肝切除患者血清對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞增殖能力的影響

邢謙哲，高英堂，駱瑩，王毅軍，杜智△

肝切除患者血清對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞增殖能力的影響

邢謙哲1，高英堂2，駱瑩2，王毅軍1，杜智1△

目的 通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察肝切除患者術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間血清對(duì)肝細(xì)胞增殖的影響。方法 根據(jù)所采用的血清不同，將培養(yǎng)的HL-7702細(xì)胞分為胎牛血清（FBS）組、術(shù)前血清組、術(shù)后0.5 h、3 h、24 h和72 h血清組，各組細(xì)胞在Cell-IQ無(wú)標(biāo)記活細(xì)胞影像分析系統(tǒng)中維持培養(yǎng)72 h，通過(guò)該系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)計(jì)數(shù)，繪制出各組細(xì)胞擴(kuò)增曲線，比較各組細(xì)胞72 h內(nèi)細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，對(duì)各組培養(yǎng)72 h后的細(xì)胞進(jìn)行BrdU免疫熒光染色，比較各組BrdU陽(yáng)性率。結(jié)果 細(xì)胞擴(kuò)增曲線顯示各組細(xì)胞均有增殖，除術(shù)后72 h血清組外，其余人血清組培養(yǎng)的HL-7702細(xì)胞增殖速度均高于FBS組，術(shù)后0.5 h和術(shù)后3 h血清組更明顯。除術(shù)后72 h血清組外，各組人血清組HL-7702細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)均高于FBS組，術(shù)后0.5 h和術(shù)后3 h血清組擴(kuò)增倍數(shù)高于術(shù)前血清組（均P＜0.05）。人血清組HL-7702細(xì)胞BrdU陽(yáng)性率均高于FBS組，術(shù)后0.5 h和術(shù)后3 h血清組細(xì)胞BrdU陽(yáng)性率高于術(shù)前血清組（均P＜0.05）。結(jié)論 肝切除術(shù)后外周血清較FBS具有更強(qiáng)的促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的能力，肝切除術(shù)后早期血清促進(jìn)肝細(xì)胞增殖作用更明顯。

肝細(xì)胞；細(xì)胞增殖；肝切除術(shù)；血清

肝功能衰竭是肝病患者死亡的重要原因之一，目前最有效的治療手段是原位肝移植，但由于供肝短缺，肝移植很難廣泛應(yīng)用于臨床。肝細(xì)胞移植及生物型人工肝（bioartificial liver，BAL）作為肝功能衰竭的輔助治療手段，不僅可以為患者尋求合適的供肝來(lái)源爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間，甚至可以幫助患者平安渡過(guò)危險(xiǎn)期，通過(guò)肝再生而自然恢復(fù)，這兩種治療手段均需要一定數(shù)量有功能的肝細(xì)胞。正常成人肝細(xì)胞是這兩種治療方法理想的細(xì)胞材料，但是其在體外培養(yǎng)條件下很難增殖，肝細(xì)胞功能迅速喪失，這也限制了正常成人肝細(xì)胞的臨床應(yīng)用。肝臟具有很強(qiáng)的再生能力，當(dāng)手術(shù)、創(chuàng)傷等造成肝體積損失后，殘存肝組織可迅速再生恢復(fù)至原有體積和質(zhì)量，最終達(dá)到肝組織結(jié)構(gòu)的重建及肝功能恢復(fù)［1］。目前肝切除術(shù)后肝細(xì)胞再生機(jī)制的研究已經(jīng)很多，研究認(rèn)為肝切除術(shù)后肝臟再生主要是通過(guò)成熟肝細(xì)胞的增殖來(lái)完成的，其中肝切除術(shù)后外周血細(xì)胞因子水平的變化在肝細(xì)胞增殖過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用［2］。本課題組前期在采用肝切除患者血清誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)中觀察到，肝切除術(shù)后早期血清具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)分化作用［3］。但肝切除術(shù)后血清對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞增殖的影響尚少見相關(guān)研究。本研究旨在觀察肝切除術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間血清對(duì)成人正常肝細(xì)胞系HL-7702細(xì)胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI 1640（產(chǎn)品號(hào)11875-093）、胎牛血清（FBS，產(chǎn)品號(hào)10100139）購(gòu)自Life Technologies；5-溴-2-脫氧脲苷（BrdU，產(chǎn)品號(hào)B5002）購(gòu)自Sigma公司；小鼠抗人BrdU單克隆抗體（產(chǎn)品號(hào) 555627）購(gòu)自 BD Biosciences；NorthernLightsTMAnti-mouse IgG-NL493（產(chǎn)品號(hào)NL009）購(gòu)自R&D Systems。

