高遷移率蛋白族B1通過調控p53表達抑制T細胞增殖

賈 敏 張 卉 童亞林 姚詠明

（1. 廣西師范大學生命科學學院，廣西 桂林 541002；2.解放軍第181醫(yī)院燒傷整形中心，廣西 桂林 541002；3. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復與組織再生重點實驗室暨皮膚損傷修復與組織再生北京市重點實驗室，北京 100048)

感染與免疫·論著

高遷移率蛋白族B1通過調控p53表達抑制T細胞增殖

賈 敏1,2張 卉3童亞林1,2姚詠明3

（1. 廣西師范大學生命科學學院，廣西 桂林 541002；2.解放軍第181醫(yī)院燒傷整形中心，廣西 桂林 541002；3. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復與組織再生重點實驗室暨皮膚損傷修復與組織再生北京市重點實驗室，北京 100048)

目的：探討高遷移率蛋白族B1（HMGB1）對T細胞的增殖抑制作用及其分子機制。方法：將培養(yǎng)的Jurkat細胞分為對照組、HMGB1 (100 ng/ml) 12、24、48 h組，HMGB1組加入HMGB1培養(yǎng)相應時間；將細胞分為對照組、HMGB1 10、100、1 000 ng/ml組，予不同濃度HMGB1培養(yǎng)24 h；采用細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）法檢測各組細胞增殖率，采用實時熒光定量-聚合酶鏈反應（RT-PCR）和Western blot法檢測各組細胞中p53 mRNA、磷酸化p53及p53總蛋白的表達水平。將載有p53 shRNA、p53 mRNA表達序列及空白質料的病毒轉染入Jurkat 細胞中，并選擇100 ng/ml HMGB1刺激24 h，采用同樣方法檢測細胞增殖率。最后，將細胞分為正常組、HMGB1組、SB203580[p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）抑制劑]+HMGB1組進行相應處理。收集各組細胞，RT-PCR和Western blot法檢測p53 mRNA、磷酸化p53及p53總蛋白的表達水平。結果：HMGB1（100 ng/ml）刺激細胞24、48 h后細胞增殖率降低，較正常組差異有顯著性（P＜0.05)；100、1 000 ng/ml HMGB1刺激細胞24 h后，增殖率明顯下降，與正常組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。HMGB1（100 ng/ml）刺激細胞后，p53 mRNA、磷酸化及總蛋白表達水平在24、48 h逐步上升，且有明顯統(tǒng)計學意義（P＜0.05)；HMGB1刺激24 h，10、100 ng/ml HMGB1刺激組細胞p53 mRNA、p53磷酸化及總蛋白表達水平較正常組顯著上升，但1 000 ng/ml HMGB1沒有明顯變化；在不同轉染組中，予HMGB1刺激細胞，空載組增殖率降低，而p53 shRNA表達組細胞增殖趨于正常，p53 mRNA過表達組增殖率較空載組下降更為明顯。Jurkat細胞在p38 MAPK阻斷劑和HMGB1共同作用后，p53 mRNA、磷酸化及總蛋白表達水平比HMGB1刺激組明顯下降（P＜0.05）。 結論：胞外HMGB1可通過誘導p38 MAPK信號通路激活p53蛋白，抑制T細胞增殖。

高遷移率族蛋白B1 p53 p38 絲裂原活化蛋白激酶 T細胞增殖

高遷移率族蛋白B1（HMGB1）作為一種晚期炎癥因子，在膿毒癥免疫功能紊亂中發(fā)揮著重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1能抑制T細胞的有效增殖，從而影響細胞免疫反應，但其分子調控機制尚未完全闡明。p53又稱TP53（tumor protein 53，TP53），作為一種腫瘤因子，可通過調節(jié)細胞周期影響細胞的增殖[2]?，F(xiàn)已證實，在細胞內HMGB1和p53可相互作用，并存在一定的平衡關系[3]。而HMGB1對T細胞增殖的抑制效應是否通過p53調節(jié)，目前尚未見相關報道。本研究擬通過檢測不同劑量HMGB1刺激Jurkat細胞不同時間后細胞增殖率及p53表達水平，并進一步觀察干擾p53的表達對細胞增殖的影響，探討p53在HMGB1抑制T細胞增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人T淋巴細胞白血病細胞（Jurkat，Clone E6-1），購于中國科學院細胞庫；主要試劑包括磷酸鹽緩沖液（PBS，不含Ca2+、Mg2+，北京索萊寶公司），RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），CCK-8試劑盒（日本同仁化學公司），p53 shRNA、p53 mRNA過表達慢病毒（上海和元生物技術公司基因科技有限公司），磷酸化p53（p-p53）抗體（ab1431，美國Abcam公司），p53抗體（ab131442，美國Abcam公司），辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔二抗（C1309，北京普利萊基因科技有限公司），p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制劑SB203580（S1076，美國Selleck公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 Jurkat細胞培養(yǎng)于含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況2～ 3 d更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)或細胞傳代培養(yǎng)。實驗一：將復蘇后的Jurkat細胞培養(yǎng)至第3～4代進行分組， 分為正常組和HMGB1刺激組，HMGB1刺激組予100 ng/ml HMGB1分別刺激12、24、48 h；實驗二：將細胞分為正常組和10、100、1 000 ng/ml HMGB1處理組，給予相應濃度刺激24 h。實驗三：將細胞分為正常組、HMGB1（100 ng/ml）組及HMGB1（100 ng/ml）+ SB203580（10 μmol/L）組。

