維藥毛菊苣水提取物抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究

楊巧麗　王　雪　馬雪萍　劉　燕　司麗君　史玉柱新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊830004

維藥毛菊苣水提取物抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究

楊巧麗王雪馬雪萍劉燕司麗君史玉柱
新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊830004

目的探討維吾爾族習(xí)用藥材毛菊苣水提取物（MS）的抗炎作用。方法體外采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞，建立炎癥模型。采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測MS的細(xì)胞毒性作用，采用Griss法檢測細(xì)胞上清中NO的生成量，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測細(xì)胞上清中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）的水平；在體實(shí)驗(yàn)采用冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)模型，觀察MS的體內(nèi)抗炎作用。結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)，與空白對照組比較，MS 250μg/mL以下濃度對RAW264.7細(xì)胞生長無影響。MS 15.625、31.25、62.5、125、250μg/mL濃度均可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞上清中NO和IL-10的生成（P＜0.01），此外，250μg/mL劑量組可顯著抑制IL-1β的分泌（P＜0.01），且隨著MS濃度的升高，對TNF-α分泌的抑制作用逐漸增強(qiáng)；在體實(shí)驗(yàn)，與模型組比較，MS 130、260mg/kg劑量組對冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)均有顯著的抑制作用（P＜0.01），抑制率分別達(dá)到49%和57%。結(jié)論MS具有顯著的抗炎活性。

毛菊苣；水提取物；抗炎作用；RAW 264.7細(xì)胞；白細(xì)胞介素-1β：白細(xì)胞介素-10；腫瘤壞死因子-α

［Avsteact］Ov jective To investigate the anti-inflammatory effects of CichoTium glandulosum Boiss.et Huet aqueous extracts（MS）.M ethods In vitTo，lipopolysaccharide was used to induce RAW264.7 cells to build model of inflammation. The effect of MSon cell toxic was detected bymethyl thiazolyl tetrazolium assay（MTT）.The NO generation in cell supernatantwas detected by Grissmethod，and the levels of interleukin-1β（IL-1β），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin 10（IL-10）in cell supernatantwere detected by Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.In vivo，themodels of the increase of capillary permeability in mice induced by acetic acid were used to evaluate the anti-inflammatory effect of MS.Results In vitTo，compared with the control group，MS（≤250μg/mL）had no influence on the proliferation of RAW264.7 cells.MS 15.625，31.25，62.5，125，250μg/mL significantly decreased the levels of NO and IL-10（P＜0.01）.Meanwhile，250μg/mLMSsignificantly decreased the levels of IL-1β（P＜0.01），and with the increase of the concentration of MS，the inhibition on TNF-αsecretion gradually strengthened.In vivo，compared with themodel group，130，260 mg/kg MS significantly inhibited the increase of abdominal cavity capillary permeability in mice caused by acetic acid（P＜0.01），the inhibition rate was 49%and 57%respectively.Conclusion MShas significantanti-inflammatory effects.

［Key woeds］CichoTium glandulosum Boiss.et Huet；Aqueous extracts；Anti-inflammatory effect；RAW264.7 cells；Interleukin-1β；Interleukin-10；Tumor necrosis factor-α

維吾爾族習(xí)用藥材菊苣（CichoTii HeTba/CichoTii Radix）為菊科植物毛菊苣（CichoTium glandulosum Boiss.et Huet）或菊苣（CichoTium intybus L.）的干燥地上部分或根，2015年版《中國藥典》收載品種［1］，是清熱卡森顆粒（國藥準(zhǔn)字Z65020172）、護(hù)肝布祖熱顆粒（國藥準(zhǔn)字Z65020168）、復(fù)方木尼孜其顆粒（國藥準(zhǔn)字Z65020166）、炎消迪娜兒糖漿（國藥準(zhǔn)字Z65020183）的主要原料藥材［2-3］。維吾爾醫(yī)習(xí)用毛菊苣水提取物（MS）治療肝炎、膽囊炎等炎癥性疾病，以上4個方劑的現(xiàn)代藥理學(xué)研究也已證實(shí)該方面的功效［4-8］。臨床研究表明，肝臟炎癥壞死及其所致的肝纖維化［9］是肝炎疾病進(jìn)展的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。因此，在對病因治療的基礎(chǔ)上有效控制肝組織炎癥，有可能減少肝細(xì)胞破壞和延緩肝纖維化的發(fā)展［10-11］。故本課題在研究MS保肝和體外抗乙型肝炎作用的同時，擬開展其抗炎作用的研究，查閱相關(guān)文獻(xiàn)抗炎作用的研究尚屬空白，故本研究采用MS處理巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，建立炎癥模型，并結(jié)合其對冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)模型的研究，旨在初步探討MS的抗炎作用，為毛菊苣的臨床開發(fā)應(yīng)用提供理論線索。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑

