黃芩苷對大鼠牙周炎牙齦組織中TNF-αmRNA和IL-6mRNA表達的影響

李會英　李國興　崔佳　劉哲敏　杜寧　劉學(xué)聰　喬玉巧

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·論著·

黃芩苷對大鼠牙周炎牙齦組織中TNF-αmRNA和IL-6mRNA表達的影響

李會英李國興崔佳劉哲敏杜寧劉學(xué)聰喬玉巧

目的觀察黃芩苷對牙周炎大鼠牙齦組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA、白細胞介素-6(IL-6)mRNA表達的影響，探討黃芩苷治療牙周炎的治療機制。方法選用50只8周齡SD大鼠，隨機分成5組,每組10只，A組為正常對照組， B組為牙周炎組，C1、C2、C3組為黃芩苷治療組，B，C1，C2，C3組建立牙周炎模型，治療1周后處死，采用RT-PCR方法檢測TNF-αmRNA、IL-6mRNA在5組大鼠牙齦組織中的表達水平。結(jié)果牙周炎組大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA、IL-6mRNA表達強度顯著高于正常對照組(P<0.05)，黃芩苷各治療組大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA、IL-6mRNA表達強度均明顯低于牙周炎組(P<0.05)。結(jié)論黃芩苷可以降低牙周炎大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA、IL-6mRNA的表達含量，并能改善大鼠牙周組織狀況。

黃芩苷；牙周炎；細胞因子；RT-PCR

牙周炎是累及牙周支持組織的炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為牙齦慢性炎癥、牙槽骨吸收和牙周袋形成。研究發(fā)現(xiàn)牙周炎患者炎癥牙齦和齦溝液中TNF-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-6(interleukin-6，IL-6)等炎癥細胞因子水平升高[1]，炎性細胞因子TNF-α和IL-6的主要功能是致炎作用,并能直接或間接地介導(dǎo)骨組織吸收。研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷對牙周炎具有一定的治療效果[2],但其相關(guān)治療機制尚不清楚。本研究采用大腸桿菌脂多糖誘導(dǎo)建立大鼠牙周炎模型，通過局部牙齦注射黃芩苷對牙周炎大鼠進行治療，利用RT-PCR技術(shù)，從mRNA水平檢測大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA的表達水平,觀察大鼠牙周組織變化情況，探討黃芩苷局部治療牙周炎的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物：SD大鼠50只，清潔級，8周齡，雄性，體重(220±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(動物合格證號：1410084)。大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后進行實驗。喂飼實驗動物中心的標準動物飼料，自由攝取水和食物。

1.1.2主要藥品與儀器：大腸桿菌ATCC O55:B5的脂多糖 (美國，sigma公司)，黃芩苷(中國藥物生物制品檢定所)；總RNA提取試劑TRIzol Reagent(GIBCOBRL公司,美國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑與PCR試劑SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit (TaKaRa公司，日本)；TNF-αand IL-6及GADPH引物(上海生工生物工程有限公司)；Kodak_1DDC_120電泳凝膠成像自動分析系統(tǒng)(Kodak公司,美國)；7500熒光定量PCR儀(AB公司；美國)。

1.2實驗方法

1.2.1溶液的配制：取2 mg黃芩苷溶于2 ml 0.9%氯化鈉溶液中，碳酸氫鈉調(diào)pH值至7.4，至黃芩苷完全溶解，成為1 mg/ml的儲存液，4℃保存?zhèn)溆?，試驗時用0.9%氯化鈉溶液稀釋至所需濃度；取10 mg脂多糖(LPS)，用0.9%氯化鈉溶液稀釋至1 mg/ml的溶液。LPS的終末濃度為1 mg/ml，黃芩苷終末濃度為0.01、0.1、1.0 μg/ml。

1.2.2動物分組及牙周炎模型的建立：取SD大鼠50只,隨機分5組：對照組(A組)、牙周炎組 (B組)、黃芩苷治療組(C1、C2、C3組)，每組10只。除A組外,其余4組大鼠用10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉成功后，選大鼠右上頜第1、2磨牙之間頰腭側(cè)齦溝底注射LPS(1 mg/ml)各0.2 ml，每天在同一部位重復(fù)1次，連續(xù)3天，1周后大鼠牙周炎模型建立。

1.2.3黃芩苷的局部治療：大鼠牙周炎模型建立后第2天開始用藥，A組不用藥，黃芩苷治療組(C1、C2、C3組)每天在大鼠右上頜第1、2磨牙之間頰腭側(cè)齦溝底分別注射0.01、0.1、1.0 μg/ml黃芩苷溶液各0.2 ml，B組注射等量0.9%氯化鈉溶液，均連續(xù)3 d，分籠飼養(yǎng)。用藥前、后分別觀察各組大鼠牙周組織、全身狀況、毛發(fā)、食欲及糞便情況。

