色狐)只有TT 一種基因型。兩位點基因型的分布和變異情況見表1和圖2。

2.4突變位點群體遺傳學分析

利用PopGen32(version 1.31)和SHEsis軟件對163只受試狐貍MC1R基因編碼區(qū)第40和41相鄰突變位點等位基因和基因型頻率進行了計算(表2)，同時對兩位點進行了單倍型的構建(表3)。由表2可知，兩位點C等位基因的頻率都較高，分別為0.855和0.524。由表3可知，兩位點共構建3種單倍型：H1(AC)、H2(CC)和H3(CT)，其中H2和H3的頻率較高，分別為0.380和0.476，為優(yōu)勢單倍型。

表1不同毛色狐貍MC1R基因編碼區(qū)第40和41位點的基因型變異

Table 1Identified genetic variations in 12 fox sub-populations with different coat color patterns

屬Genus不同毛色狐貍Differentcoatcolorfox變異Variationc.40A>Cc.41C>T狐屬Vulpes赤狐(18)RedfoxAA(3)AC(4)CC(11)CC(17)CT(1)銀黑狐(28)SilverfoxAC(10)CC(18)CC(19)CT(9)白銀狐(14)WhiteSilverfoxAA(3)AC(6)CC(5)CC(14)巧克力狐(9)ChocolatefoxCC(9)CC(4)CT(5)黑理石狐(6)BlackMarblefoxAA(2)AC(4)CC(6)紅理石狐(5)RedMarblefoxAA(2)AC(2)CC(1)CC(5)銀十字狐(11)BlackCrossfoxCC(11)CC(1)CT(10)金十字狐(2)GoldCrossfoxCC(2)CT(2)琥珀狐(5)AmberfoxCC(5)CC(2)CT(3)日暉狐(2)SunGlowfoxAA(1)CC(1)CC(2)北極狐屬Alopex藍色北極狐(47)ArcticBluefoxCC(47)TT(47)白色北極狐(16)ArcticWhitefoxCC(16)TT(16)

表2狐貍MC1R基因編碼區(qū)第40和41相鄰突變位點的等位基因和基因型頻率

Table 2Frequencies of genotypes and alleles at 40 and 41 sites in coding region of foxMC1Rgene

突變位點Mutationsite基因型頻率Genotypefrequency等位基因頻率Allelefrequency基因型Geno.頻率Freq.基因型Geno.頻率Freq.基因型Geno.頻率Freq.等位基因Allele頻率Freq.等位基因Allele頻率Freq.c.40A>CAA0.066AC0.157CC0.777A0.145C0.855c.41C>TCC0.428CT0.190TT0.379C0.524T0.476

表3狐貍MC1R基因編碼區(qū)第40和41相鄰突變位點單倍型頻率

Table 3Haplotype frequencies ofMC1Rgene covering the 2 polymorphic sites in foxes

單倍型Haplotype頻率Frequency突變位點Mutationsitec.40A>Cc.41C>TH10.145ACH20.380CCH30.476CT

2.5編碼區(qū)40和41相鄰突變位點對MC1R功能的影響

為了推測MC1R基因編碼區(qū)第40和41位點突變對蛋白功能的影響，用PANTHER軟件對比了與其進化相關的蛋白質中特定位點發(fā)生突變時對蛋白質功能的影響程度，由此得到功能損傷的似然值(表4)。subPSEC值是特定位置的野生型和突變型氨基酸的概率比值的負對數(shù)，該值在0(中性的)～-10(極可能對蛋白質功能有害)之間連續(xù)變化[17]。

圖2　狐貍MC1R基因編碼區(qū)40和41位點的突變Fig.2　The mutation of 40 and 41 sites in coding region of fox MC1R gene

表4MC1R第14位氨基酸變異的subPSEC和Pdeleterious值

Table 4The subPSEC andPdeleteriousscores of the 14th amino acid substitution

核苷酸變異Nucleotidevariation40位點41位點氨基酸變異AminoacidvariationssubPSEC值subPSECscoresPdeleterious值Pdeleteriousscores40位點為A時c.41C>Tp.Thr14Ile-1.625940.2019740位點為C時c.41C>Tp.Pro14Leu-4.204460.76932

