高效液相色譜法測定柵藻中5種類胡蘿卜素的含量

張彩凌*， 牛春芳， 葛興信， 武獻春

(新奧科技發(fā)展有限公司，煤基低碳能源國家重點實驗室，河北廊坊 065001)

類胡蘿卜素是一種重要的天然色素，它不僅是一種很好的食品添加劑,而且廣泛應用于化妝品、保健品等。同時類胡蘿卜素在人體內(nèi)具有多種生物學功能，可對一些疾病起到預防和治療作用[1]。目前，對類胡蘿卜素的分析多采用高效液相色譜法(HPLC)。而HPLC法用于類胡蘿卜素分離分析時最常用C18柱，流動相常用甲醇、異丙醇、乙腈、水，并配以一些溶劑如正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷，采用梯度洗脫[2 - 6]。但是C18柱對于結構相似的類胡蘿卜素及其異構體的分離仍然是一項挑戰(zhàn)[7]，最為典型的情況是玉米黃質(zhì)和葉黃素兩者互為異構體，分離起來比較困難。1992年，Craft[8]首次應用C30柱分離類胡蘿卜素標準品和血清中的類胡蘿卜素。隨后人們嘗試用C30柱來優(yōu)化類胡蘿卜素的分離[9]。尤其是在分離葉黃素和玉米黃質(zhì)這兩種結構非常相似的化合物上，C30柱顯示出了明顯的優(yōu)勢。目前還未見報道采用C30柱HPLC法分離檢測柵藻中各種色素含量的報道。

微藻是生產(chǎn)類胡蘿卜素的最佳來源，柵藻是一種常見的淡水微藻，含有豐富的類胡蘿卜。本文以該藻為研究對象，用C30-HPLC法對其中的蝦青素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、角黃素和β-胡蘿卜素5種類胡蘿卜素的含量進行測定，此方法具有分離效果好、多組分同時分析的特點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國,Agilent公司)，配紫外檢測器；3-15高速離心機(Sigma)，超聲波清洗儀(南京壘君達超聲電子設備有限公司)。

標準品：蝦青素(純度96.0%)、玉米黃質(zhì)(純度85%)、角黃素(純度≥98%)購于Toronto Research Chemicals Inc)；葉黃素(純度≥90%)購于Seebio Biotech,Inc；β-胡蘿卜素標品(純度≥93%)購于Sigma，各標準品-18 ℃避光儲存于。稱取適量5種色素的標準品用二氯甲烷和丙酮的混合液溶解(超聲波促進溶解)，加入適量的2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)，定容于25 mL棕色瓶中，充氮氣并于-18 ℃冰箱避光保存。二甲基亞砜、丙酮、乙腈、二氯甲烷均為分析純，甲醇和甲基叔丁基醚均為色譜純。實驗用水為蒸餾水。

1.2 提取與皂化

準確稱取50 mg藻粉，加入4 mL 二甲基亞砜(DMSO)，放入超聲波清洗儀中于20 ℃超聲15 min，離心，取上清液，剩余藻渣加入4 mL提取液二氯甲烷∶甲醇混合液(體積比 25∶75)，放入超聲波清洗儀中20 ℃超聲15 min，離心，取上清液；重復此步驟直至上清液和藻渣變白。合并上清液，加入1/6體積的0.107 mol/L NaOH-甲醇溶液，混勻，充氮氣，在4 ℃冰箱中黑暗冷皂化12 h。于上述皂化液中加入3～5 mL石油醚，震蕩均勻后加入與皂化液等體積的蒸餾水，靜置分層后，吸取上層液體；剩余液體繼續(xù)加入石油醚提取，直至色素全部抽提完全。合并上層液體，氮氣吹干，然后用5 mL提取液定容，經(jīng)0.22 μm針筒式有機濾膜過濾，濾液待測。

1.3 高效液相色譜法測定條件

色譜柱：YMC-carotenoid C30柱(250×4.6 mm,5 μm，日本YMC公司)；流動相：A為甲醇∶甲基叔丁基醚∶水混合液(體積比81∶15∶4)，流動相B為甲醇∶甲基叔丁基醚∶水混合液(體積比 7∶90∶3)。洗脫程序：0～55.6 min,100%～44.4%A；流速：1.0 mL/min；紫外檢測器檢測波長：450 nm；進樣量：10 μL；柱溫：20 ℃。外標法定量。

