卵孢白僵菌NEAU30503固態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化

宋龍騰,　張鑫鑫,　于洪春,　李克斌,　杜　鵑,劉聰鶴,　孫藝峰,　許國慶

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,哈爾濱　150030; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所,北京　100193;3. 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所,沈陽　110161)

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卵孢白僵菌NEAU30503固態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化

宋龍騰1#,張鑫鑫1#,于洪春1*,李克斌2,杜鵑1,劉聰鶴1,孫藝峰1,許國慶3

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,哈爾濱150030; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所,北京100193;3. 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所,沈陽110161)

為了提高卵孢白僵菌NEAU30503在固態(tài)培養(yǎng)中的產(chǎn)孢量,采用單因素篩選試驗和響應(yīng)面法對卵孢白僵菌NEAU30503固態(tài)發(fā)酵條件進行優(yōu)化。在單因素試驗確定最適含水量、接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間的基礎(chǔ)上,應(yīng)用Box-Behnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析方法優(yōu)化出最佳固態(tài)培養(yǎng)條件為:固態(tài)培養(yǎng)基含水量為55%,接種量為15 mL/100 g,培養(yǎng)溫度為27 ℃,培養(yǎng)時間為7.5 d,在此條件下卵孢白僵菌NEAU30503烘干前單位產(chǎn)孢量達到36.72×108孢子/g。此方法適用于小型企業(yè)和生產(chǎn)單位對白僵菌的快速生產(chǎn)。

卵孢白僵菌;固態(tài)培養(yǎng);培養(yǎng)條件;產(chǎn)孢量;響應(yīng)面法

白僵菌(Beauveria)作為害蟲主要的病原真菌,具有安全性高、致病性強、殺蟲范圍廣、無化學(xué)農(nóng)藥殘留、害蟲不易產(chǎn)生抗藥性、具有再生性和兼容性等優(yōu)點,在國內(nèi)外已廣泛用于農(nóng)、林業(yè)害蟲的生物防治[1-2]。白僵菌主要通過昆蟲體壁侵入,也可以通過消化道、氣門及傷口等途徑侵入蟲體。其在昆蟲體內(nèi)大量增殖并產(chǎn)生毒素最終致使昆蟲死亡[3-5]。已知白僵菌可以寄生15 目、149 科、700 多種昆蟲和蜱螨類,特別對鞘翅目及鱗翅目害蟲具有較強毒力[5-6]。目前,在我國白僵菌已廣泛應(yīng)用于地下害蟲蠐螬、玉米螟、大豆食心蟲等農(nóng)業(yè)害蟲及苗圃蠐螬、松毛蟲、天牛等林業(yè)害蟲[1, 3-5, 7]。白僵菌生物殺蟲劑的生產(chǎn)和開發(fā)日益受到世界各國重視,世界上先后有171 種真菌殺蟲劑產(chǎn)品問世,其中僅球孢白僵菌就達58種,占產(chǎn)品種類總數(shù)的33.9%;目前我國微生物農(nóng)藥登記品種有30個,其中球孢白僵菌產(chǎn)品有5個,占整個微生物農(nóng)藥產(chǎn)量的7.27%[8-9]。

白僵菌大量培養(yǎng)的主要方式包括液態(tài)培養(yǎng)、固態(tài)培養(yǎng)和液固兩相培養(yǎng)3種方式[7,10]。目前最常用的培養(yǎng)方式是液固兩相培養(yǎng),這種培養(yǎng)方式既能縮短生產(chǎn)周期,又可保證大量培養(yǎng)的效率和所產(chǎn)孢子的質(zhì)量。本論文試驗菌株卵孢白僵菌(Beauveriabrongniartii,也稱布氏白僵菌)NEAU30503來源于土壤中罹病致死的大猿葉蟲成蟲僵尸,在PDA培養(yǎng)基中菌落白色,較厚,成棉絮狀,培養(yǎng)至第14天,產(chǎn)孢量為4.92×108/cm2,菌落日均增長量3.7 mm/d,對大猿葉蟲、稻水象甲、蠐螬、地老虎等農(nóng)田害蟲具有較強致病性[2,11],是一株很有應(yīng)用潛力的生防菌株。本研究采用液固兩相培養(yǎng)方式,在成功篩選出一種簡易固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,探討了卵孢白僵菌NEAU30503在該固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)條件,并優(yōu)化各培養(yǎng)條件,以期獲得最大產(chǎn)孢量,為該菌株的大量生產(chǎn)提供試驗依據(jù),為卵孢白僵菌NEAU30503的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和基層單位大面積生產(chǎn)應(yīng)用防治蠐螬提供技術(shù)保障。

