氨基酸對(duì)出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋(píng)果酸的影響

殷海松，范栩嘉，湯衛(wèi)華，邊艷慧，陳 珊，喬長(zhǎng)晟，*（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津0050；.天津輕工業(yè)化學(xué)研究所有限公司，天津0050；.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津00457）

氨基酸對(duì)出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋(píng)果酸的影響

殷海松1，2，范栩嘉3，湯衛(wèi)華2，邊艷慧3，陳 珊2，喬長(zhǎng)晟3，*
（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津300350；2.天津輕工業(yè)化學(xué)研究所有限公司，天津300350；3.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

本文研究了添加氨基酸對(duì)出芽短梗霉A.pullulans CGMCC3337發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋(píng)果酸（PMLA）的影響。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)分別對(duì)氨基酸種類(lèi)及其添加量進(jìn)行優(yōu)化。由單因素實(shí)驗(yàn)可知：天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Leu）、纈氨酸（Val）和蘇氨酸（Thr）對(duì)菌體生長(zhǎng)和PMLA合成最有利。由正交實(shí)驗(yàn)可知：氨基酸的最優(yōu)組合為（g/L）：天冬氨酸（Asp）0.4、亮氨酸（Leu）0.4、纈氨酸（Val）0.4、蘇氨酸（Thr）0.4。在最優(yōu)組合條件下獲得的PMLA產(chǎn)量和分子量分別達(dá)到了57.89 g/L和8879 u，比未添加氨基酸獲得的PMLA產(chǎn)量和分子量分別提高了40.92%和45.20%。

出芽短梗霉，聚蘋(píng)果酸，氨基酸

聚蘋(píng)果酸（PMLA）是一種水溶性脂肪族聚酯類(lèi)化合物［1-2］，由于主鏈上含有酯鍵而被稱(chēng)為聚酯類(lèi)化合物，在有水的環(huán)境中可以自發(fā)降解或者發(fā)生酶促反應(yīng)而被降解。聚蘋(píng)果酸及其衍生物由于具有生物降解性、高度水溶性、生物相容性、可吸收性、可化學(xué)衍生性及無(wú)免疫原性［3］等優(yōu)良特性，可以用作藥物載體［4］及微膠囊材料、生物醫(yī)學(xué)材料等。PMLA的制備方法主要有化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法2種?；瘜W(xué)法合成聚蘋(píng)果酸分子量較小；生物發(fā)酵法合成聚蘋(píng)果酸優(yōu)點(diǎn)突出，產(chǎn)物均為β型而且分子量高、產(chǎn)物純度高［5-6］。

生物合成聚蘋(píng)果酸（PMLA）的研究最早始于20世紀(jì)60年代，Shimada等［7］從環(huán)狀青霉（Penicillium cyclopium）中分離得到一種能夠抑制該菌的蛋白酶活性的高分子聚合物，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該聚合物為PMLA。后來(lái)報(bào)道產(chǎn)PMLA的菌種主要有出芽短梗霉［8-9］、環(huán)狀青霉［7］和黏菌［10］等。在生物發(fā)酵制備聚蘋(píng)果酸的菌種

中，由于出芽短梗霉的形態(tài)比較穩(wěn)定，合成聚蘋(píng)果酸的能力相對(duì)較強(qiáng)［11-12］，因此研究比較多的是出芽短梗霉。出芽短梗霉又名“茁霉”、“芽生側(cè)茁霉”，分類(lèi)屬于半知菌綱，是一種具有酵母型和菌絲形態(tài)的多形真菌［13-15］。目前國(guó)外對(duì)生物合成聚蘋(píng)果酸的研究較多，以生產(chǎn)菌種的研究為主。國(guó)內(nèi)對(duì)PMLA的研究較少，主要是一些優(yōu)良菌株的選育［16］和發(fā)酵條件的優(yōu)化［6］等，也有少量專(zhuān)利［17-18］是通過(guò)添加維生素和表面活性劑等來(lái)提高出芽短梗霉合成PMLA的效率。目前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有關(guān)于氨基酸對(duì)PMLA產(chǎn)量，尤其是分子量的影響研究。目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)PMLA產(chǎn)量不高，成本巨大是困擾發(fā)酵法制備PMLA的主要問(wèn)題。