2 結果與討論

2.1 穩(wěn)定性

由于類胡蘿卜素是由多個異戊二烯單元構成，其中所含的多個雙鍵導致該類化合物具有極大的不穩(wěn)定性，在光照下易被破壞，很容易被空氣中的氧或過氧化物氧化，所以混標應該避光低溫保存。樣品前處理過程中應盡快完成且盡量避免強光，控制操作溫度，利用超聲波提取時需控制提取溫度在20 ℃以下，皂化在低溫條件下進行并且不能時間太長，充氮氣。

2.2 提取及皂化方法的考察

天然蝦青素是以酯的形式存在,一般采用提取皂化的方法進行測定。孫偉紅[10]等人采用二氯甲烷、甲醇提取經(jīng)堿皂化的微藻中的色素，但因5種色素溶解度的差異性，所以不適合采用2種溶劑提取。本實驗采用DMSO超聲破壁的方法預提取柵藻中的色素，再采用混合溶劑提取，使柵藻中的5種色素達到充分的溶出提取。而對于β-胡蘿卜素則同時采用了直接提取測定和提取皂化測定的方法，并且對于兩種方法的結果進行了比較，結果表明皂化不會影響β-胡蘿卜素含量測定，所以最終對樣品采用提取皂化的方法處理。對于樣品中的角黃素進行了提取率實驗，測得提取率為91%。

2.3 色譜分離與定性

選擇C30柱,柱溫20 ℃，比較了乙腈∶甲醇∶甲基叔丁基醚體系做流動相、乙腈∶水∶甲基叔丁基醚/磷酸體系做流動相、甲醇∶水∶甲基叔丁基醚體系做流動相進行分離分析，發(fā)現(xiàn)乙腈∶甲醇∶甲基叔丁基醚體系、乙腈∶水∶甲基叔丁基醚∶磷酸體系做流動相玉米黃質(zhì)與葉黃素無法很好分離，因此本實驗選取甲醇∶水∶甲基叔丁基醚體系做流動相進行洗脫。借鑒Sander[11]等應用的C30柱分離類胡蘿卜素的方法，對洗脫程序進行優(yōu)化，縮短了樣品分析的時間。圖1(A)為蝦青素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、角黃素和β-胡蘿卜素混合標樣的液相色譜圖，圖1(B)為柵藻樣品皂化提取液的色譜圖。從圖中可見，在本實驗選定的色譜條件下，5種色素得到較好的分離。對5種色素的分離進行了分離度和理論塔板數(shù)的計算，結果表明5種色素的分離度都在2.0以上，理論塔板數(shù)都在6 000以上，能夠滿足測定要求。

2.4 線性關系與檢出限

配制5種色素的系列濃度混合標準溶液并進行測定，以質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標,以峰面積(y)為縱坐標繪制標準工作曲線；以3倍信噪比(S/N)測得各組分的檢出限。蝦青素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、角黃素和β-胡蘿卜素在一定濃度范圍內(nèi)呈良好線性關系。線性回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)及檢出限如表1。

表1 方法的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)及檢出限

2.5 回收率與精密度試驗

為驗證方法的可靠性，進行了回收率和精密度(RSD)試驗。每一加標水平重復測定5次，結果如表2所示。由表2可見，添加回收率高，準確度和精密度都能滿足類胡蘿卜素含量測定要求，適用于柵藻中類胡蘿卜的含量測定。

表2 方法的加標回收率(n=5)

3 結論

本文建立了柵藻中5種類胡蘿卜素提取皂化的方法,使得一次性同時分離檢測5種色素的含量成為可能，該處理方法節(jié)省時間，準確可靠。C30-高效液相色譜-紫外檢測法檢測5種類胡蘿卜素，分離度、理論塔板數(shù)均可以滿足分離分析要求。該方法準確、可靠，操作簡單，可同時定性定量分析柵藻中5種類胡蘿卜素的含量。