1　材料與方法

1.1材料

供試菌株:卵孢白僵菌(Beauveriabrongniartii)NEAU30503由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院害蟲生物防治研究室提供。來源于土壤中罹病致死的大猿葉蟲成蟲僵尸[2]。

斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基,其配方參見文獻[2]。

液態(tài)擴大培養(yǎng)基為選擇性SDY+無機鹽培養(yǎng)基,其配方為:葡萄糖8 g,蛋白胨2 g,酵母浸膏2 g,NaH2PO40.2 g,MgSO40.1 g,KCl 0.1 g,蒸餾水200 mL,滅菌冷卻后加入0.1%硫酸慶大霉素,以防止培養(yǎng)基污染。

固態(tài)培養(yǎng)基:按質(zhì)量比,m(蛭石)∶m(麥麩)∶m(玉米粉)= 1∶1∶1。

1.2試驗方法

1.2.1二級擴大培養(yǎng)液體培養(yǎng)物的制備

將卵孢白僵菌NEAU30503接種于PDA培養(yǎng)基斜面上，28 ℃培養(yǎng)12 d后收集孢子,用血球計數(shù)板進行顯微計數(shù),計數(shù)方法參照文獻[2],配制成107孢子/mL的孢子懸浮液。取5 mL孢子懸浮液加入含150 mL液態(tài)培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,在27 ℃,220 r/min振蕩培養(yǎng)72 h后備用。

1.2.2固態(tài)培養(yǎng)方法

取500 mL容量一致的滅菌罐頭瓶,每瓶放入滅菌的固態(tài)培養(yǎng)基15 g,根據(jù)不同試驗設(shè)計接入一定量、培養(yǎng)72 h的二級擴大液體培養(yǎng)物,混拌后用滅菌紙封口,將罐頭瓶放入8#夾鏈袋中封口,于設(shè)定溫度的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)若干天，然后測定凈重及產(chǎn)孢量。

1.2.3卵孢白僵菌固態(tài)培養(yǎng)條件單因素篩選

1.2.3.1初始培養(yǎng)物制備

接種量：以每100 g固體培養(yǎng)基中加入二級擴大培養(yǎng)的液體培養(yǎng)物體積來表示。

含水量：用每100 g固體培養(yǎng)基內(nèi)所含的孢子懸浮液總體積(二級擴大培養(yǎng)的液體培養(yǎng)物體積+無菌水體積)來表示。

初始培養(yǎng)物制備：先將各固態(tài)培養(yǎng)基組分在55℃烘箱烘干4 h。將適量二級擴大培養(yǎng)的卵孢白僵菌孢子懸浮液與適量的無菌水混勻，然后與固體培養(yǎng)基混合，使接種量或培養(yǎng)物的最終含水量符合試驗要求。以下各節(jié)初始培養(yǎng)物制備方法與此相同。

1.2.3.2培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間

在接種量為10 mL/100g，接種后基質(zhì)含水量為50%的條件下，設(shè)置18、21、24、27和32℃ 5個溫度，分別培養(yǎng)3、4、5、6、7、8、9 d后測定產(chǎn)孢量，具體測定方法見1.2.4.2。每組3次重復(fù)。

1.2.3.3接種后基質(zhì)含水量

在培養(yǎng)溫度為27℃的條件下，以接種量10 mL/100g為基礎(chǔ)，補加無菌水至接種后基質(zhì)含水量為40%、45%、50%、55%、60%的5個處理，每處理3次重復(fù)，培養(yǎng)8 d后測產(chǎn)孢量。

1.2.3.4接種量

在含水量50%和27℃的條件下，設(shè)置接種量分別為5、10、15、20和25 mL/100g 5個處理，每處理3次重復(fù)。培養(yǎng)8 d后測定產(chǎn)孢量。

