阿魏酸對人胃癌MGC-803細胞增殖的影響

張艷，李海龍，王虎平，，顧靜，馬春林，，吳紅彥，.甘肅中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000；.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉化重點實驗室，甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實驗室，甘肅 蘭州 730000

阿魏酸對人胃癌MGC-803細胞增殖的影響

張艷1，李海龍2，王虎平1，2，顧靜2，馬春林1，2，吳紅彥1，2
1.甘肅中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000；
2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉化重點實驗室，甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實驗室，甘肅 蘭州 730000

目的 觀察阿魏酸對人胃癌MGC-803細胞增殖的影響，探討其誘導胃癌細胞凋亡的作用機制。方法 不同濃度阿魏酸干預體外培養(yǎng)人胃癌MGC-803細胞，作用24、48、72 h后，MTT法檢測細胞增殖；不同濃度（0、5、7.5、10 mg/mL）阿魏酸作用MGC-803細胞48 h，Annexin V-FITC/PI法和流式細胞儀檢測細胞凋亡，RT-qPCR和Western-blot檢測Capase-3、Capase-9、Bax、Bcl-2和Xiap的mRNA和蛋白表達。結果 與對照組比較，5、7.5、10、12.5 mg/mL阿魏酸作用MGC-803細胞的OD值明顯降低，阿魏酸抑瘤作用明顯，阿魏酸作用MGC-803細胞24、48、72 h的IC50分別為12.93、9.73、5.52 mg/mL；5、7.5、10 mg/mL阿魏酸作用MGC-803細胞48 h后均能誘導MGC-803細胞凋亡，5、7.5、10 mg/mL阿魏酸均能上調Capase-3、Capase-9和Bax的mRNA和蛋白表達，下調Bcl-2和Xiap的mRNA和蛋白表達。結論 阿魏酸能有效抑制MGC-803細胞增殖，并能誘導MGC-803細胞凋亡，其作用機制與內源性線粒體凋亡途徑和下調Xiap的表達有關。

阿魏酸；胃癌；細胞增殖；細胞凋亡

阿魏酸是多種中藥如川芎、當歸、升麻、木賊、蒲公英、酸棗仁等的有效成分之一，現(xiàn)代藥理研究表明，阿魏酸具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗凝、解毒、保肝、調節(jié)免疫等功效［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸乙酯可抑制胃癌SGC-7901細胞增殖并且誘導凋亡［2］。然而，阿魏酸是否可抑制胃癌SGC-7901細胞增殖并且誘導凋亡尚不清楚。本實驗擬用阿魏酸干預胃癌MGC-803細胞，觀察其對胃癌細胞增殖的影響，并探討其誘導胃癌細胞凋亡的機制。

1 實驗材料

1.1細胞株

胃癌MGC-803細胞，北京協(xié)和腫瘤研究所。

1.2主要試劑與儀器

高糖DMED培養(yǎng)基（健順生物公司），胎牛血清（杭州四季青公司），阿魏酸（上海紫一試劑廠），反轉錄試劑盒（大連寶生物公司），PCR擴增試劑盒（上海柏業(yè)生物公司），一抗兔抗Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、Xiap和GAPDH（Affinity公司），二抗（Immunoway生物公司），噻唑藍（MTT，北京索來寶科技有限公司）。CO2培養(yǎng)箱（力康公司），低溫離心機（Beckman公司），電泳儀（北京六一儀器廠），微量上樣器（上海生工生物工程有限公司）。

2 實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)

用含10%FBS高糖DMEM，加入青霉素100 U/mL、鏈霉素 1 mg/mL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)MGC-803細胞。每隔2 d換完全培養(yǎng)基，待細胞密度達90%時按1∶2比例傳代。取對數(shù)期細胞用于下一步實驗。