2.6統(tǒng)計分析結果

通過SPSS二元變量相關分析得出狐貍MC1R基因編碼區(qū)第40位點基因型與毛色表型之間的相關系數(shù)(r)為-0.050，二者不具相關性，P=0.455，無統(tǒng)計學意義。第41位點基因型與毛色表型之間的相關系數(shù)(r)為-0.359，二者具低度相關，P= 0.000，說明二者有顯著相關性(表5)。

表5MC1R基因第40和41 位點變異與毛色表型的相關分析結果

Table 5The correlation analysis between genotype at 40 and 41 sites and coat color

位點Site相關系數(shù)(r)CorrelationcoefficientP值Pvalue結果Result40-0.0500.455不相關,無統(tǒng)計學意義41-0.359**0.000低度相關

|r|<0.3為不相關；0.3≤|r|<0.5為低度相關；0.5≤|r|<0.8為中度相關；0.8≤|r|<1為高度相關。P<0.05時，兩個變量間相關性顯著；當P<0.01時，兩個變量間相關性非常顯著，P>0.05 時，兩個變量間沒有顯著的相關性[18]

|r|<0.3 indicate no correlation；0.3≤|r|<0.5 indicate low correlation；0.5≤|r|<0.8 indicate moderate correlation；0.8≤|r|<1 indicate high correlation.P<0.05 indicate significant correlation；P<0.01 indicate extremely significant correlation；P>0.05 indicate no significant correlation

3　討　論

近年來，隨著人們對化工染料污染的擔憂和崇尚自然風潮的興起，綠色、天然、環(huán)保、優(yōu)質毛皮動物產品已成為廣大生產者與消費者的追求目標。因此，創(chuàng)制并選育天然彩色毛皮動物新品種，將成為現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展的緊迫任務，而探明毛皮動物彩色絨毛分子遺傳機制是實現(xiàn)上述目標的重要理論基礎。狐貍是一種重要的毛皮動物，其與家犬均歸屬于犬科，有關家犬MC1R基因的相關研究已有大量報道，并已證實該基因與其毛色有關[19-21]，但有關狐貍MC1R基因的相關研究則相對較少。J.M.Newton等[19-20]發(fā)現(xiàn)家犬MC1R蛋白的90和306位點變異(S90G和R306ter)分別與其黑/棕和紅/黃毛色相關。D.L.Dreger等[21]發(fā)現(xiàn)家犬MC1R蛋白的78位點變異(p.Gly78Val)與Saluki和Afghan Hound家犬的毛色有關。以上研究都是針對單堿基突變與毛色的相關性研究。本研究分析了狐屬和北極狐屬12種毛色共計163只狐貍MC1R基因編碼區(qū)序列，在第40和41位點發(fā)現(xiàn)了2個相鄰的錯義突變：c.40A>C和c.41C>T。當40位點為A時，導致其編碼的第14位氨基酸發(fā)生蘇氨酸向異亮氨酸的轉變(p.Thr14Ile)；當40位點為C時，導致第14位氨基酸發(fā)生脯氨酸向亮氨酸的轉變(p.Pro14Leu)，這一結果與J.Nowacka-Woszuk等[22]的研究結果相一致。J.Nowacka-Woszuk等[22]在分析家犬、赤狐、北極狐和貉MC1R基因編碼區(qū)的變異時，也發(fā)現(xiàn)了赤狐編碼區(qū)第40和41位點的變異，但由于其缺乏表型記錄沒有分析兩位點與毛色表型的相關性。本研究中，北極狐屬狐MC1R基因編碼區(qū)第41位點只有TT一種基因型，而狐屬狐則有CC和CT 2種基因型，不存在TT基因型，推測該位點可能是區(qū)分狐貍屬間的一個重要功能位點。群體遺傳分析表明，對于40位點，C為優(yōu)勢等位基因(0.855)，單倍型H2(CC，0.380)和H3(CT，0.476)為優(yōu)勢單倍型，說明大部分狐貍40位點均為C等位基因。通過PANTHER軟件功能預測，當40位點為C時，p.Pro14Leu處的subPSEC和Pdeleterious值分別是-4.204 46和0.769 32，表明該處氨基酸替換對MC1R功能有重要影響。SPSS二元變量統(tǒng)計分析結果表明，狐貍MC1R基因編碼區(qū)第41位點多態(tài)性與毛色表型存在顯著低度相關性，推測第41位點可能是參與毛色形成的一個相對重要功能位點。