1.2.4利用響應(yīng)面法優(yōu)化固相階段培養(yǎng)條件

1.2.4.1設(shè)計方法

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理,結(jié)合單因素試驗結(jié)果,選取培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、含水量、接種量4個因素,設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗,中心點重復(fù)3次。利用Design-Expert 7對試驗結(jié)果進行分析,得到描述各變量和響應(yīng)值之間關(guān)系的多項回歸模型方程:

其中:Y為響應(yīng)值,b0為常數(shù)項,bi為一次項回歸系數(shù),bij是交互項回歸系數(shù),bii是平方項回歸系數(shù)。對二次回歸擬合的方程進行分析,求取卵孢白僵菌NEAU30503的最佳固態(tài)培養(yǎng)條件,并在確定后進行試驗驗證。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1　響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1　Factors and levels of response surface experiment

1.2.4.2檢測與分析方法

完成培養(yǎng)后,用滅菌玻璃棒將培養(yǎng)物搗碎混勻。取1 g樣品于含有20 mL 0.5%吐溫-60和磁石轉(zhuǎn)子的三角瓶中,攪拌2 h后用血球計數(shù)板對孢子進行顯微計數(shù),重復(fù)3 次。應(yīng)用Design-Expert 7 對數(shù)據(jù)進行多元回歸分析,得到卵孢白僵菌NEAU30503固態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)孢量(Y)與培養(yǎng)溫度(A)、培養(yǎng)時間(B)、含水量(C)及接種量(D)的二次多項式回歸方程,并進行差異顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度對產(chǎn)孢量的影響

培養(yǎng)溫度與時間對卵孢白僵菌NEAU30503產(chǎn)孢量的影響結(jié)果見圖1。在設(shè)置的5個溫度下培養(yǎng)3 d均檢測出孢子,在32℃孢子產(chǎn)量在第5天達到峰值,27 ℃與24 ℃在第 8～9天達到峰值,低于21 ℃時孢子產(chǎn)量低,增長速度緩慢。據(jù)此分析,在一定范圍內(nèi),溫度越高,卵孢白僵菌的生長速度就越快,達到最大產(chǎn)孢量的時間也就越短。方差分析結(jié)果表明,在接菌后1～3 d,各溫度培養(yǎng)下的產(chǎn)孢量差異不顯著,在接菌后4～9 d,27 ℃產(chǎn)孢量與其余各溫度下產(chǎn)孢量差異達到顯著水平。

圖1　培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對NEAU30503產(chǎn)孢量的影響Fig.1　Effects of temperature and time on sporulation of NEAU30503

在不同培養(yǎng)溫度下,達到最大產(chǎn)孢量的時間和最大產(chǎn)孢量的數(shù)值有很大差異。其中,27 ℃下獲得的產(chǎn)孢量最高,在第8、9天時達到峰值,分別為34.25×108孢子/g和34.46×108孢子/g,但第8天與第9天的產(chǎn)孢量并無明顯差異。雖然32℃在第5天即達到最高產(chǎn)孢量,但產(chǎn)孢量較低,只有10.17×108孢子/g;而24 ℃在第8天達到最高產(chǎn)孢量也只有20.63×108孢子/g。21 ℃和18 ℃下,第9天最高產(chǎn)孢量也不高于12.92×108孢子/g。綜合分析試驗結(jié)果得出:最佳培養(yǎng)溫度為27 ℃,培養(yǎng)時間為8 d。

2.2接種量對產(chǎn)孢量的影響

雙波長法分析測定漢中蓮菜支鏈淀粉和直鏈淀粉的含量…………………………………… 張 晨，江 海，孫 明，雷凱鵬（112）

不同接種量對卵孢白僵菌NEAU30503在固態(tài)培養(yǎng)基上孢子增殖的影響(圖2)不同,在5～15 mL/100 g范圍內(nèi)隨接種量增加產(chǎn)孢量逐漸增加,在接種量為15 mL/100 g時,產(chǎn)孢量達到最高。但接種量大于15 mL/100 g時,隨接種量的增加,產(chǎn)孢量有減少趨勢,但差異沒有達到顯著水平。接種量小于10 mL/100 g時,由于菌體前期生長緩慢,造成白僵菌產(chǎn)孢量低;接種量大于15 mL/100 g時,由于前期菌體生長過快,營養(yǎng)物質(zhì)消耗過多,造成后期產(chǎn)孢過程營養(yǎng)不足,導(dǎo)致產(chǎn)孢量較低。故最佳接種量為15 mL/100 g。