本文旨在研究添加不同氨基酸對(duì)出芽短梗霉PMLA產(chǎn)量和分子量的影響，并通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提高PMLA產(chǎn)量和分子量的氨基酸組合進(jìn)行優(yōu)化，為以后聚蘋(píng)果酸的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

出芽短梗霉（A.pullulans CGMCC3337） 源于天津北洋百川生物技術(shù)有限公司；斜面培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基（g/L） 蔗糖60，酵母膏3，丁二酸2，硫酸銨1，K2CO30.4，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.005，玉米漿0.1%（V/V），CaCO320（單獨(dú)滅菌）；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 蔗糖100，蛋白35，KH2PO40.1，NaNO32，MgSO4·7H2O 0.3，KCl 0.5，MnSO40.05，CaCO320（單獨(dú)滅菌）；氨基酸類(lèi)：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、蛋氨酸（Met）、甘氨酸（Gly）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、賴(lài)氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）及組氨酸（His） 均為分析純，源于美國(guó)Biotopped進(jìn)口分裝；蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)品 分析純，購(gòu)于百靈威科技有限公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

UVmini-1240紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公；SKY-2102搖床 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；YJ-875S醫(yī)用超凈臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠；SPK-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LD5-10高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心廠；Agilent1100高效液相色譜分析儀 美國(guó)Agilent；Prevail C18色譜柱（4.6 mm×150 mm）、凝膠色譜柱（8.0 mm×300 mm）

百靈威科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 斜面培養(yǎng) 將保存于4℃的斜面菌種取出用接種針轉(zhuǎn)接到新鮮的斜面上，并置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4～5 d。

1.2.1.2 種子培養(yǎng) 取出培養(yǎng)好的新鮮斜面菌種，在無(wú)菌操作條件下，用10 mL無(wú)菌生理鹽水將培養(yǎng)基表面的孢子洗下，置于預(yù)先加好玻璃珠的無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)搖勻，制成孢子懸液。將該孢子懸液按照10%（V/V）的接種量，即取5 mL接種到裝有45 mL種子培養(yǎng)基并滅好菌的500 mL擋板瓶中，用八層紗布封好瓶口，置于25℃恒溫?fù)u床上，轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)40 h。

1.2.1.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子液于無(wú)菌條件下混合均勻，按照10%（V/V）的接種量，將種子液接種到裝有45 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基并滅好菌的500 mL擋板瓶中，用八層紗布封好瓶口，置于25℃恒溫?fù)u床，在200 r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)6 d。

1.2.2 氨基酸添加量對(duì)PMLA產(chǎn)量的影響 向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、蛋氨酸（Met）、甘氨酸（Gly）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、賴(lài)氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）及組氨酸（His）。添加量分別為0.1～0.6 g/L，按搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法培養(yǎng)，設(shè)置兩組空白對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行，每組數(shù)據(jù)重復(fù)三次，下同。

1.2.3 氨基酸對(duì)A.pullulans CGMCC3337菌體量的影響 向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別按1.2.2確定的最佳添加量添加各氨基酸，按照搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)添加氨基酸發(fā)酵后A.pullulans CGMCC3337菌體量，設(shè)置兩組空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，每組氨基酸分別做三個(gè)平行。

1.2.4 氨基酸對(duì)A.pullulans CGMCC3337合成PMLA產(chǎn)量的影響 向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別按1.2.2確定的最佳添加量添加各氨基酸，按照搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)添加氨基酸發(fā)酵后PMLA的產(chǎn)量，設(shè)置兩組空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，每組氨基酸分別做三個(gè)平行。

1.2.5 氨基酸對(duì)A.pullulans CGMCC3337合成PMLA分子量的影響 向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別按1.2.2確定的最佳添加量添加各氨基酸，按搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)添加氨基酸發(fā)酵后PMLA的分子量，設(shè)置兩組空白對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行。

1.2.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L18（37）正交表，選擇Asp（A）、Leu（B）、Val（C）及Thr （D）為優(yōu)選因素，以PMLA產(chǎn)量和分子量為考核指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素及水平Table1 Levels of factors used in the orthogonal experimental design

