一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定山楂葉中6種有效成分的含量Δ

楊明宇，高　婧，杜義龍，李艷榮，趙勝男，潘海峰#（.承德醫(yī)學(xué)院河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北承德　067000；.承德市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北承德　067000）

一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定山楂葉中6種有效成分的含量Δ

楊明宇1＊，高婧2，杜義龍1，李艷榮1，趙勝男1，潘海峰1#（1.承德醫(yī)學(xué)院河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北承德067000；2.承德市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北承德067000）

目的：建立同時(shí)測(cè)定山楂葉中綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，以牡荊素葡萄糖苷為基準(zhǔn)峰，分別計(jì)算其與綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷的相對(duì)校正因子（RCF），通過RCF計(jì)算山楂葉中上述5種成分的含量。色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18，流動(dòng)相為0.1%甲酸-乙腈-四氫呋喃（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μl。結(jié)果：綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為12.50～400.0μg（r=0.999 8）、25.00～800.0μg（r=0.999 9）、31.25～1 000.0 μg（r=0.999 9）、6.470～260.0μg（r=0.999 9）、2.50～80.0μg（r=0.999 8）、9.375～300.0μg（r=0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為99.2%～103.9%（RSD=1.6%）、97.9%～100.8%（RSD=1.2%）、99.2%～100.8%（RSD= 0.5%）、97.3%～101.3%（RSD=1.5%）、98.0%～103.0%（RSD=1.9%）、95.5%～101.5%（RSD=2.2%），n均為6。牡荊素葡萄糖苷與綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷間的RCF分別為1.119、1.009、0.706、1.063、0.830。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于6種有效成分含量的同時(shí)測(cè)定。

山楂葉；一測(cè)多評(píng)法；相對(duì)校正因子；質(zhì)量控制

山楂葉為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge/Var.major N.E.Br.或山楂C.pinnatifida Bge.的干燥葉，夏、秋二季采收，具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂的功效，用于氣滯血瘀、胸痹心痛、胸悶憋氣、心悸健忘、眩暈耳鳴等證的治療［1］。其主要含有黃酮類和有機(jī)酸類成分［2-4］，不同樣品間各成分含量相差較大［5］，含量上的差異難免會(huì)影響臨床療效。目前，已有使用多種成分的同步測(cè)定來控制山楂葉質(zhì)量的文獻(xiàn)報(bào)道［6-9］，但需要對(duì)照品的種類和數(shù)量均較大，由于部分對(duì)照品不易獲得或價(jià)格較貴原因，一些進(jìn)行多組分質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)難以執(zhí)行。近年來，有關(guān)一測(cè)多評(píng)法（QAMS）的研究報(bào)道逐漸增多，已從藥材擴(kuò)展到了中藥制劑，且大多數(shù)都是針對(duì)同類成分的含量測(cè)定，主要包括皂苷類、醌類、黃酮類、有機(jī)酸類等［10-13］，但QAMS法對(duì)山楂葉有效成分測(cè)定尚未見報(bào)道。因此，筆者采用QAMS法對(duì)山楂葉中6種成分進(jìn)行含量測(cè)定，既實(shí)現(xiàn)了多成分定量，又降低了實(shí)際生產(chǎn)和市場(chǎng)監(jiān)督過程中的檢測(cè)成本。

1　材料

1.1儀器

1200 Series型高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1322A在線脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1329A、自動(dòng)進(jìn)樣器G1316A柱溫箱、G1315D二極管陣列檢測(cè)器、Agilent Chemstation色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）；KQ-700型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；AG-245型十萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2試劑

綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)分別為110753-200413、111668-200602、111687-200602、100080-200707、111521-201004，純度均＞99%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；牡荊素葡萄糖苷對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：A0513，純度＞99%）；乙腈、甲醇、四氫呋喃為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3藥材

山楂葉藥材（見表1）由承德民族師范學(xué)院董建新教授鑒定為薔薇科山楂屬植物山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥葉。

表1　山楂葉來源Tab 1　Origin of C.pinnatifida

2　方法與結(jié)果

2.1原理

在一定范圍內(nèi)成分的量（質(zhì)量或濃度）與儀器響應(yīng)值成正比，即：f=W/A（W表示成分的量，A表示儀器響應(yīng)值）。在山楂葉的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，以牡荊素葡萄糖苷（s）為內(nèi)標(biāo)，建立牡荊素葡萄糖苷（s）與綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷之間的相對(duì)校正因子：

式中，fsx代表內(nèi)參物與待測(cè)組分之間的相對(duì)校正因子（RCF）；Cs、Cx分別代表內(nèi)參物與待測(cè)物的濃度；As、Ax分別代表內(nèi)參物與待測(cè)物的儀器響應(yīng)值。

通過RCF計(jì)算綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金桃苷的量，同時(shí)采用外標(biāo)法（ESM）計(jì)算上述成分的量：