2.2MTT法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期胃癌細胞，制成單細胞懸液，細胞計數(shù)，按照5×103個/mL密度接種于96孔板，每孔100 μL（另設只加PBS的空白調零孔），每組8孔，37 ℃孵育過夜。正常組加100 μL DMEM完全培養(yǎng)基，藥物組加80 μL DMEM完全培養(yǎng)基及藥物20 μL，使終體積為200 μL。藥物作用24、48、72 h后各組每孔加20 μL MTT，繼續(xù)孵育4 h，小心吸去上清液，每孔加150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，于酶標儀波長490 nm處檢測各孔光密度（OD）值，計算細胞抑制率。細胞抑制率（%）=1-（實驗組平均值÷對照組平均值）×100%。

2.3流式細胞術檢測細胞凋亡

不同濃度阿魏酸（0、5、7.5、10 mg/mL）作用于對數(shù)期MGC-803細胞48 h，用胰酶消化并收集細胞，用PBS洗滌細胞并吹打成細胞懸液，取部分細胞懸液加入Binding Buffer，再加5 μL Annexin V混勻后，加5 μL碘化丙啶混勻，室溫、避光反應10 min，流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

2.4RT-qPCR檢測 Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2 和Bax mRNA表達

不同濃度阿魏酸（0、5、7.5、10 mg/mL）作用于對數(shù)期MGC-803細胞48 h，提取各加藥組和對照組（只加培養(yǎng)液）的總RNA，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s反轉錄成cDNA，PCR引物均由大連寶生物公司合成（見表1）。擴增條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，40個循環(huán)擴增，RT-qPCR檢測Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bax的mRNA表達，實驗重復3次。PCR反應結束后分析融解曲線，從而判定擴增產(chǎn)物是否有非特異性擴增；分析擴增曲線，計算Ct值，2￣ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表1　PCR引物序列

2.5Western blot檢測 Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bax蛋白表達

不同濃度阿魏酸（0、5、7.5、10 mg/mL）作用于對數(shù)生長期MGC-803細胞干預48 h，加入蛋白裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）提取總蛋白，將蛋白煮沸變性后，經(jīng)8%SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白分離，濕轉至 PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉 1.5 h，一抗（Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax和Xiap）孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL于Bio-rad凝膠成像儀中進行反應，采用美國Image J2x軟件對Western blot結果進行定量分析，灰度值以累積吸光度值表示，結果以目的蛋白與GAPDH累積吸光度的比值表示。

3 統(tǒng)計學方法

4 結果

4.1阿魏酸對胃癌MGC-803細胞增殖的影響

與對照組比較，5、7.5、10、12.5 mg/mL阿魏酸作用胃癌MGC-803細胞各時點OD值明顯降低，阿魏酸各劑量組抑瘤作用明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），并與濃度呈正相關，見表2。阿魏酸作用胃癌MGC-803細胞24、48、72 h的IC50分別為12.93、9.73、5.52 mg/mL。

表2　各組胃癌MGC-803細胞增殖比較（±s）

表2　各組胃癌MGC-803細胞增殖比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001（下同）

組別 　n 劑量/（mg/mL） 　24 h 　48 h 　72 h OD值 　抑制率/% 　 OD值 　抑制率/% 　 OD值 　抑制率/%對照組 　6 　　0.478±0.117 　0.00±0.00 　0.701±0.135 　 0.00±0.00 　0.845±0.120 　0.00±0.00阿魏酸組 　6 　 1.25 　0.443±0.089 　7.32±1.05 　0.663±0.066 　 5.45±1.02 　0.644±0.197*　23.80±1.86 6 　 2.5 　0.445±0.098 　6.92±0.97 　0.640±0.049*　 8.75±1.45 　0.538±0.062**　36.33±2.88 6 　 5 　0.425±0.026*　11.15±1.56 　0.507±0.047**　27.68±2.14 　0.362±0.158**　57.20±3.20 6 　 7.5 　0.407±0.076*　14.86±1.48 　0.397±0.039**　43.40±2.58 　0.322±0.048**　61.89±3.24 6 　10 　0.283±0.027**　40.72±2.42 　0.341±0.131**　51.32±3.45 　0.294±0.224**　65.20±4.65 6 　12.5 　0.220±0.094**　53.96±2.96 　0.271±0.168**　61.35±3.99 　0.157±0.018**　81.42±4.76