1.2 主要儀器 Cell-IQ無(wú)標(biāo)記活細(xì)胞影像分析系統(tǒng)（CM Technologies）；-86℃超低溫冰箱（Thermo公司）；水平層流凈工作臺(tái)（上海上凈凈化設(shè)備有限公司）；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司）。

1.3 患者血清的采集 選取2012年6月—2013年1月于我院行肝切除的患者6例，其中肝血管瘤3例，局灶性結(jié)節(jié)性增生（FNH）3例，患者一般資料見表1。6例患者均無(wú)肝炎、肝硬化基礎(chǔ)，且不合并其他疾病。分別留取患者肝切除術(shù)前和肝切除術(shù)后0.5、3、24、72 h血清，-86℃凍存?zhèn)溆?。取血及其用途?jīng)患者本人知情同意，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意。

Tab.1 General information of the patients who provided serum表1 提供血清患者一般資料

1.4 HL-7702細(xì)胞培養(yǎng)液的配制及細(xì)胞培養(yǎng)方法 本實(shí)驗(yàn)常規(guī)采用RPMI 1640培養(yǎng)基添加10%FBS作為HL-7702細(xì)胞的培養(yǎng)液。本實(shí)驗(yàn)中不同培養(yǎng)組的HL-7702細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中分別添加10%FBS及肝切除患者術(shù)前、術(shù)后0.5、3、24和72 h血清。HL-7702細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及傳代：37℃水浴預(yù)熱培養(yǎng)基；從液氮中取出凍存細(xì)胞放入37℃水浴快速解凍后在超凈臺(tái)中加入5 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min；棄上清，加入5 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入T25培養(yǎng)瓶中，輕輕晃勻；置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)，將細(xì)胞傳代至24孔培養(yǎng)板中；在超凈臺(tái)中，棄掉舊培養(yǎng)基，加入2～5 mL PBS清洗細(xì)胞后，再加入1 mL胰酶消化細(xì)胞；顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓，有細(xì)胞開始脫離瓶壁時(shí)，加入5 mL新培養(yǎng)基終止消化；將細(xì)胞移入離心管中，1 000 r/min離心5 min；棄上清，加入新培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度約1×105/孔，混勻細(xì)胞懸液，確保細(xì)胞均勻分布。

1.5 Cell-IQ無(wú)標(biāo)記活細(xì)胞影像分析系統(tǒng)觀察細(xì)胞增殖 傳代至24孔板中（約1×105/孔）的細(xì)胞貼壁24 h后，PBS洗滌3遍，更換為含10%FBS或肝切除術(shù)前、術(shù)后不同時(shí)間血清的RPMI 1640培養(yǎng)基（1 mL/孔）。每種血清培養(yǎng)4孔細(xì)胞，將培養(yǎng)板放入Cell-IQ無(wú)標(biāo)記活細(xì)胞影像分析系統(tǒng)中連續(xù)培養(yǎng)72 h，每1 h采集圖像1次。