圖2　接種量對NEAU30503產(chǎn)孢量的影響Fig.2　Effects of inoculum ratio on sporulation of NEAU30503

2.3含水量對產(chǎn)孢量的影響

固態(tài)培養(yǎng)中含水量高低對卵孢白僵菌NEAU30503產(chǎn)孢量的影響見圖3。當(dāng)含水量小于50%時,產(chǎn)孢量很低,可能是因為含水量低,菌體對培養(yǎng)基營養(yǎng)的吸收能力不足,抑制了菌體的生長,從而影響產(chǎn)孢量;含水量在55% 時,產(chǎn)孢量最大;含水量大于55%時產(chǎn)孢量迅速下降,分析其原因可能是菌體生長過程中需要大量的氧氣,而水分過高導(dǎo)致固態(tài)培養(yǎng)基的透氣性降低,抑制了菌體的產(chǎn)孢。故固態(tài)培養(yǎng)基含水量為55%最為適宜。

圖3　含水量對NEAU30503產(chǎn)孢量的影響Fig.3　Effects of water content on sporulation of NEAU30503

2.4響應(yīng)面分析

響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果見表2,方差分析結(jié)

果見表3。利用Design-Expert 7對表2中數(shù)據(jù)進行多元回歸分析,得到卵孢白僵菌NEAU30503固態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)孢量(Y)與培養(yǎng)溫度(A)、培養(yǎng)時間(B)、含水量(C)及接種量(D)的二次多項式回歸方程為:Y=36.40-1.56A-1.20B-0.10C+0.03D+0.38AB-1.60AC+0.37AD+0.42BC-0.63BD-0.26CD-5.86A2-1.77B2-1.29C2-2.12D2。

表2　響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2　Design and results of response surface experiments

方程的決定系數(shù)R2=0.953 6,說明方程模型顯著,能夠反映出培養(yǎng)過程中白僵菌產(chǎn)孢量的變化規(guī)律。表3中失擬項0.258 3>0.05,說明方程失擬項不顯著, 模型穩(wěn)定且對試驗結(jié)果預(yù)測性較好。經(jīng)對回歸系數(shù)的方差分析,培養(yǎng)溫度和含水量的交互效應(yīng)對白僵菌產(chǎn)孢量具有顯著影響,培養(yǎng)溫度與接種量的二次項都達到極顯著水平,說明這兩個因子對產(chǎn)孢量的影響較大。

利用Design-Expert 7做出響應(yīng)面等高線圖。由交互影響的響應(yīng)面等高圖(圖4)可看出,A、B、C、D存在極值點,對回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù),可以得到曲面的最大點,即4個因子最優(yōu)試驗點(A、B、C、D)的編碼值(-0.14、-0.36、-0.01、0.05),即培養(yǎng)溫度為26.86 ℃,培養(yǎng)時間為7.64 d,含水量為54.99%,接種量為15.05 mL/100 g,產(chǎn)孢量最高預(yù)測值達到36.72×108孢子/g。為便于實際應(yīng)用,將培養(yǎng)參數(shù)優(yōu)化為培養(yǎng)溫度為27 ℃,培養(yǎng)時間為7.5 d,含水量為55%,接種量為15 mL/100 g。

圖4　兩因素交互影響產(chǎn)孢量的響應(yīng)面和等高線Fig.4　Response surface and contour maps of spore output of two-factor interaction

變異來源Source平方和Sumofsquare自由度df均方MeansquareF-value顯著性P-value模型Model1153.96 1482.42571 22.04248<0.0001培養(yǎng)溫度(A)Temperature58.20388158.2038815.565020.0013

續(xù)表3Table 3(Continued)