4.2阿魏酸對胃癌MGC-803細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測顯示，5、7.5、10 mg/mL阿魏酸可明顯誘導人胃癌MGC-803細胞發(fā)生凋亡，見圖1。其細胞凋亡率分別為（22.47±3.20）%、（47.45± 8.76）%、（74.55±10.34）%，較對照組（2.50±0.42）%明顯升高。

4.3阿魏酸對胃癌 MGC-803細胞 Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax和Xiap mRNA表達的影響

與對照組比較，5、7.5、10 mg/mL阿魏酸可使胃癌MGC-803細胞Caspase-3、Caspase-9、Bax mRNA表達上調，Bcl-2和Xiap mRNA表達下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.001），溶解曲線分析表明擴增產(chǎn)物特異性好。結果見表3。

表3　各組胃癌MGC-803細胞Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2和Xiap mRNA表達比較（±s）

表3　各組胃癌MGC-803細胞Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2和Xiap mRNA表達比較（±s）

組別 　n 　劑量/（mg /mL） 　Caspase-3 　Caspase-9 　Bax 　Bcl-2 　Xiap對照組 　3 　1 　1 　1 　1 　1阿魏酸組 　3 　 5 　 1.569±0.629**　 1.979±0.402***　3.405±0.440***　0.765±0.081***　 0.073±0.048***3 　 7.5 　 1.752±0.649**　 2.930±0.771***　4.084±1.135***　0.512±0.064***　 0.067±0.006***3 　 10 　 2.401±1.152***　 3.375±0.880***　7.224±1.100***　0.168±0.035***　 0.051±0.002***

4.4阿魏酸對胃癌 MGC-803細胞 Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax和Xiap蛋白表達的影響

與對照組比較，5、7.5、10 mg/mL阿魏酸可使胃癌MGC-803細胞Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達不同程度上調，Bcl-2和Xiap蛋白表達不同程度下調（P＜0.05，P＜0.001）。結果見表4、圖2。

圖1　各組胃癌MGC-803細胞凋亡流式細胞圖

表4　各組胃癌MGC-803細胞Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2和Xiap蛋白表達比較（±s）

表4　各組胃癌MGC-803細胞Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2和Xiap蛋白表達比較（±s）

組別 　n 　劑量/（mg /mL） 　 Caspase-3 　 Caspase-9 　 Bax 　 Bcl-2 　 Xiap對照組 　3 　　0.354±0.035 　0.041±0.005 　0.365±0.034 　4.002±0.502 　0.915±0.065阿魏酸組 　3 　5 　0.561±0.056*　0.239±0.027***　3.630±0.433***　4.042±0.076 　0.576±0.091**3 　7.5 　1.452±0.154***　0.403±0.051***　4.637±0.572***　0.651±0.642***　0.236±0.036***3 　10 　2.119±0.237***　0.507±0.043***　6.125±0.363***　0.113±0.031***　0.043±0.005***

圖2　各組胃癌MGC-803細胞Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 和Xiap蛋白表達免疫印跡電泳圖

5 討論

細胞凋亡是一種有序的或程序性的死亡方式，受多種基因調控，是細胞核受某些特定信號刺激后進行的正常生理反應。細胞凋亡途徑包括線粒體凋亡途徑、內質網(wǎng)信號途徑、死亡受體途徑。細胞凋亡的啟動和進行受到精確調控，具有獨特而復雜的信號傳導系統(tǒng)，其中，Bax和Bcl-2是Bcl-2家族的2個成員，通常以復合物的形式存在。前者為促凋亡因子，后者為抗凋亡因子，在細胞凋亡過程，促凋亡蛋白Bax可促進線粒體通透性轉變而開放，進而導致線粒體膜電位的下降，細胞色素C釋放，進而激活Caspase，最終導致細胞死亡?？沟蛲龅鞍譈cl-2則可拮抗Bax的上述作用而抑制細胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族中最重要的細胞凋亡執(zhí)行者之一，在蛋白酶級聯(lián)切割過程中處于核心位置，一旦Caspase被激活就會導致細胞凋亡。它可以通過死亡受體介導途徑與線粒體依賴途徑來誘發(fā)細胞凋亡，Caspase-9屬于上游起始Caspase，主要在內源性細胞凋亡途徑中活化從而激活效應Caspase-3導致細胞凋亡［3］。