1.2.4動物處死及標本采集：用藥后第7天，采取頸椎脫臼法處死各組大鼠，5 min內(nèi)剪取大鼠右上頜第1、2磨牙、牙槽骨及牙周組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗后置于10%甲醛固定、10%EDTA脫鈣、包埋，制作右上頜磨牙頰腭向石蠟切片，片厚5 μm，蘇木精-伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察牙槽骨吸收及牙周袋形成情況；另取右上頜第1、2磨牙頰腭側(cè)實驗處新鮮牙齦組織放置于eppendorf管中，液氮驟冷后，-70℃冰箱保存，用于TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA的檢測。

1.2.5RT-PCR檢測大鼠牙齦組織中TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA的表達水平：①提取RNA 將牙齦標本復(fù)融，取0.1 g，粉碎至勻漿狀，加入1 ml RNA裂解液吹打均勻，加入200 μl氯仿混勻，13 000 r/min 4℃離心15 min。取上清液加入500 μl異戊醇-30℃放置12 h，離心同上。棄上清液，加75%乙醇200 μl洗滌，再次離心同上，棄上清液得白色沉淀，加入50 μl聚碳酸二乙酯(diethlpyrocarbonate，DEPC)，置-20℃冰箱備用。采用紫外分光光度計測定RNA純度。②逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 分別取1 μl TNF-α mRNA、 IL-6 mRNA，2×緩沖液(buffer)5 μl，2 mmol/L MgSO42 μl，10 mmol/L脫氧核苷三磷酸(dNTPs )0.5 μl，40 U/μl RNA酶抑制劑(RNase Inhibitor)0.25 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶(Bca Best polymerase)0.5 μl，寡脫氧胸苷酸(OligodT)0.5 μl，以雙蒸水補足反應(yīng)體積至10 μl，操作嚴格按試劑盒說明書進行。③PCR擴增 PCR反應(yīng)體系為20 μl，其中包括SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)10 μl，Rox Reference DyeⅡ(50×) 0.4 μl，上下游引物(10 μM)各0.4 μl，cDNA模板2 μl及d H2O 6.8 μl。置于7500 real-time PCR儀上，兩步法PCR擴增，擴增程序為：第一步 預(yù)變性：95℃ 30 s；第二步 PCR反應(yīng)：95℃ 5 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗證。以 GAPDH 作為內(nèi)參照，所用引物序列如下。見表1。

表1　基因引物的堿基序列

2　結(jié)果

2.1實驗動物的一般情況A組大鼠牙齦組織無紅腫充血及牙周袋形成，體重逐漸增加，毛澤光亮，神態(tài)、活動、進食水、大便均正常。B、C1、C2、C3組大鼠于注射LPS后第2天出現(xiàn)牙齦組織紅腫，神態(tài)倦怠、活動笨拙、皮毛疏松無光澤、進食水減少、大便干燥等癥狀，隨著注射LPS次數(shù)的增加，上述癥狀逐漸加重；B組注射0.9%氯化鈉溶液后牙齦組織仍然紅腫，牙周袋形成，探診深度4～5 mm，神態(tài)倦怠、活動笨拙、皮毛無光澤、進食水下降、大便干燥等癥狀無明顯改善，而C1、C2、C3組隨著注射黃芩苷治療時間的增加，上述癥狀逐漸改善，用藥3天后，牙齦組織紅腫充血減輕，牙周袋探診深度3～4 mm，神態(tài)趨于正常，皮毛光澤改善，進食及活動增多，大便偶有干燥，并且C3組效果最明顯。

2.2牙周組織病理變化光鏡下可見，B組大鼠的牙齦上皮和皮下結(jié)締組織局部潰瘍、壞死，牙周膜纖維排列紊亂，牙周袋形成，牙槽嵴吸收明顯，表面呈蠶食狀，牙槽骨可見明顯的破骨細胞和骨吸收陷窩；C1、C2、C3組與B組比較，牙周組織表現(xiàn)為牙齦上皮和上皮下結(jié)締組織較完整，牙周膜主纖維束排列較整齊，牙周袋形成與牙槽嵴吸收較輕，炎性細胞逐漸減少，成纖維細胞增多，牙周間隙較正常，牙周膜及牙槽骨結(jié)構(gòu)趨于正常，牙周組織處于炎癥修復(fù)期；A組牙齦上皮和上皮下結(jié)締組織光滑完整，牙周膜纖維排列整齊，牙槽骨表面光滑，無明顯骨吸收、破骨細胞及骨吸收陷窩形成。見圖1。

A組 正常對照組　　　B組 牙周炎組　　　　　C1、C2、C3組 黃芩苷治療組

圖15組牙周組織形態(tài)(HE×10)