1.6 BrdU免疫熒光染色 細(xì)胞培養(yǎng)終止前，在培養(yǎng)液中加入BrdU（終濃度為10 μmol/L），37℃下繼續(xù)培養(yǎng)60 min。吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌3次后加入95%乙醇1 mL/孔。固定30 min。吸棄后PBS洗滌3次，然后加入新鮮配制的2 mol/L的鹽酸1 mL/孔，37℃孵育20 min。吸棄并PBS洗滌3次，加入0.1%TritonX-100 200 μL/孔，室溫透膜20 min。吸棄并PBS洗滌3次后，1%BSA封閉1 h。然后加入小鼠抗人BrdU單克隆抗體（工作濃度1∶100）200 μL/孔，4℃過(guò)夜。吸棄并PBS洗3次，加入NorthernLightsTMAnti-mouse IgG（1∶200稀釋），4℃放置2 h。PBS洗滌3次，加入0.5 μg/L DAPI，染核1 min，PBS洗滌后熒光顯微鏡下觀察。在顯微鏡下隨機(jī)讀取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Fig.1 Proliferation of HL-7702 cell cultured for 72 h in different groups（×40）圖1 HL-7702細(xì)胞在不同血清中培養(yǎng)72 h后細(xì)胞增殖情況（×40）

2.1 各組HL-7702細(xì)胞增殖情況比較 在FBS和人血清培養(yǎng)條件下HL-7702細(xì)胞均有增殖，術(shù)后72 h血清組HL-7702細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡，見圖1。從72 h細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增趨勢(shì)圖可見，除術(shù)后72 h血清組外，其余人血清組HL-7702細(xì)胞增殖速度均明顯高于FBS組；術(shù)后0.5 h和3 h血清組HL-7702細(xì)胞增殖速度明顯高于術(shù)前血清組，術(shù)后24 h血清組肝細(xì)胞增殖速度又降至接近術(shù)前血清水平，術(shù)后72 h血清組HL-7702細(xì)胞增殖速度已經(jīng)明顯低于術(shù)前血清組，見圖2。除術(shù)后72 h血清組外，其余人血清組72 h內(nèi)細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)均高于FBS組；術(shù)后0.5 h和術(shù)后3 h血清組高于術(shù)前血清組（均P＜0.05），術(shù)后24 h血清組與術(shù)前血清組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)后72 h血清組低于術(shù)前血清組（P＜0.05），見表2。

Fig.2 The chart of HL-7702 cell volume expansion trend cultured in different serum groups圖2 不同血清培養(yǎng)HL-7702細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增趨勢(shì)圖

2.2 各組HL-7702細(xì)胞BrdU增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果 人血清組HL-7702細(xì)胞BrdU陽(yáng)性率均高于FBS組，術(shù)后0.5 h和術(shù)后3 h血清組細(xì)胞BrdU陽(yáng)性率高于術(shù)前血清組（均P＜0.05），術(shù)后24 h和術(shù)后72 h血清組細(xì)胞BrdU陽(yáng)性率與術(shù)前血清組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2、圖3。

Tab.2 Comparison of amplification and BrdU positive rate of HL-7702 cells cultured in different serum表2 各組HL-7702細(xì)胞培養(yǎng)72 h后擴(kuò)增倍數(shù)和BrdU陽(yáng)性率的比較 （n=5±s）

Tab.2 Comparison of amplification and BrdU positive rate of HL-7702 cells cultured in different serum表2 各組HL-7702細(xì)胞培養(yǎng)72 h后擴(kuò)增倍數(shù)和BrdU陽(yáng)性率的比較 （n=5±s）

＊＊P＜0.01；a與FBS組比較，b與術(shù)前血清組比較，P＜0.05

擴(kuò)增倍數(shù)BrdU陽(yáng)性率（%）組別2.15±0.24 5.52±0.35a6.09±0.48ab6.06±0.46ab5.68±0.23a2.45±0.45b132.796＊＊17.98±2.73 31.09±1.24a44.92±4.09ab38.79±0.22ab32.01±0.45a27.70±0.96a21.615＊＊FBS組術(shù)前血清組術(shù)后0.5 h血清組術(shù)后3 h血清組術(shù)后24 h血清組術(shù)后72 h血清組F