Xiap充當?shù)蛲鲆种频鞍?，并可能與通過其BIR2 和BIR3結構域與Caspase-9的相互作用，抑制其活化并因此激活下游 Caspase-3［4］。相關研究表明，使用siRNA技術沉默Xiap基因后，可抑制骨肉瘤細胞的生長，并增加細胞死亡［5］；增強骨肉瘤細胞對阿霉素、順鉑的敏感度［6］，增加白血病細胞［7］和膀胱癌細胞［8］對阿霉素誘導的細胞凋亡的敏感度。慢病毒介導的shRNA沉默Xiap基因后在體外和體內抑制SW1990胰腺癌細胞的增殖［9］。

本實驗結果顯示，5、7.5、10 mg/mL阿魏酸可使MGC-803胃癌細胞 Caspase-3、Caspase-9、Bax的mRNA和蛋白表達不同程度上調，Bcl-2和 Xiap的mRNA和蛋白表達不同程度下調，表明阿魏酸可能通過 Bcl-2、Bax蛋白表達的改變進而通過上述途徑導致線粒體膜電位下降，細胞色素 C釋放，Caspase-9 和Caspase-3激活，導致細胞凋亡。因此，阿魏酸誘導胃癌 MGC-803細胞凋亡通過線粒體途徑發(fā)揮作用。阿魏酸及其鈉鹽發(fā)揮抗腫瘤作用涉及誘導細胞凋亡、化療增敏、抗血管生成等多個方面［10］，其中誘導凋亡是阿魏酸發(fā)揮抗腫瘤作用的重要途徑之一，而其他作用機制仍有待進一步研究。

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（修回日期：2015-12-01；編輯：華強）

Effects of Ferulic Acid on Gastric Cancer Cell Line MGC-803 Proliferation

ZHANG Yan1，LI Hai-long2， WANG Hu-ping1，2， GU Jing2， MA Chun-lin1，2， WU Hong-yan1，2（1. Basic Medical School， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province， Key Laboratory for TCM New Products Development Engineering of Gansu Province， Lanzhou 730000， China）

Objective To explore the effects of ferulic acid on gastric cancer cell line MGC-803 proliferation； To discuss the mechanism of apoptosis induced by ferulic acid. Methods Ferulic acid with a variety of concentrations was used to treat gastric cancer cell line MGC-803 for 24， 48， 72 h； MTT experiment was used to detect the growth of gastric cancer cells. After gastric cancer cell line MGC-803 were treated with ferulic acid with a variety of concentrations （0， 5， 7.5， 10 mg/mL） for 48 h， all gastric cancer cells were collected and stained by Annexin V-FITC/PI for the detection of apoptosis by flow cytometry. RT-qPCR and Western-blot methods were used to detect mRNA and protein levels of Caspase-3， Caspase-9， Bax， Bcl-2 and Xiap. Results Compared with the control group，the OD value of cell line MGC-803 treated by ferulic acid with a variety of concentrations （5， 7.5， 10， 12.5 mg/mL）decreased significantly； the anti-tumor effect of ferulic acid was obvious； IC50of 24， 48， and 72 hours after treated by ferulic acid was 12.93， 9.73 and 5.52 mg/mL respectively. Cell lineMGC-803 treated by ferulic acid with a variety of concentrations （5， 7.5， 10 mg/mL） after 48 h could induce the apoptosis of MGC-803 cells， up-regulate mRNA and protein levels of Caspase-3， Caspase-9， and Bax， down-regulate mRNA and protein levels of Bcl-2 and Xiap. Conclusion Ferulic acid can inhibit the proliferation of MGC-803 cells effectively and induce the apoptosis of MGC-803 cells， which mechanism is related to mitochondria apoptosis pathway and the down-regulation of Xiap expression.

ferulic acid； gastric cancer； cell proliferation； cell apoptosis

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.017

R285.5

A

1005-5304（2016）09-0070-04

甘肅省自然科學基金（1212RJZA083）

吳紅彥，E-mail：2012964366@qq.com

2015-10-23）