1.3 慢病毒轉染及p53 shRNA、p53 mRNA穩(wěn)定表達細胞株的建立 將體外培養(yǎng)的Jurkat細胞制成2×106/ml的單細胞懸液，接種至24孔板里，轉染8 h后，更換新鮮的正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d，熒光倒置顯微鏡下觀察到轉染后細胞綠色熒光（GFP）表達。選擇最優(yōu)濃度 5 mg/ml嘌呤霉素（puromycin）對細胞進行篩選，連續(xù)傳代培養(yǎng)2周左右，建立穩(wěn)定表達細胞株（流式細胞儀檢測GFP陽性率為：空載體轉染細胞和p53 shRNA表達細胞90%，p53 mRNA過表達細胞50%）。將制備好的以上3種細胞各分為對照組和HMGB1組，其中各HMGB1組給予濃度為100 ng/ml HMGB1刺激24 h。

1.4 CCK-8試劑盒檢測細胞增殖 96孔板培養(yǎng)板中種入5×104個/孔Jurkat細胞，予相應刺激后，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)特定時間。向每孔加入10% CCK-8溶液，然后將96孔板置于37 ℃溫箱孵育0.5～4.0 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值（A450）。

1.5 實時熒光定量-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測mRNA表達量 建立PCR體系，DNA模版1 μl，正向引物0.5 μl，反向引物0.5 μl，雙蒸水3 μl，SYBR Green qPCR Master Mix 5 μl，總體系10 μl。反應程序：95 ℃，10 min，1個循環(huán)；95 ℃，20 s，59 ℃（退火溫度），30 s，72 ℃（延伸溫度）25 s，40次循環(huán)：55～95 ℃溶解曲線。

1.6 Western blot檢測蛋白表達 收集并裂解細胞，采用BCA法對蛋白濃度進行定量分析。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法分離目的蛋白，通過半干轉的方法將目的蛋白轉移至甲醇浸泡過的硝酸纖維素膜上，配制5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉膜2 h，p53、p-p53一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBS-T潤洗5次，每次5 min；將膜置于辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔二抗（1∶5 000）溶液中室溫孵育1 h，TBS-T潤洗5次，在凝膠成像儀中與ECL溶液反應顯影、成像。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料用x±s表示。采用單因素方差分析（ANOVA）和組間兩兩比較q檢驗對細胞增殖、基因和蛋白表達量等數(shù)據(jù)進行組間比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HMGB1抑制Jurkat細胞增殖活性 CCK8法檢測結果顯示，用100 ng/ml HMGB1培養(yǎng)細胞至12 h，未見細胞增殖明顯受抑，連續(xù)培養(yǎng)24 h及48 h后，細胞增殖率低于正常組（P＜0.05，圖1A）；HMGB1濃度為10 ng/ml時刺激細胞24 h，HMGB1對細胞增殖沒有明顯的抑制作用，而HMGB1濃度為100、1 000 ng/ml組，細胞增殖率明顯降低（P＜0.05，圖1B）。

2.2 HMGB1上調p53 mRNA表達水平 與正常組相比，100 ng/ml HMGB1刺激24、48 h后p53 mRNA的表達水平逐步上調，差異均有顯著性（P＜0.05，圖2A)，而刺激12 h時HMGB1對p53 mRNA表達無明顯影響。與正常組比較，10、100 ng/ml組細胞的p53 mRNA表達明顯上調（P＜0.05，圖2B），而1 000 ng/ml HMGB1處理對p53 mRNA表達的改變沒有統(tǒng)計學意義。

2.3 HMGB1上調p53的磷酸化和總蛋白表達水平100 ng/ml HMGB1刺激24、48 h后，p53磷酸化和總蛋白水平較正常組高表達，并逐步上升（P＜0.05，圖3）；HMGB1在10 ng/ml時，p53的磷酸化和總蛋白表達水平顯著強于正常組（P＜0.05，圖4）。