3 討論

3.1 人血清促HL-7702細(xì)胞增殖能力較FBS更強(qiáng) 由于動(dòng)物源性血清培養(yǎng)人類細(xì)胞將來(lái)應(yīng)用于臨床時(shí)可能面臨動(dòng)物源性病原感染及異種免疫排斥等問(wèn)題，現(xiàn)在已越來(lái)越多地采用人血清代替FBS來(lái)培養(yǎng)人類細(xì)胞。Dahl等［4］研究顯示自體血清培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在維持表型和基因型穩(wěn)定性方面要優(yōu)于FBS。Fani等［5］研究顯示在誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中采用人血清比FBS誘導(dǎo)效率更高。Goodarzi等［6］將自體人血清和FBS在雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)中進(jìn)行了對(duì)比，顯示兩者在維持細(xì)胞數(shù)量、純度和活性方面無(wú)明顯差別，認(rèn)為自體人血清在雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)中能夠很好地替代FBS。Mazlyzam等［7］的研究顯示人血清和FBS同時(shí)培養(yǎng)人纖維母細(xì)胞14 d時(shí)，人血清培養(yǎng)的細(xì)胞較FBS多擴(kuò)增近1倍。到目前為止，人血清已經(jīng)應(yīng)用于包括胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、皮膚纖維母細(xì)胞、結(jié)膜上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的維持培養(yǎng)中，但尚少見人血清在肝細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，采用人血清培養(yǎng)（除術(shù)后72 h血清組）的HL-7702細(xì)胞在培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)約為FBS的3倍，且細(xì)胞BrdU陽(yáng)性率明顯高于FBS組，表明人血清培養(yǎng)的細(xì)胞DNA復(fù)制更活躍，人血清具有更強(qiáng)的促肝細(xì)胞增殖的作用，其原因可能是人血清所含的同源性生長(zhǎng)因子較FBS所含的異源性生長(zhǎng)因子更能發(fā)揮其生理作用，同源性生長(zhǎng)因子之間的相互作用更能夠增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)。

3.2 肝切除術(shù)后血清促肝細(xì)胞增殖作用具有明顯的時(shí)效性 結(jié)果顯示，術(shù)后0.5和3 h血清組細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)及BrdU陽(yáng)性率均高于術(shù)前血清組，而術(shù)后24 h血清組細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)和BrdU陽(yáng)性率與術(shù)前血清組無(wú)明顯差異，術(shù)后72 h血清組細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)低于術(shù)前血清組，BrdU陽(yáng)性率與術(shù)前血清組無(wú)明顯差異，提示肝切除術(shù)后0.5和3 h血清較術(shù)前血清培養(yǎng)的細(xì)胞DNA復(fù)制更活躍，細(xì)胞增殖更快，術(shù)后24 h血清的促增殖作用已經(jīng)下降至接近術(shù)前血清水平。早期研究證實(shí)，肝部分切除術(shù)后除了肝組織內(nèi)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子水平發(fā)生迅速變化，外周血中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、去甲腎上腺素、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6、膽汁酸、胰島素、瘦素等也會(huì)迅速發(fā)生變化，在早期啟動(dòng)肝組織再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用［8］。Lindroos等［9］研究顯示，大鼠外周血中HGF在肝切除術(shù)后1 h即迅速升至峰值。Matsumoto等［10］通過(guò)對(duì)人親體肝移植供體肝切除后血清中細(xì)胞因子水平變化的觀察發(fā)現(xiàn)，在肝切除術(shù)后早期的外周血中HGF、瘦素和巨噬細(xì)胞集落刺激因子明顯升高，提示這些細(xì)胞因子在該時(shí)期肝細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果可能預(yù)示著肝切除術(shù)后0.5 h外周血中即已經(jīng)出現(xiàn)了促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子。肝切除術(shù)后24 h外周血中促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子水平可能已經(jīng)開始下降，或者此時(shí)抑制肝細(xì)胞增殖的一些因子已經(jīng)出現(xiàn)，而術(shù)后72 h外周血中抑制肝細(xì)胞增殖的因子進(jìn)一步增加。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β是肝再生的強(qiáng)力負(fù)性調(diào)控因子，對(duì)抑制肝細(xì)胞無(wú)限制生長(zhǎng)發(fā)揮著重要作用。但TGF-β在肝切除術(shù)后4 h就開始升高，術(shù)后72 h達(dá)高峰，并不是在肝細(xì)胞增殖接近尾聲時(shí)才開始發(fā)揮作用［11］。TGF-β除了能夠抑制肝細(xì)胞增殖，還能夠通過(guò)Smad和p38/MAPK途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡［12］。這可能也是本研究中雖然術(shù)后72 h血清組BrdU陽(yáng)性率較術(shù)前血清組無(wú)明顯差別，但擴(kuò)增倍數(shù)明顯減少的主要原因。