式中，AE代表待測(cè)物的儀器響應(yīng)值；a、b分別代表本公式的斜率和截距；CE代表外標(biāo)法計(jì)算所得待測(cè)物質(zhì)的濃度進(jìn)行同步測(cè)定，以驗(yàn)證計(jì)算值的準(zhǔn)確性和可行性。

2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B）-四氫呋喃（C），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 ml/min；波長(zhǎng)：350 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷峰計(jì)均不低于5 000，分離度均≥1.5，表明系統(tǒng)適用性良好，詳見圖1。

表2　梯度洗脫程序Tab 2　Gradient elution program

圖1　高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；1.綠原酸；2.牡荊素葡萄糖苷；3.牡荊素鼠李糖苷；4.牡荊素；5.蘆??；6.金絲桃苷Fig 1　HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；1.chlorogenic acid；2.vitexin glucoside；3.vitexin rhamnoside；4.vitexin；5.rutin；6.hyperoside

2.3溶液的制備

2.3.1混合對(duì)照品溶液精密稱取蘆丁對(duì)照品10.0 mg，置于10 ml量瓶中，加70%甲醇溶解并定容，作為蘆丁對(duì)照品貯備液；精密稱取綠原酸對(duì)照品20.0 mg、牡荊素對(duì)照品15.0 mg、金絲桃苷對(duì)照品15.0 mg、牡荊素葡萄糖苷對(duì)照品40 mg、牡荊素鼠李糖苷對(duì)照品50 mg，置于同一50 ml量瓶中，加70%甲醇溶解，再加上述蘆丁對(duì)照品貯備液4 ml，加70%甲醇定容，制成綠原酸、牡荊素、金絲桃苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、蘆丁質(zhì)量濃度分別為0.40、0.30、0.30、0.80、1.00、0.08 mg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.3.2供試品溶液取樣品0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇25 ml，精密稱定質(zhì)量，超聲（功率：700 W，頻率：40 kHz）提取30 min，放冷，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，上清液以微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，既得。

2.4線性關(guān)系考察

分別量取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按倍比稀釋法制成系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各10 μl，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表3。

2.5精密度試驗(yàn)

取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷峰面積的RSD分別為1.8%、0.9%、1.4%、0.7%、1.8%、0.9%（n=6），表明儀器精密度良好。

表3　回歸方程與線性范圍Tab 3　Regression equations and linear ranges

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液（No.2）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、24、48 h時(shí)按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷峰面積的RSD分別為1.5%、1.1%、1.3%、0.8%、1.2%、1.9%（n=6），表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（No.2）適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷含量平均值分別為0.123 5%、0.235 2%、1.053%、0.064 5%、0.104 7%、0.235 3%，RSD分別為1.5%、0.8%、0.6%、1.6%、1.9%、1.1%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（No.2）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量并計(jì)算加樣回收率，詳見表4。

2.9RCF的計(jì)算

以牡荊素葡萄糖苷為內(nèi)參物，按“2.1”項(xiàng)下公式（1）計(jì)算，結(jié)合“2.4”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液所得峰面積數(shù)據(jù)，計(jì)算牡荊素葡萄糖苷對(duì)綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷的RCF值。結(jié)果，綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷的RCF值分別為1.119、1.009、0.706、1.063、0.830。

2.10RCF耐用性考察

2.10.1色譜柱和HPLC儀考察試驗(yàn)考察了不同HPLC系統(tǒng)（Agilent 1100、Agilent 1200和Agilent 1260）和不同色譜柱［Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μ m）、Agilent ZORBAX TC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）］對(duì)RCF的影響，詳見表5。2.10.2實(shí)驗(yàn)室考察在不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)建立的一測(cè)多評(píng)法進(jìn)行復(fù)核實(shí)驗(yàn)，Lab1為承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所分析實(shí)驗(yàn)室（本實(shí)驗(yàn)室），Lab2為承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所植化實(shí)驗(yàn)室，Lab3為承德頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司技術(shù)開發(fā)中心，同為Agilent 1200色譜系統(tǒng)及Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱（見表6），說明了RCF在不同實(shí)驗(yàn)室具有良好的可行性。

表4　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 4　Results of recovery test（n=6）

表5　不同儀器和色譜柱RCF考察結(jié)果（n=6）Tab 5　Results of RCF investigated by different instruments and chromatographic columns（n=6）

2.11待測(cè)成分色譜峰的定位

利用色譜峰相對(duì)保留值（其他成分保留時(shí)間與內(nèi)參物保留時(shí)間比值）定位：由色譜峰相對(duì)保留值和內(nèi)參物的保留時(shí)間計(jì)算出目標(biāo)峰相對(duì)保留時(shí)間，再根據(jù)峰形及光譜吸收變化趨勢(shì)，即能夠在一定程度上準(zhǔn)確判斷目標(biāo)峰的位置，結(jié)果，綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為2.9%、1.7%、3.2%、3.4%、2.7%，表明利用相對(duì)保留值進(jìn)行色譜峰的定位是可行的。