圖1 HMGB1對Jurkat細胞增殖的影響

圖2 HMGB1對p53 mRNA表達的影響

2.4 干擾p53表達對HMGB1介導細胞增殖抑制效應的影響 p53 shRNA表達組和p53 mRNA過表達組較空載組p53 mRNA表達水平有明顯的差異性（P＜0.05，圖5）。予HMGB1刺激不同轉染細胞后，空載組增殖率降低，p53 shRNA表達組細胞增殖基本正常，而p53 mRNA過表達組增殖率降低更為明顯（P＜0.05，圖6）。

圖3 Western blot檢測不同時間點HMGB1刺激Jurkat細胞p53磷酸化和總蛋白表達水平

圖4 Western blot檢測不同濃度HMGB1刺激Jurkat細胞p53磷酸化和總蛋白表達水平

2.5 p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制劑可有效阻斷HMGB1對p53活化及表達的影響 RT-PCR和Western blot檢測結果顯示，HMGB1組較正常組p53 mRNA和蛋白表達量明顯上調（P＜0.05，圖7和圖8）。加入p38MAPK抑制劑SB203580以后，與HMGB1組相比，HMGB1+SB203580組的p53 mRNA和蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。

圖5 不同轉染組細胞p53 mRNA相對表達量

圖6 HMGB1對不同轉染組細胞增殖能力的影響

圖7 MAPK抑制劑對p53 mRNA相對表達量的影響

圖8 SB203580抑制p38 MAPK信號通路后HMGB1對p53蛋白表達水平的影響

3 討 論

HMGB1是一種高度保守的晚期炎性細胞因子，在多種細胞中廣泛表達，最初是作為一種核蛋白被發(fā)現(xiàn)，其分子質量為25 kD，隨后在細胞膜、細胞質中以及線粒體上也發(fā)現(xiàn)其表達，并能通過激活釋放到細胞外發(fā)揮它的功能效應[4]。核內HMGB1作為雙鏈DNA伴侶并結合核蛋白來穩(wěn)定核小體，修復DNA損傷，并特異性調節(jié)基因的轉錄。HMGB1通常都位于細胞核內，然而，經(jīng)過翻譯修改，如賴氨酸殘基乙?；?，可促進HMGB1的核質轉運釋放到細胞外[5]。胞外HMGB1可作為一種模式調節(jié)因子介導多種模式識別受體活性，并激活一些促炎信號通路。HMGB1通過激活Toll受體和RAGE受體后，結合在髓樣化分子上并激活p38 MAPK信號通路，隨后活化轉錄激活因子調節(jié)促炎因子的表達，包括腫瘤壞死因子（TNF）-α、白介素（IL）-1β和IL-6[6]。HMGB1的釋放與細胞應對氧化應激、細菌感染、細胞因子或組織反應損傷及被動壞死都有一定的調節(jié)作用[7]。

p53蛋白是一種潛在的、短暫的轉錄因子，它可在一個廣泛的細胞應激范圍內被激活[8]。激活后的p53可致細胞周期停滯，抑制腫瘤的生長。在DNA損傷和過氧化反應等報道中提出，p38 MAPK通過磷酸化p53蛋白氨基酸殘基，激活p53蛋白活性，抑制細胞活性[9]；且p53和p38 MAPK物理性結合形成p53-p38 MAPK復合物，直接被其磷酸化，p38 MAPK抑制劑則可減少p53和DNA的結合活力[10]。此外，p38 MAPK亦可通過調節(jié)野生型p53誘導的磷酸酶1（wild-type p53-induced phosphatase，Wip1）間接地激活p53蛋白[11]。

近年來資料提示，核內HMGB1能輔助p53與DNA的結合，增強p53的轉錄調節(jié)作用；胞內HMGB1和p53存在一定的動態(tài)平衡，有助于對細胞自噬和凋亡的調控。但胞外HMGB1和p53之間的作用關系并未見報道。

本實驗結果顯示，HMGB1對T細胞增殖具有抑制作用，并且呈時間和濃度依賴性，這與既往研究結果一致[12]。為進一步明確其作用機制，本實驗對p53的表達和活性進行了檢測。結果顯示，不同濃度HMGB1刺激細胞后均能不同程度地增加p53 mRNA和蛋白表達量。HMGB1濃度一定時，p53 mRNA、磷酸化水平及總蛋白蛋白表達量也隨著時間的延長而增加，證實胞外HMGB1可增強p53 mRNA表達和激活p53蛋白活性。