4　結　論

本研究采用PCR擴增和產物直接測序的方法獲得了狐屬和北極狐屬共計163只不同毛色狐貍MC1R基因的編碼區(qū)序列，在第40和41位點發(fā)現(xiàn)2個相鄰錯義突變(c.40A>C和c.41C>T)。群體遺傳分析表明，狐貍MC1R基因編碼區(qū)41位點可能是區(qū)分狐貍屬間的一個重要功能位點。PANTHER軟件功能預測41位點突變(c.41C>T)導致的氨基酸替換(p.Pro14Leu)對MC1R功能有重要影響。SPSS二元變量統(tǒng)計分析結果進一步表明，41位點多態(tài)性與狐貍毛色表型存在顯著相關性。

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(編輯郭云雁)

Study on Adjacent Variation of c.40A>C and c.41C>T of FoxMC1RGene in Different Populations

XU Gui-li1，ZHANG Wen-xiang1，DUAN Ling-xin1，GONG Yuan-fang1*，GE Mu-xiang1，LIU Xie-rong1，WANG Shu-peng2，GUO Xin-ling2，LIU Zheng-zhu1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，HebeiNormalUniversityofScience&Technology，Qinhuangdao066004，China；2.AgricultureBureauofDongguangCountyinHebeiProvince，Dongguang061600，China)

In order to detect the relationship between polymorphism ofMC1Rgene and coat color in fox，a total of 163 skin samples of 12 coat color foxes were collected.The nucleotide sequence (1 054 bp) of foxMC1Rgene were obtained by the method of PCR and direct sequencing，and the polymorphism were analyzed.The population genetics were analyzed using PopGen32 and SHEsis softwares.The effect of mutations on the function ofMC1Rgene was evaluated using PANTHER software.The relationships between the variable sites and coat color were analyzed by the statistical methods of SPSS bivarate correlation analysis.Two adjacent missense mutations (c.40A>C and c.41C>T) were found in the coding region of foxMC1Rgene，which resulted in codon change of p.Thr14Ile or p.Pro14Leu.When 40 site was A，it led to the substitution between threonine (Thr) and isoleucine (Ile).When 40 site was C，it led to the substitution between proline (Pro) and leucine (Leu).All the genotypes of two coat color foxes belonging toAlopexwere TT.However，the genotypes of most coat color foxes belonging toVulpeswere CC.It was supposed that 41 site was important in distinguishingAlopexandVulpes.The in silico functional analysis showed that the amino acid substitution at p.Pro14Leu had significant impact on the function of MC1R.The statistical analysis showed the polymorphism of 41 site had significant low correlation with the fox coat color.The results indicate that SNP c.41C>T in the coding region of theMC1Rgene is probably associated with the coat color in fox.

fox；MC1Rgene；40 and 41 sites；polymorphism；coat color

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.010

2016-02-24

國家自然科學基金(31272412)；河北省自然科學基金(C2013407101；C2016407114)；河北省高等學校創(chuàng)新團隊領軍人才培育計劃(LJRC004)；河北科技師范學院科學研究基金(1)

徐桂利(1986-)，男，山東臨沂人，碩士生，主要從事動物分子遺傳育種研究，E-mail：296881485@163.com

鞏元芳，教授，E-mail：gyfkeyan@163.com；劉錚鑄，教授，E-mail：liuzhengzhu@163.com

S829.9;S813.3

A

0366-6964(2016)10-2020-07