毛菊苣全草，采自新疆吉木薩爾縣泉子街鎮(zhèn)十八戶村，藥材經(jīng)新疆藥物研究所維藥室何江副研究員鑒定，MS樣品為新疆藥物研究所制備，岀膏率為10.7%；地塞米松（Dexamethasone，DEX，浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：140672）；脂多糖（LPS）（sigma公司，批號：L2880）；冰醋酸（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號：20130112）；伊文思藍(lán)（上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠出品，批號：20120917）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-10酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司，批號：20140722）。

1.2動物和細(xì)胞株

SPF級6～8周齡，昆明種小鼠，雌雄兼用，體重18～22 g；由新疆實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2011-0001。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，適應(yīng)期12 h/12 h明暗交替，并觀察動物毛發(fā)、排泄物、活動及體重生長情況，動物正常采食、飲食，并最終選取合格動物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)：協(xié)和藥物研究所篩選中心惠贈）。

1.3儀器

Spectramax M2型微孔板監(jiān)測系統(tǒng)，Molecular Devices；SP-752型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；SW-CT-2FD型蘇凈安泰超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；XDS-1B倒置顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠。

1.4方法

1.4.1MS對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO的生成和TNF-α、IL-1β、IL-10蛋白表達(dá)量的影響

1.4.1.1RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)與傳代小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長至70%～80%融合后進(jìn)行傳代，3～4 d左右傳代1次。

1.4.1.2MTT法檢測不同濃度MS對RAW264.7細(xì)胞生長的影響取對數(shù)生長期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞，依據(jù)文獻(xiàn)方法［12-15］，測定終濃度7500、3750、1875、937.5、468.75、234.4μg/mL的MS對RAW264.7細(xì)胞生長的影響，并計算抑制率。抑制率=（A空白對照組-A給藥組）/A空白對照組×100%。

1.4.1.3MS對細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-10表達(dá)的影響［16-18］于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL（2× 105個細(xì)胞/mL）細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，每孔換成無血清的180μL RPMI 1640培養(yǎng)液。先于每孔中加入DEX和5個不同濃度（“1.4.1.2”確定的無毒濃度）的MS培養(yǎng)液10μL置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中作用1 h，每個濃度設(shè)3個平行孔，另設(shè)正常對照孔（control組）、模型組（LPS組）。1 h后細(xì)胞對照孔和模型組分別加入20μL/孔和10μL/孔無血清的180μL RPMI 1640培養(yǎng)液，其余各組每孔分別加入終濃度1μg/mL的LPS 10μL補(bǔ)足體系200μL/孔，混勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取培養(yǎng)上清液，Griss法測定NO濃度，ELISA法測定TNF-α、IL-1β、IL-10的濃度。

1.4.2對冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)的影響［19］

將48只昆明種小鼠，依性別、體質(zhì)量均衡隨機(jī)分為模型組、DEX 9.7 mg/kg組和MS 130、260 mg/kg劑量組，共4組，每組12只，灌胃給藥1次/d，連續(xù)4 d，末次給藥后1 h，各鼠均尾靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)生理鹽水溶液0.1 mL/10 g，隨即腹腔注射0.8%冰醋酸0.2mL/只，20min后脫頸椎處死小鼠，剪開腹部皮膚肌肉，用6mL生理鹽水分?jǐn)?shù)次洗滌腹腔，吸出洗滌液，3000 r/min（離心半徑：6 cm）離心5 min，取上清液于590 nm測定吸光度值，并進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。抑制率（%）=（A590nm模型組-A590nm給藥組）/A590nm模型組×100%。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MTT法檢測不同濃度MS對RAW 264.7細(xì)胞生長的影響

空白對照組和MS 234.4、468.75、937.5、1875、3750、7500μg/mL劑量組測定的吸光度值見表1。

表1　MS對RAW 264.7細(xì)胞生長的影響

2.2MS對細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-10表達(dá)的影響

LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后，與control組比較，LPS組中NO、IL-1β、IL-10、TNF-α蛋白水平均顯著升高。與LPS組比較，MS（15.625、31.25、62.5、125、250μg/mL）上清中NO的含量和IL-10的分泌量均顯著降低（P＜0.01），TNF-α的蛋白表達(dá)量隨MS濃度的增高逐漸降低，此外250μg/mLMS對IL-1β蛋白水平有極顯著的抑制作用（P＜0.01），并且MS細(xì)胞上清中NO的分泌量和TNF-α、IL-1β、IL-10的表達(dá)量均呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。見圖1～3。

圖1　MS對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞上清中NO表達(dá)的影響（x±s，n=3）