2.3黃芩苷對大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA 、IL-6 mRNA表達水平的影響B(tài)組大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA的表達水平明顯高于A組(P<0.05)；與B組比較,C1、C2、C3組大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA的表達水平均明顯降低(P<0.05)，且C1、C2、C3組TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA表達水平依次逐漸下降(P<0.05)。B組大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA表達強度明顯高于A組大鼠；局部應(yīng)用黃芩苷治療后1周后,C1、C2、C3組較牙周炎組大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA的表達強度隨黃芩苷濃度增加依次明顯下降。見表2,圖2。

組別TNF-α(fold)IL-6(fold)A組32.34±4.6325.40±2.93B組87.33±5.38*68.27±0.33*C1組63.67±3.67*#55.39±4.41*#C2組51.75±6.00*#45.44±3.78*#C3組41.45±3.79*#36.33±4.04*# F值60.0670.27 P值5.91×10-72.79×10-7

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05

3　討論

牙周炎是一種以骨破壞為主要特征的慢性細菌感染性疾病，發(fā)生在牙齒的支持組織，是由革蘭氏陰性(G-)厭氧菌、鞭毛菌、螺旋體等微生物引起的炎癥性疾病，其中G-厭氧菌及其內(nèi)毒素刺激可引起宿主局部免疫細胞反應(yīng),從而激活宿主防御細胞釋放TNF-α和 IL-6等多種炎癥細胞因子，這些炎癥細胞因子繼發(fā)引起牙齦組織炎癥、牙槽骨破壞和吸收等牙周組織損傷[2，3]。內(nèi)毒素是G-細菌細胞壁外膜中的脂多糖(LPS),是G-細菌細胞壁外膜所獨有的一種致病物質(zhì),對牙周組織具有很高的毒性。在不同微生物之間，LPS的化學(xué)組成有所不同，但其基本結(jié)構(gòu)相似。LPS的生物活性中心是類脂A，幾乎可介導(dǎo)所有LPS的生物學(xué)反應(yīng),并且類脂A在各種G-菌中的結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分相似,無種屬特異性,因此不同種屬G-細菌的LPS引起的毒性作用基本相似[4]。根據(jù)amamurthy的參考文獻，采用大腸桿菌LPS誘導(dǎo)大鼠實驗牙周炎模型, 已由SUNY Stony Brook動物用戶委員會認可[3]。 LPS誘導(dǎo)的大鼠牙周炎模型,簡便、可比性強,具有可重復(fù)性。本實驗采用大腸桿菌LPS進行實驗，連續(xù) 3 d 在大鼠右上頜磨牙同一部位的牙齦組織中注射LPS,1周后牙周袋形成,牙齦紅腫,探診出血。光鏡下,炎癥細胞聚集,破骨細胞浸潤,牙槽骨吸收。

在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中，牙周組織中單核細胞、巨噬細胞、多形核白細胞、牙齦及牙周膜成纖維細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞和成骨細胞等均可分泌TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥細胞因子，這些細胞因子可以誘導(dǎo)白細胞和內(nèi)皮細胞粘附分子的上調(diào)，刺激趨化因子的產(chǎn)生和聚集；誘導(dǎo)其他可放大或維持炎癥反應(yīng)的介質(zhì)表達，例如前列腺素；刺激組織溶解酶產(chǎn)生，例如基質(zhì)金屬蛋白酶；提高細菌殺傷力和噬菌活性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α誘導(dǎo)骨吸收的活性較強，通過刺激膠原酶介導(dǎo)組織破壞，誘導(dǎo)破骨細胞的前體細胞增生、分化，并間接作用于成熟的破骨細胞，造成牙槽骨的破壞和吸收，也是刺激前列腺素和蛋白酶產(chǎn)生的主要因子，在牙周組織破壞中起重要作用；IL-6是一種多效應(yīng)炎性細胞因子,細菌﹑病毒﹑寄生蟲﹑脂多糖等均可提高其基因表達，IL-6的生物功能較多，可誘導(dǎo)B淋巴細胞分化并分泌免疫球蛋白，促進多種細胞如T淋巴細胞、造血干細胞等的增殖，抑制成纖維細胞的生長，參與骨吸收，有效地抑制IL-6的分泌和合成,對牙周炎的治療有重要意義[3,6]。有研究顯示在牙周炎患者的齦溝液和牙齦組織中可檢測到高水平的TNF-α、IL-6，其表達水平和牙周炎癥的嚴重程度明顯相關(guān)[7，8]。因此通過藥物抑制這些炎癥細胞因子的表達水平對于抑制牙周炎癥反應(yīng)具有重要意義[9，10]。