變異來源Source平方和Sumofsquare自由度df均方MeansquareF-value顯著性P-value培養(yǎng)時間(B)Culturetime34.34027134.340279.1833560.0084含水量(C)Watercontent0.23503310.2350330.0628530.8054接種量(D)Inoculumratio0.01627410.0162740.0043520.9483AB2.34470112.3447010.6270250.4408AC41.03993141.0399310.9750.0047AD2.15725112.1572510.5768970.4593BC2.81258112.8125810.7521470.3995BD6.40726916.4072691.7134470.2102CD1.10686211.1068620.2960.5944A2940.70881940.7088251.5666<0.0001B286.22281186.2228123.057910.0002C245.54686145.5468612.180250.0033D2123.50321123.503233.02751<0.0001Residual56.09105153.739403Lackoffit55.65789105.56578964.246380.2583Pureerror0.4331650.086632Correctedtotal1210.05129

3　討論

隨著白僵菌生物殺蟲劑需求量的不斷增加,白僵菌培養(yǎng)方法的研究受到廣泛重視。然而在白僵菌培養(yǎng)過程中能影響產(chǎn)孢量的因素除了培養(yǎng)方法以外,培養(yǎng)條件對白僵菌的產(chǎn)孢影響也尤為重要,通過優(yōu)化培養(yǎng)條件來提高白僵菌產(chǎn)孢量也是生產(chǎn)白僵菌生防制劑的重要內(nèi)容之一。傳統(tǒng)優(yōu)化培養(yǎng)工藝的方法較多,有單因素法、正交實驗法、模糊邏輯學(xué)法和數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法等,但費時費力,且常忽略因子之間的交互作用,從而使得優(yōu)化結(jié)果不理想[12]。響應(yīng)面法是微生物培養(yǎng)工藝優(yōu)化中常用的方法之一,它可建立連續(xù)的三維變量曲面模型,能反映出單因素和多種因素間的交互作用對微生物生長的影響[13],被認(rèn)為是較為準(zhǔn)確可靠的優(yōu)化方法[14-15]。通過單因素試驗結(jié)果篩選出影響白僵菌產(chǎn)孢量的主要影響因子,再通過響應(yīng)面法優(yōu)化出最佳培養(yǎng)條件,可減少大量的篩選試驗,并能提高試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,可作為微生物培養(yǎng)測定的方法。

本研究通過試驗驗證,其濕重產(chǎn)孢量可達到36.72×108孢子/g。經(jīng)烘干測試含水量,物料濕重約為干重的3倍以上,據(jù)此可推測出干重的單位產(chǎn)孢量達到每克百億孢子以上。該培養(yǎng)條件生產(chǎn)白僵菌,對生產(chǎn)環(huán)境和生產(chǎn)設(shè)備要求低,可操作性強,生產(chǎn)成本較低,非常適合小型企業(yè)和生產(chǎn)單位快速生產(chǎn)白僵菌用于害蟲生物防治需要,顯現(xiàn)出較好的生產(chǎn)應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Optimization of solid-state culture conditions forBeauveriabrongniartiiNEAU30503

Song Longteng1,Zhang Xinxin1,Yu Hongchun1,Li Kebin2,Du Juan1,Liu Conghe1,Sun Yifeng1,Xu Guoqing3

(1. College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin150030, China; 2. Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100193, China; 3. Institute of Plant Protection, Liaoning Academy of Agricultural Sciences, Shenyang110161, China)

Single factor screening test and response surface method were used to optimize the fermentation conditions in order to improve spore production ofBeauveriabrongniartiiNEAU30503. The suitable water content, inoculation amount, fermentation temperature and fermentation time were determined by single factor experiments. By using Box-Behnken experimental design and the response surface analytical method, the optimum fermentation conditions were obtained: the water content in solid medium was 55%; inoculation amount was 15 mL/100 g; culture temperature was 27 ℃ and culture time was 7.5 d. Under these conditions,B.brongniartiiNEAU30503 sporulation capacity reached 36.72×108conidia/g before drying. This method is suitable for small business and factories for fast spore production.

Beauveriabrongniartii;solid-state culture;fermentation condition;sporulation capacity;response surface method

2015-01-16

2015-05-15

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201003025)

E-mail:hongcyu@126.com

S 476.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.022

# 對本文同等貢獻，為并列第一作者