1.2.7 檢測(cè)方法

1.2.7.1 菌體量測(cè)定 取10 mL發(fā)酵液于50 mL離心管中，5000 r/min離心15 min。倒掉上清，在菌體沉淀中滴加3 mol/L的稀鹽酸溶液，中和發(fā)酵液中剩余的碳酸鈣，直到不再有氣泡產(chǎn)生為止，5000 r/min離心15 min，倒掉上清。用10 mL生理鹽水重懸菌體，

5000 r/min離心15 min，倒掉上清，將離心管置于80℃烘箱中烘干至恒重，稱(chēng)量菌體干重（g/L）。

1.2.7.2 發(fā)酵液中PMLA的測(cè)定 取10 mL發(fā)酵液于15000 r/min離心10 min除去菌體，用移液管取5 mL上清液，加入等體積的1 mol/L H2SO4溶液，于90℃條件下水解12 h，將聚蘋(píng)果酸完全水解為單體蘋(píng)果酸。高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)水解前后的蘋(píng)果酸的含量，結(jié)合蘋(píng)果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線可得出樣品中蘋(píng)果酸的含量，兩者之差即為聚蘋(píng)果酸的產(chǎn)量［19］。

其中HPLC的檢測(cè)條件如下：色譜柱：Prevail C18色譜柱（4.6 mm×150 mm）；柱溫：25℃；流動(dòng)相：25 mmol/L KH2PO4溶液/乙睛=95/5（V/V）（用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

蘋(píng)果酸標(biāo)曲的制作：選取濃度在1～10 g/L的蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)品，采用同樣的條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)，然后以蘋(píng)果酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

1.2.7.3 發(fā)酵液中PMLA分子量的測(cè)定 取10 mL發(fā)酵液于15000 r/min離心10 min除去菌體，取5 mL上清液用流動(dòng)相0.05 mol/L Na2SO4溶液稀釋20倍，GPC檢測(cè)PMLA分子量。

GPC測(cè)定發(fā)酵液中PMLA的分子量，采用凝膠滲透色譜法進(jìn)行分子量的測(cè)定，首先使用分子量能夠覆蓋聚蘋(píng)果酸分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，再結(jié)合使用高效液相色譜儀和凝膠色譜柱測(cè)定發(fā)酵液中PMLA的分子量。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算即可得出PMLA的分子量。其中GPC檢測(cè)PMLA分子量條件如下：色譜柱：凝膠色譜柱（8.0 mm×300 mm）；柱溫：25℃；參比池溫度：30℃；流動(dòng)相：0.05 mol/L Na2SO4溶液，pH自然；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)共設(shè)3個(gè)平行，正交實(shí)驗(yàn)部分采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，圖表生成采用Origin 7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基酸添加量對(duì)PMLA產(chǎn)量的影響

按照1.2.2的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加氨基酸發(fā)酵后聚蘋(píng)果酸的產(chǎn)量，結(jié)果如表2所示。由表2可知，隨著氨基酸添加量的增加，PMLA的產(chǎn)量先增加后減小。這是由于氨基酸能夠促進(jìn)聚蘋(píng)果酸的合成，參與其合成途徑，當(dāng)氨基酸量達(dá)到一定時(shí)，會(huì)起到抑制作用和反饋調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致聚蘋(píng)果酸的合成量降低。表3為由表2數(shù)據(jù)得到的各種氨基酸的最佳添加量。

2.2 氨基酸對(duì)A.pullulans CGMCC3337菌體量的影響

按照1.2.3的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)添加氨基酸發(fā)酵后A.pullulans CGMCC3337菌體量的變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，菌體量均勻分布在30～35 g/L之間，其中谷氨酸（Glu）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）、丙氨酸（Ala）和精氨酸（Arg）和空白對(duì)照相比分別增加了2.95%、3.55%、1.18%、3.55%、2.96%、1.16%、2.96%、1.48%、4.14%、3.25%、3.54%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氨基酸對(duì)出芽短梗霉（A.pullulans CGMCC3337）菌體量影響不明顯，因此要繼續(xù)考察基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)