研究表明，黃芩苷是中藥黃芩的主要有效成分，具有抑菌、清熱、抗變態(tài)反應(yīng)等多種作用，黃芩苷可通過清除LPS誘生的自由基,阻斷LPS破壞細胞生物膜系統(tǒng), 穩(wěn)定細胞膜,從而保護細胞表面,抑制牙周細胞分泌炎性細胞因子，并可抑制其發(fā)揮作用[11]。陳悅等[12]研究認為黃芩苷抑制牙周炎和牙槽骨吸收的機理可能是通過巨噬細胞分泌 TGF-β，從而抑制T細胞的活性、增殖和數(shù)量，導(dǎo)致 T細胞產(chǎn)生的TNF-α等炎性因子減少，引起破骨細胞減少，從而抑制牙槽骨破骨細胞的生成，牙周炎癥狀減輕。羅志曉等[13]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可阻止成纖維細胞和炎性細胞的相互作用，抑制炎性細胞因子以及金屬基質(zhì)蛋白酶等的合成和分泌，減少炎性細胞的聚集、滯留及牙槽骨的破壞，阻止牙周炎病程進展。王國芳等[14]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷、黃芩苷和大黃素聯(lián)合應(yīng)用對脂多糖誘導(dǎo)的實驗性牙周炎牙槽骨吸收具有一定的抑制作用。有研究還發(fā)現(xiàn)黃芩苷在體外能顯著降解內(nèi)毒素[15],對LPS致鼠巨噬細胞過度釋放TNF-α有抑制作用[16]。

本實驗通過牙齦局部注射LPS成功建立大鼠實驗性牙周炎模型后，使用不同濃度黃芩苷牙齦局部注射治療大鼠牙周炎，觀察大鼠牙周組織變化狀況，采用RT-PCR法檢測大鼠牙齦組織中TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA表達水平的變化，從而探討黃芩苷治療牙周炎的療效與機制。結(jié)果顯示，與牙周炎組相比，局部注射黃芩苷后，各治療組大鼠牙齦組織充血腫脹減輕，牙周袋變淺，神態(tài)趨于正常，皮毛光澤改善，進食及活動增多，體重逐漸增加，濃度為0.01 ～1.0 μg/ml黃芩苷均能抑制大鼠牙齦組織中TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA的表達，隨著黃芩苷濃度升高，TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA表達水平逐漸降低，不同濃度組間比較，抑制作用有顯著性差異(P<0.05)。因此本研究表明，黃芩苷可降低實驗性牙周炎大鼠牙齦組織中TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA的表達水平，減輕機體炎性反應(yīng)，抑制牙槽骨吸收，提示臨床上局部應(yīng)用黃芩苷治療牙周炎，可能會減輕牙周炎的炎性反應(yīng)，抑制破骨細胞形成，促進牙周病患者的康復(fù)，但是黃芩苷的確切作用機制還有待于進一步研究。

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Effects of baicalin on the expressions of TNF-αmRNA and IL-6mRNA in gingiva tissues of rat with periodontitis

LIHuiying,LIGuoxing,CUIJia,etal.

DepartmentofStomatology,HebeiProvincialChildren’sHospital,Shijiazhuang050031,China

ObjectiveTo observe the effects of baicalin on the expressions of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) mRNA and interleukin-6 (IL-6) mRNA in gingiva tissues of rat with periodontitis in order to explore the action mechanism of baicalin in treatment of periodontitis.MethodsFifty SD rats (8-week age) were randomly divided into 5 groups:blank control group (group A), periodontitis group (group B), baicalin treatment groups including group C1,group C2,group C3,with 10 rats in each group.The animal models with periodontitis were established in group B,group C1,group C2 and group C3.All the rats were sacrificed after 7-day treatment,and the expression levels of TNF-αmRNA and IL-6 mRNA were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technique.ResultsThe expression levels of TNF-αmRNA and IL-6 mRNA in gingiva tissues of rats in group B were significantly higher than those in group A (P<0.05),moreover, the expression levels of TNF-αmRNA and IL-6 mRNA in group C1,group C2 and group C3 were significantly lower than those in group B (P<0.05).ConclusionThe baicalin can decrease the expression levels of TNF-αmRNA and IL-6 mRNA in gingiva tissues of rat with periodontitis, and can also improve the status of periodontal tissues.

baicalin；periodontitis；cytokines；reverse transcription polymerase chain reaction

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.20.006

050031石家莊市,河北省兒童醫(yī)院口腔科

劉學(xué)聰，050031石家莊市，河北省兒童醫(yī)院口腔科；

E-mail: lgxlhy@163.com

R 781.42

A

1002-7386(2016)20-3068-04

2016-04-17)

項目來源：河北省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥類科研計劃課題(編號:2013181)