為明確p53介導了HMGB1對細胞增殖的抑制效應，我們利用慢病毒轉染對p53的表達進行了干擾。結果提示，不同轉染組在給予一定濃度HMGB1刺激細胞后，空載組細胞活性明顯下降，而p53 shRNA表達組細胞活性變化無明顯差異，說明p53在介導HMGB1對細胞增殖抑制中發(fā)揮了重要作用。反之，p53過表達后細胞活性降低會更為明顯。

據(jù)報道，胞內HMGB1對p38 MAPK活化作用已明確，同時也有文獻提示p38 MAPK可影響p53的活化，因此我們利用抑制劑阻斷p38 MAPK通路活性后，檢測HMGB1對p53活化的影響[12-13]。結果證實，HMGB1刺激組的p53 mRNA和蛋白表達水平明顯高于正常組，但HMGB1和SB203580共同作用后p53 mRNA和蛋白表達水平較HMGB1組顯著下降。提示HMGB1通過激活p38 MAPK信號通路間接調節(jié)p53 mRNA和蛋白表達水平，上述結果為闡明HMGB1影響T細胞功能的分子機制提供了依據(jù)，并進一步完善了HMGB1和p53間的相互作用機制。因此，該研究為深入了解細胞免疫功能的調節(jié)及感染性疾病的病理機制提供了理論基礎。

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High mobility group B1 inhibits T cell proliferation by regulating the expression of p53 protein

Jia Min*△, Zhang Hui, Tong Yalin, Yao Yongming.
* College of Life Science of Guangxi Normal University, Guilin 541002, Guangxi, China;△Centre for Burn and Plastic Surgery, 181st Hospital of PLA, Guilin 541002, Guangxi ,China

Tong Yalin ( E-mail: 181tyl@sina.com ) Yao Yongming ( E-mail: c_ff@sina.com )

Objective:To investigate the inhibitory effect of high mobility group box-1 protein (HMGB1) on T cell proliferation and the regulation mechanisms thereof. Methods: Cultured Jurkat cells were divided into 4 groups: control group, HMGB1 treatment (100 ng/ml) for 12, 24 and 48 hours groups. Cells were also divided into control group, 10, 100 and 1 000 ng/ml HMGB1 treated groups, and then stimulated for 24 hours. Proliferation rates of cells were measured using cell counting kit (CCK-8). The expression levels of p53 mRNA, phosphorylated p53 and p53 protein were determined by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot respectively. Jurkat cells were transfected with lentivirus containing p53 shRNA, p53 mRNA sequence expressing plasmids or control vector. The cells were afterwards stimulated with HMGB1 (100 ng/ml) for 24 hours, and subjected to cell proliferation assay with the same methods mentioned above. In addition, Jurkat cells were divided into 3 groups: control group, HMGB1 group and HMGB1+SB203580 group, and stimulated with indicated reagents for 24 hours. The expression levels of p53 mRNA, phosphorylated p53 and p53 protein were detected by RT-PCR and Western blot. Results: Compared to the control group, the proliferation rates of cells were decreased after HMGB1 (100 ng/ml) stimulation for 24 and 48 hours (P＜0.05). In dose-dependent stimulations, proliferationrates were reduced in treatment with 100 or 1 000 ng/ml HMGB1 groups (P＜0.05). The expression levels of p53 mRNA, phosphorylated p53 and p53 protein increased in cells after stimulation with 100 ng/ml HMGB1 for 24 and 48 hours (P＜0.05). The expression levels increased obviously in 10 and 100 ng/ml HMGB1 treated cells 24 hours later, but the level was not changed significantly in HMGB1 1 000 ng/ml group. After transfection, the proliferation rates of vector-expressing cells decreased obviously after HMGB1 stimulation. The proliferation of p53 shRNA-expressing cells was basically normal, while of p53 mRNA over expression cells showed lower proliferation rate comparing to vector group (P＜0.05). Treatment with p38 MAPK inhibitor (SB203580) and HMGB1 markedly down-regulated the expression levels of p53 mRNA, phosphorylated and total p53 protein (P＜0.05). Conclusion: Extracellular HMGB1 may inhibit the proliferation of T cells by activation of p53 through p38 MAPK pathway.

High mobility group box-1 protein; p53; p38 mitogen activated protein kinases; T cells proliferation

2016-09-01）

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 03. 005

國家自然科學基金資助項目(81372054，81501698，81130035)；國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目(2012CB518102)；廣西科學研究與技術開發(fā)計劃項目(1140003A-39)

童亞林，主任醫(yī)師（E-mail: 181tyl@sina.com）姚詠明，研究員（E-mail: c_ff@sina.com）