不同品系栝樓果皮腺嘌呤和鳥苷含量比較

于京平，張永清.濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺 64003；.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 50355

不同品系栝樓果皮腺嘌呤和鳥苷含量比較

于京平1，張永清2
1.濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺 264003；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

目的 比較不同品系栝樓果皮腺嘌呤、鳥苷含量，為選育良種和評價瓜蔞皮藥材質(zhì)量提供依據(jù)。方法 采用高效液相色譜法測定3個品系栝樓果皮中腺嘌呤、鳥苷的含量，色譜柱為Waters AtlantisT3-C18（4.6 mm×150.0 mm，5 μm），流動相為甲醇-水，檢測波長254 nm。結(jié)果 品系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ栝樓果皮腺嘌呤含量分別為0.159 4、0.159 6、0.134 1 mg/g，鳥苷含量分別為0.097 1、0.127 9、0.093 4 mg/g。結(jié)論 不同品系栝樓果皮鳥苷含量存在較大差異，以品系Ⅱ果皮中的腺嘌呤、鳥苷含量較高，提示選育良種是提高瓜蔞皮藥材腺嘌呤、鳥苷含量的有效途徑。

高效液相色譜法；栝樓；果皮；腺嘌呤；鳥苷

栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.為葫蘆科多年生草質(zhì)藤本植物，其干燥成熟果皮是常用中藥瓜蔞皮，可清熱化痰、利氣寬胸，具有調(diào)節(jié)脂代謝、抗動脈粥樣硬化、保護(hù)血管內(nèi)皮、提高心肌抗缺氧能力、缺血再灌注損傷保護(hù)和鈣拮抗等藥理作用，用于治療心、腦、肺等多臟器的多種疾病，尤以治療動脈粥樣硬化引起的缺血性疾病為著［1-2］。有關(guān)瓜蔞皮的活性成分至今不明確，2015年版《中華人民共和國藥典》僅收載了以對照藥材薄層定性的鑒別方法，控制瓜蔞皮藥材質(zhì)量尚缺乏合理指標(biāo)。以瓜蔞皮為原料研制生產(chǎn)的瓜蔞皮注射液具有行氣除滿、開胸除痹功效，用于治療冠心病心絞痛、腦梗死等［3-4］。腺嘌呤和鳥苷是瓜蔞皮注射液的主要成分，前者可提高紅細(xì)胞攜氧和放氧能力，與磷酸的結(jié)合物可刺激白細(xì)胞增生，用于防治白細(xì)胞減少癥［5］；后者可改善心腦血液循環(huán)，具有防止心率失常、抗腫瘤、抗病毒等活性［6-7］。因此，在活性成分尚不明確的情況下，可以將腺嘌呤、鳥苷含量作為瓜蔞皮藥材質(zhì)量的控制指標(biāo)。

山東省濟(jì)南市長清區(qū)是瓜蔞的道地產(chǎn)區(qū)，種植歷史悠久，藥材質(zhì)量上乘。由于栝樓屬于雌雄異株植物，長期以來生產(chǎn)中種質(zhì)混亂［8-9］。為了選育良種，實(shí)現(xiàn)提高產(chǎn)量、穩(wěn)定質(zhì)量的目標(biāo)，我們經(jīng)過廣泛收集與比較，將當(dāng)?shù)罔闃欠N質(zhì)資源劃分為3個品系，并對不同品系果實(shí)與種子性狀、果皮無機(jī)元素及揮發(fā)性物質(zhì)等進(jìn)行了分析測定［10-12］。本研究采用HPLC測定3個品系栝樓果皮中的腺嘌呤與鳥苷含量，旨在為栝樓良種選育和瓜蔞皮藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（Agilent1200，美國Agilent），Waters AtlantisT3-C18色譜柱（4.6 mm×150.0 mm，5 μm），超聲儀（KQ-300E，昆山市超聲儀器有限公司），電子天平（FA1104，上海天平儀器廠）。

栝樓果皮樣品采自濟(jì)南市長清區(qū)馬山鎮(zhèn)北李村，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定為葫蘆科栝樓屬植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥果皮。腺嘌呤對照品（批號050302，上海伯奧生物科技有限公司），鳥苷對照品（批號26-2006，上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化中心）；甲醇為色譜純（美國Tedia公司）；水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1對照品溶液 精密稱取一定量減壓干燥至恒重的鳥苷、腺嘌呤對照品，加水溶解，轉(zhuǎn)移至20 mL容量瓶中，定容，混勻，配制成腺嘌呤、鳥苷濃度分別為0.029 4、0.070 4 mg/mL對照品溶液，用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，備用。

2.1.2供試品溶液 將不同品系栝樓果皮置 55 ℃條件下烘干，粉碎，過四號篩。四分法取樣，精密稱定適量干燥粉末，置具塞瓶中，加15%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，50 ℃溫浸1 h，50 ℃超聲提取1 h（功率250 W，頻率40 kHz），冷卻，用15%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，4500 r/min離心10 min，取上清液，重復(fù)提取2次，合并上清液，用0.45 μm濾膜過濾，即得。

2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters AtlantisT3-C18（4.6 mm×150.0 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水梯度洗脫（見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量：50 μL。色譜圖見圖1。

表1　流動相梯度洗脫程序（%）

2.3線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下鳥苷對照品溶液，分別加水稀釋至25、10、8、5、4、2.5倍，搖勻，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為Y=2 600 000X-1.218 7，r2=1.000 0。結(jié)果表明，鳥苷在0.148～1.408 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1　混合對照品HPLC圖