本實(shí)驗(yàn)直觀地展示了肝切除術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間血清對(duì)肝細(xì)胞增殖能力的影響，也從一定程度上揭示了肝切除術(shù)后不同時(shí)間肝細(xì)胞增殖的情況。但肝切除術(shù)后不同時(shí)間血清對(duì)細(xì)胞凋亡的影響以及血清成分的變化仍然需要進(jìn)一步研究。

（圖3見插頁(yè)）

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（2016-05-01收稿 2016-07-04修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Effects of serum came from hepatectomized patient on proliferation of cultured hepatocytes

XING Qianzhe1，GAO Yingtang2，LUO Ying2，WANG Yijun1，DU Zhi1△
1 Department of Hepatobiliary Surgery，2 Key Laboratory of Artificial Cell，The Third Central Hospital of Tianjin，Tianjin 300170，China△

Objective To observe the influence of peripheral serum came from patients with hepatectomy at different time points on hepatocyte proliferation in vitro.Methods According to the different types of cultured serum，cultured HL-7702 cells were divided into fetal bovine serum（FBS）group，preoperative serum group，0.5 h，3 h，24 h and 72 h post operative serum groups.All groups of cells were cultured for 72 hours in the Cell-IQ unmarked living cell image analysis system，and the amplification curves of each group were mapped by continuous counting of cells.The cell amplification multiple was compared between all groups after culturing for 72 hours.BrdU immunofluorescence staining was performed and BrdU positive rate was calculated for comparing the cell proliferation of all groups.Results Amplification curves showed that HL-7702 cell proliferation rates of all human serum groups except for 72 h post operative group were higher than those of FBS group.Human serum 0.5 h and 3 h postoperative groups were more obvious.The amplification multiples of human serum groups，except for 72 h post operative group were all significantly higher than those of FBS group（P＜0.01），and 0.5 h and 3 h post operative groups were both significantly higher than those of preoperative group（P＜0.05）.BrdU positive rates of all human serum groups were significantly higher than those of FBS group（P＜0.01），which were significantly higher in 0.5 h and 3 h post operative groups than those of preoperative group（P＜0.05），but there were no statistical differences between 24 h and 72 h post operative groups and the preoperative group.Conclusion Human serum can promote the proliferation of hepatocytes compared with that of FBS.The influence of serum acquired post hepatectomy is closely associated with the post operative time.

hepatocytes；cell proliferation；hepatectomy；serum

R333.4

A

10.11958/20160363

天津市衛(wèi)生局科技基金資助項(xiàng)目（2013KR01）

1天津市第三中心醫(yī)院肝膽外科（郵編300170），2人工細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

邢謙哲（1975），男，主治醫(yī)師，博士，主要從事干細(xì)胞向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化方面的研究

△通訊作者 E-mail:zhi-du@163.com