表6　不同實(shí)驗(yàn)室RCF考察結(jié)果（n=6）Tab 6　Results of RCF investigated by different laboratories （n=6）

2.12樣品含量測(cè)定結(jié)果

取樣品各適量，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，詳見表7。

表7　樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3，%）Tab 7Results of contents determination of samples（n=3，%）

3　討論

QAMS法建立的成功與否與多種因素有關(guān)，包括外部因素和內(nèi)部因素。外部因素如環(huán)境、儀器、色譜柱、實(shí)驗(yàn)人員等；內(nèi)部因素主要有待測(cè)成分含量、內(nèi)參物含量、對(duì)照品濃度、RCF、色譜條件等。其中，待測(cè)成分含量過低是一測(cè)多評(píng)法應(yīng)用中引入誤差的主要原因。

建立的QAMS法準(zhǔn)確與否用相對(duì)誤差RE=（CECQAMS）/CE×100%來進(jìn)行評(píng)價(jià)［14］（RE＜5%為考量尺度），本試驗(yàn)結(jié)合“2.1”項(xiàng)下公式（1）（2）導(dǎo)出RE與待測(cè)成分濃度倒數(shù)成以下關(guān)系：

式中，Cs/As是一個(gè)定值，可由內(nèi)參物的回歸方程計(jì)算得出；a、b分別為待測(cè)組分的回歸方程中的斜率和截距；fsx代表本試驗(yàn)中的RCF。

根據(jù)公式（3），當(dāng)牡荊素鼠李糖苷質(zhì)量濃度Cb≥0.35 mg/ml、牡荊素質(zhì)量濃度Cc≥1.88μg/ml、金絲桃苷質(zhì)量濃度Ce≥2.2μg/ml時(shí)，采用上述建立的RCF法進(jìn)行含量測(cè)定，RE均＜5%，符合考量尺度。

綠原酸和蘆丁不能用公式（3）計(jì)算得出濃度限量，通過分析，可能是回歸方程中的斜率過小的原因［15］，因此斜率過小可能是影響QAMS的又一因素，應(yīng)如何解決有待進(jìn)一步考察。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于山楂葉中綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷含量的同時(shí)測(cè)定。

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（編輯：張靜）

Simultaneous Determination of Six Effective Components in Crataegus pinnatifida by Quantitative Analysis of Multi-components by Single Marker

YANG Mingyu1，GAO Jing2，DU Yilong1，LI Yanrong1，ZHAO Shengnan1，PAN Haifeng1（1.Key Laboratory of Study and Development of Traditional Chinese Medicine in Hebei Province，Chengde Medical University，Hebei Chengde 067000，China；2.Chengde Center for Food and Drug Control，Hebei Chengde 067000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of chlorogenic acid，vitexin glucoside，vitexin rhamnoside，vitexin，rutin and hyperoside in Crataegus pinnatifida.METHODS：With reference peak of vitexin glucoside，HPLC was conducted to calculate the relative correction factor（RCF）of chlorogenic acid，vitexin glucoside，vitexin rhamnoside，vitexin，rutin and hyperoside，then the contents of above-mentioned 5 components in C.pinnatifida were calculated.The column was Agilent ZORBAX SB C18with mobile phase of 0.1%formic acid-acetonitrile-tetrahydrofuran（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 350 nm，column temperature was 30℃，and the injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 12.50-400.0μg for chlorogenic acid（r=0.999 8），25.00-800.0μg for vitexin glucoside（r=0.999 9），31.25-1 000.0μg for vitexin rhamnoside（r=0.999 9），6.470-260.0μg for vitexin（r=0.999 9），2.50-80.0μg for rutin（r=0.999 8）and 9.375-300.0μg for hyperoside（r=0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 99.2%-103.9%（RSD=1.6%，n=6），97.9%-100.8%（RSD=1.2%，n=6），99.2%-100.8%（RSD=0.5%，n=6），97.3%-101.3%（RSD=1.5%，n=6），98.0%-103.0%（RSD=1.9%，n=6）and 95.5%-101.5%（RSD=2.2%，n=6）.RCFs of vitexin glucoside with chlorogenic acid，vitexin rhamnoside，vitexin，rutin and hyperoside were 1.119，1.009，0.706，1.063 and 0.830，respectively.CONCLUSIONS：The method is simple with good precision，stability and reproducibility，and it can be sued for the simultaneous determination of 6 components in C.pinnatifida.

Crataegus pinnatifida；Quantitative analysis of multi-components by single marker；Relative correction factor；Quality control

R284.1；R927文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1001-0408（2016）24-3404-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.28

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（No.ZD2015097）；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（No.冀教科〔2015〕7號(hào)）

＊博士研究生。研究方向：中藥分析。E-mail：18518093839@163/com

教授，碩士。研究方向：中藥分析。電話：0314-2291186。E-mail：phf2301@163.com

2015-12-05

2016-03-17）