精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下腺嘌呤對照品溶液，分別加水稀釋至100、50、20、10、1倍，搖勻，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為Y=5 000 000X+1.162 7，r2=0.999 7。結(jié)果表明，腺嘌呤在0.014 7～1.47 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，測定腺嘌呤、鳥苷峰面積，重復(fù)5次，其峰面積RSD分別為0.47%、0.70%，表明精密度良好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液，在2、4、6、8、10 h內(nèi)測定腺嘌呤、鳥苷峰面積5次，其峰面積RSD值分別為2.12%、3.12%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取栝樓果皮樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備5份，分別測定腺嘌呤、鳥苷含量，均RSD＜2.00%，表明重復(fù)性良好。

2.7加樣回收率試驗(yàn)

精密稱量已知鳥苷、腺嘌呤含量的樣品共6份，分別加入一定量的對照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定鳥苷、腺嘌呤含量，計算回收率，結(jié)果鳥苷、腺嘌呤的平均回收率分別為101.20%、100.67%，RSD分別為0.63%、0.91%，見表2、表3。表明對照品回收率符合要求。

2.8樣品測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液50 μL，按上述色譜條件測定其峰面積積分值，以外標(biāo)法計算鳥苷、腺嘌呤含量，重復(fù)3次。色譜圖見圖2，鳥苷、腺嘌呤色譜峰峰形較好，分離良好，保留時間分別為20.758、28.586 min。含量測定結(jié)果見表4。品系Ⅰ、Ⅱ栝樓果皮腺嘌呤含量相近，均顯著高于品系Ⅲ；品系Ⅰ、Ⅲ栝樓果皮鳥苷含量相近，均顯著低于品系Ⅱ。

表2　腺嘌呤加樣回收率試驗(yàn)

表3　鳥苷加樣回收率試驗(yàn)

表4　不同品系栝樓果皮腺嘌呤、鳥苷含量測定結(jié)果（mg/g）

圖2　3個品系栝樓果皮鳥苷、腺嘌呤HPLC圖

3 討論

在檢測波長的選擇上，本試驗(yàn)對一定濃度的混合對照品溶液進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果254 nm為鳥苷的最大吸收波長，260 nm為腺嘌呤的最大吸收波長；與260 nm比較，波長254 nm檢測時基線平穩(wěn)、峰形較好，鳥苷具有較高的響應(yīng)值，腺嘌呤響應(yīng)值差距不大；因此選取254 nm作為檢測波長。

本研究對超聲提取和回流提取得到的2種供試品溶液進(jìn)行HPLC測定，結(jié)果超聲提取對栝蔞果皮中腺嘌呤、鳥苷的提取更為完全。超聲提取適用于熱穩(wěn)定性較差、易高溫破壞的核苷類成分提取，同時能夠提高破碎速度，顯著提高提取效率，平行操作性強(qiáng)。因此，初步選擇超聲提取作為瓜蔞皮藥材核苷類成分HPLC含量測定的提取方式。

由于瓜蔞皮的活性成分至今尚不明確，其質(zhì)量難以控制。本研究建立的HPLC方法，不僅能夠使瓜蔞皮提取液中各組分達(dá)到有效分離，而且還能在同一色譜條件下同時測定腺嘌呤和鳥苷含量，為有效控制瓜蔞皮藥材質(zhì)量提供了新的途徑和方法。測定結(jié)果顯示，3個品系栝樓果皮鳥苷含量差異顯著，以品系Ⅱ含量較高，提示可以通過良種選育來提高和保證瓜蔞皮藥材的質(zhì)量。雖然依據(jù)腺嘌呤和鳥苷含量可在一定程度上評價瓜蔞皮藥材品質(zhì)，但由于瓜蔞皮化學(xué)成分復(fù)雜，發(fā)揮臨床療效的成分種類可能有多種，因此，更加合理與完備的評價方法仍需深入研究。

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Comparison of Contents of Adenine and Guanosine in Peels of Three Strains of Trichosanthes kirilowii Maxim.

YU Jing-ping1， ZHANG Yong-qing2（1. Binzhou Medical University， Yantai 264003， China； 2. Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China）

Objective To compare the contents of guanosine and adenine in peels of three strains of Trichosanthes kirilowii Maxim.； To provide references for germplasm resources evaluation and breeding of the Chinese medicinal materials. Methods HPLC method was used to determine the contents of guanosine and adenine with Waters AtlantisT3-C18column （4.6 mm×150.0 mm， 5 μm）. The mobile phase was methanol and water， and the detection wavelength was 254 nm. Results The contents of guanosinein in peels of three strains of Trichosanthes kirilowii Maxim. were 0.159 4， 0.159 6， 0.134 1 mg/g， respectively； the contents of adenine were 0.097 1， 0.127 9， 0.093 4 mg/g，respectively. Conclusion There were significient differences in the contents of adenine among three strains of Trichosanthes kirilowii Maxim.. Strain Ⅱ is with higher level of guanosine and adenine， which implies that the breeding of the Chinese medicinal materals is one way to improve the quality of Trichosanthis Exocarpium.

HPLC； Trichosanthes kirilowii Maxim.； peel； guanosine； adenine

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.021

R284.1

A

1005-5304（2016）09-0087-03

山東省科技發(fā)展計劃（2008GG2NS02022）；山東省農(nóng)業(yè)良種工程（2009LZ01-03）；濟(jì)南市科技局高校院所自主創(chuàng)新項(xiàng)目（200906028）；濱州醫(yī)學(xué)院科研啟動基金項(xiàng)目（BY2014KYQD29）

2015-05-14；編輯：陳靜）