基中添加氨基酸對(duì)PMLA產(chǎn)量及分子量的影響。

表2 氨基酸以及添加量對(duì)PMLA產(chǎn)量的影響Table2 Effect of the types and adding amount of the amino acids on PMLA production

表3 氨基酸添加量Table3 The table of amino acid content

圖1 不同氨基酸對(duì)菌體量的影響Fig.1 Effect of different amino acid on biomass

2.3 氨基酸對(duì)A.pullulans CGMCC3337合成PMLA產(chǎn)量的影響

按照1.2.4的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)添加氨基酸發(fā)酵后PMLA的產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同氨基酸對(duì)PMLA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different amino acid on PMLA

由圖2可知，培養(yǎng)基中分別添加天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、纈氨酸（Val）、蘇氨酸（Thr）、組氨酸（His）、亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）和甘氨酸（Gly），與空白對(duì)照組41.21 g/L的產(chǎn)量相比分別提高了17.69%、12.42%、14.68%、14.54%、16.98%、 14.78%、12.86%、11.91%和12.86%。天冬氨酸對(duì)產(chǎn)物的合成影響最明顯，可能是因?yàn)樘於彼嵬ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)氨作用形成草酰乙酸，草酰乙酸再還原為蘋(píng)果酸最終合成PMLA。培養(yǎng)基中添加賴(lài)氨酸（Lys）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）時(shí)，對(duì)PMLA合成幾乎沒(méi)有影響。而添加異亮氨酸（Ile）、蛋氨酸（Met）、色氨酸（Trp）、脯氨酸（Pro）及苯丙氨酸（Phe）對(duì)PMLA合成有抑制作用。

2.4 氨基酸對(duì)A.pullulans CGMCC3337合成PMLA分子量的影響

圖3 不同氨基酸對(duì)聚蘋(píng)果酸分子量的影響Fig.3 Effect of different amino acid on molecular weight

表4 正交實(shí)驗(yàn)表及結(jié)果Table4 Orthogonal analysis test

按照1.2.5的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)添加氨基

酸發(fā)酵后PMLA的分子量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，培養(yǎng)基中分別添加天冬氨酸（Asp）、賴(lài)氨酸（Lys）、異亮氨酸（Ile）、纈氨酸（Val）、色氨酸（Trp）、脯氨酸（Pro）、蘇氨酸（Thr）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）和亮氨酸（Leu），與空白對(duì)照組PMLA分子量6221.5 u相比分別提高了16.29%、16.19%、11.23%、16.67%、18.45%、13.85%、18.76%、19.00%、14.14%和19.58%。亮氨酸對(duì)PMLA分子量影響最明顯，可能是因?yàn)榱涟彼釋?duì)蘋(píng)果酸聚合過(guò)程中某種酶有刺激作用。培養(yǎng)基中添加谷氨酸（Glu）、蛋氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）、精氨酸（Arg）及甘氨酸（Gly）對(duì)PMLA分子量的影響比較微弱，而添加絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）及丙氨酸（Ala）時(shí)，則出現(xiàn)了PMLA分子量較小的現(xiàn)象。由于分子量是評(píng)價(jià)作為藥物載體性能的重要指標(biāo)，能夠用作藥物載體的聚合物分子量范圍是1.5～200 ku，在該范圍內(nèi)，適當(dāng)提高聚蘋(píng)果酸分子量，可以提高其載藥量。因此，需要合成聚蘋(píng)果酸分子量不能過(guò)小。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化氨基酸添加量

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，聚蘋(píng)果酸產(chǎn)量及分子量方差分析結(jié)果分別見(jiàn)表5和表6。