圖2　MS對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞上清中IL-1茁堯IL-10表達(dá)的影響（x±s，n=3）

圖3　MS對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞上清中TNF-琢表達(dá)的影響（x±s，n=3）

2.3對冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)的影響

各給藥組腹腔洗滌液較模型組為淺，由表2可見，與模型組比較，DEX 9.7mg/kg組，MS 130、260mg/kg劑量組對冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)均有顯著的抑制作用（P＜0.01），抑制率分別為51%、49%、57%，表明MS能抑制H+所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)。

表2　MS對冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)的影響（x±s，n=12）

3　討論

炎癥（inflammation）是人類疾病中最常見而復(fù)雜的病理過程，可以發(fā)生于機(jī)體的任何部位和任何組織，是機(jī)體清除刺激因素、對局部組織損傷進(jìn)行修復(fù)的過程。大部分患者存在不同程度的炎性反應(yīng)，會進(jìn)一步加重疾病的發(fā)展，甚至誘發(fā)嚴(yán)重的腫瘤疾病。故治療與控制患者的炎性反應(yīng)，對改善疾病的治療效果及預(yù)后具有十分重要的意義［20］。

維吾爾醫(yī)將MS用于臨床肝炎的治療，現(xiàn)代科學(xué)研究表明，肝臟炎癥壞死是導(dǎo)致病毒蔓延與迅速發(fā)展的關(guān)鍵病理學(xué)基礎(chǔ)，在全面找出致病因子的基礎(chǔ)上采取對癥治療才能對肝組織炎癥進(jìn)行有效的控制，進(jìn)一步延緩肝纖維化及減少肝細(xì)胞損傷的發(fā)展［21］。此外在炎性反應(yīng)過程中的兩類炎癥介質(zhì)：促炎反應(yīng)介質(zhì)（如腫瘤壞死因子、IL-1等）和抗炎反應(yīng)介質(zhì)（如IL-10、IL-4、IL-5等），它們以自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌等作用于局部和全身，以正負(fù)反饋方式相互調(diào)控，炎性反應(yīng)的轉(zhuǎn)歸將取決于這兩大類介質(zhì)的平衡，任何一方的過度優(yōu)勢均可造成炎癥失控、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的破壞。NO在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，尤其在炎性反應(yīng)的發(fā)生和信號傳導(dǎo)方面［22］。NO具有促炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1產(chǎn)生的作用，NO介導(dǎo)和促進(jìn)炎癥的有力證據(jù)是在多種炎癥性或免疫性動物模型中，在NO濃度顯著升高過程中，抑制NO合成可使典型的炎癥癥狀得到明顯改善［23］。探討毛苣菊水提取物的抗炎作用將有助于探明其保肝的作用機(jī)制。

在本研究中，在1μg/mL LPS的刺激下，RAW 264.7細(xì)胞分泌了炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子：NO、TNF-α、IL-1β、IL-10，而MS抑制了NO的分泌，而NO的減少可能進(jìn)一步減少了LPS介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞釋放的炎癥因子類介質(zhì)TNF-α、IL-1β的分泌量，從而起到抑制炎癥的作用。但I(xiàn)L-10在LPS的刺激下增高后，并未隨著藥物濃度的增高而得以抑制，從而發(fā)揮抗炎反應(yīng)介質(zhì)的作用，相反它隨著藥物濃度的增高而增高，該疑問期望在今后的實(shí)驗(yàn)研究中尋找到答案。

為進(jìn)一步考察MS的抗炎活性，本研究選擇了冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)的急性炎癥模型，研究結(jié)果表明：MS 130、260 mg/kg劑量組對冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)有顯著的抑制作用（P＜0.01），抑制率分別為49%、57%，表明其能抑制H+所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MS具有一定的抗炎活性。

本研究是在藥典記載MS的有效劑量下開展的其抗炎作用的研究，結(jié)果顯示MS具有一定的抗炎活性，但它在疾病模型中是否還能發(fā)揮其抗炎活性及如何發(fā)揮將是筆者下一步研究的重點(diǎn)。本課題組將結(jié)合本研究結(jié)果進(jìn)一步開展其保肝、抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究，同時開展其保肝作用物質(zhì)的基礎(chǔ)研究。

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Expeeimental study on the anti-inflammatoey effect of Cichorium glandulosum Boiss.et Huet aqueous exteacts

YANG Qiaoli WANG Xue MA Xueping LIU Yan SILijun SHIYuzhu

Xinjiang Institute of Materia Medica，Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830004，China

R285.5

A

1674-4721（2016）08（c）-0027-04

2016-04-09本文編輯：張瑜杰）

新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研：所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（KY2014061）。

楊巧麗（1979-），女，碩士；研究方向：中藥藥理與藥效學(xué)。