表5 聚蘋(píng)果酸產(chǎn)量方差分析表Table5 The anova table of yield of PMLA

表6 聚蘋(píng)果酸分子量方差分析表Table6 The anova table of molecular weight of PMLA

由表4～表6可以看出，氨基酸對(duì)PMLA產(chǎn)量和PMLA分子量的影響大小順序分別為A＞B＞D＞C和A＞D＞B＞C，其中A因素對(duì)PMLA產(chǎn)量和分子量均有顯著影響，B因素對(duì)PMLA產(chǎn)量有一定影響，D因素對(duì)PMLA分子量有一定影響。以PMLA產(chǎn)量和PMLA分子量為參考指標(biāo)，確定添加氨基酸最優(yōu)組合分別為A1B1C3D1和A1B1C2D1。由于C因素對(duì)PMLA產(chǎn)量和PMLA分子量的影響均最小，從節(jié)約成本考慮選擇C因素最小添加量，因此確定添加氨基酸最優(yōu)組合為A1B1C1D1，即：天冬氨酸（Asp）0.4 g/L、亮氨酸（Leu）0.4 g/L、纈氨酸（Val）0.4 g/L、蘇氨酸（Thr）0.4 g/L，在此培養(yǎng)基條件下PMLA產(chǎn)量為58.42 g/L，PMLA分子量為8932 u。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按最優(yōu)組合方案中的氨基酸添加條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，得到PMLA產(chǎn)量為57.89 g/L，PMLA分子量為8879 u，與預(yù)測(cè)值中PMLA產(chǎn)量58.42 g/L及PMLA分子量8932 u非常接近，產(chǎn)量和分子量與預(yù)測(cè)值分別相差0.9%和0.6%，較未添加氨基酸發(fā)酵所得PMLA產(chǎn)量和PMLA分子量分別提高了40.92%和45.20%。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定天冬氨酸、亮氨酸、纈氨酸以及蘇氨酸對(duì)菌體生長(zhǎng)及PMLA合成最有利。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的添加氨基酸最優(yōu)組合為（g/L）：天冬氨酸（Asp）0.4、亮氨酸（Leu）0.4、纈氨酸（Val）0.4、蘇氨酸（Thr）0.4。在最優(yōu)組合條件下獲得的PMLA產(chǎn)量和分子量分別達(dá)到了57.89 g/L和8879 u，比未添加氨基酸發(fā)酵所得PMLA產(chǎn)量和PMLA分子量分別提高了40.92%和45.20%。

本論文首次就氨基酸對(duì)聚蘋(píng)果酸產(chǎn)量、尤其對(duì)PMLA分子量的影響進(jìn)行研究。添加氨基酸提高聚蘋(píng)果酸產(chǎn)量，有利于促進(jìn)PMLA進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，為進(jìn)一步解決困擾發(fā)酵制備PMLA產(chǎn)量不高、成本大的主要問(wèn)題有著重要意義。提高PMLA的分子量，為其能更好的應(yīng)用于醫(yī)藥載體方面起到了推動(dòng)性作用。本論文在搖瓶發(fā)酵研究的基礎(chǔ)上，會(huì)進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵罐的擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)，并對(duì)氨基酸對(duì)聚蘋(píng)果酸合成以及分子量影響的機(jī)理進(jìn)行更深層次的研究。

［1］Shimada K，Matsushima K，F(xiàn)ukumoto J.Poly-L-malic acid a newprotease inhibitor from Penicillium cyclopium［J］.Biochem Biophys Res Commun，1969，35（5）：619-624.

［2］Fernandez CE，Mancera M，Holler E.High molecular weight methyl ester of microbial poly（β，L-malic acid）Synthesisand crystallization［J］.Polymer，2006，47（19）：6501-6508.

［3］Lee BS，Vert M，Holler E.Water-soluble aliphatic polyesters Poly（malic acid）［J］.Biopolymers，2009，12（l3）：75-103.

［4］Phillppe Guerin，Michel Vert，Christian Braund，et al.Drug carriers：Optically Active Poly（β-malic acid）［J］.Polymer Bulletin，1985，14（2）：187-192.

［5］Kajiyama T，Taguchi T，Kobayashi H，et al.Synthesis of high molecular weight poly（α，β-malic acid）for biomedical use by direct polycondensation［J］.Polymer Degradation Stability，2003，81：525-530.

［6］王麗燕，鄭誼豐，劉婷婷，等.聚蘋(píng)果酸的發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］.生物加工過(guò)程，2010，8（2）：41-45.

［7］Shimada K，Matsushima K，F(xiàn)ukumoto J.Poly-L-malic acid a new protease inhibitor from Penicillium cyclopium［J］.Biochem Biophys Res Commun，1969，35（5）：619-624.

［8］Liu S J，Steinbuchel A.Production of poly（malic acid）from different carbon sources and its regulation in Aureobasidiumpullulans［J］.Biotechnol Lett，1997，19（1）：11-14.

［9］劉雙江.出芽短梗霉菌株CBS591.75和DSM2404發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋(píng)果酸的研究［J］.生物工程學(xué)報(bào)，1997，13（3）：279-283.［10］靳挺，武玉學(xué)，陳真，等.出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋(píng)果酸的研究［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2012，12（10）：125-129.

［11］Xiang Zhou，Yipin Zhou.Production of polymalic acid and malic acid by Aureobasidium pullulans fermentation and acid hydrolysis［J］.Biotechnology and Bioengineering，2013，110（8）：2105-2113.

［12］徐玲芬，陳忠華，趙婧，等.聚蘋(píng)果酸高產(chǎn)菌株的篩選及鑒定［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，41（4）：434-439.

［13］Huang Z W，Laurent V，Chetouani G，et al.New functional degradable and bio-compatible nanoparticles based on poly （malic acid）derivatives for site-specific anti-cancer drug delivery［J］.International Journal of Pharmaceutics，2012，423 （1）：84-92.

［14］Ding H，Portilla-Arias J，Patil R，et al.The optimization of polymalic acid peptide copolymers forendosomolytic drug delivery［J］.Biomaterials，2011，32：5269-5278.

［15］Ding H，Inoue S，Ljubimov AV，et al.Inhibition of brain tumor growth by intravenous poly（β-L-malic aci d）nanobioconjugate with pH-dependent drug release［J］.National Acad Sci，2010，107：18143-18148.

［16］Manitchotpisit P，Skory C D，Peterson SW，et al.Poly（β-L-malicacid） production bydiverse phylogenetic clades of Aureobasidium pullulans［J］.Journal of Industrial Microbiology& Biotechnology，2012，39（21）：125-132.

［17］喬長(zhǎng)晟，宋玉民，鄭志達(dá)，等.一種添加維生素大量提高β-聚蘋(píng)果酸產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)基［S］.201310746941.5.

［18］鄒祥，涂光偉，王永康，等.提高聚蘋(píng)果酸產(chǎn)量的方法［S］.201410073783.6.

［19］喬長(zhǎng)晟，姜少麗，馬正旺，等.反向高效液相色譜測(cè)定發(fā)酵液中的聚蘋(píng)果酸［J］.現(xiàn)代食品科技，2012，28（4）：453-455.

Effects of amino acids on poly malic acid fermentation by Aureobasidium pullulans

YIN Hai-song1，2，F(xiàn)AN Xu-jia3，TANG Wei-hua2，BIAN Yan-hui3，CHEN Shan2，QIAO Chang-sheng3，*
（1.School of Bioengineering，Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China；2.Tianjin Light Industrial Chemical Rresearch Institute of Co.，Ltd.，Tianjin 300350，China；3.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The effects of added amino acids on poly malic acid（PMLA）fermentation by A.pullulans CGMCC3337 were studied，the types and adding amount of the amino acids were optimized by single factor experiment and orthogonal experiments.Single factor experiment showed that aspartic acid（Asp），leucine（Leu），valine（Val）and threonine（Thr）were favorable for the synthesis of PMLA and cell growth.Orthogonal experiment showed that the optimal combination of amino acids added（g/L）：Asp 0.4，Leu 0.4，Val 0.4，Thr 0.4.Under the optimizing condition，the production and molecular weight of PMLA achieved 57.89 g/L and 8879 u，respectively.Compared with the previous，the production and molecular weight of PMLA were increased by 40.92%and 45.20%，respectively.

Aureobasidium pullulans；poly malic acid；amino acid

TS201.1

A

1002-0306（2016）08-0242-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.042

2015－10－26

殷海松（1980-），男，碩士研究生，副教授，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：yinhaisong1980@163.com。

*通訊作者：?jiǎn)涕L(zhǎng)晟（1969-），男，博士，教授，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：qiaochangsheng@tust.edu.cn。

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（14ZCZDTG00025）。