小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1培養(yǎng)與四聯(lián)誘導(dǎo)分化方法的探討

孫慧誌，田德潤(rùn)△，孟潔，趙楠，韓潔，甘椿椿，王勇

小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1培養(yǎng)與四聯(lián)誘導(dǎo)分化方法的探討

孫慧誌1，田德潤(rùn)1△，孟潔2，趙楠2，韓潔1，甘椿椿3，王勇2

目的 改進(jìn)小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1的培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞的方法。方法 使用含有10%胎牛血清（FBS）的高糖型DMEM液體培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)小鼠前脂肪細(xì)胞，2～3 d換液1次。細(xì)胞按誘導(dǎo)分化方式的不同分為三聯(lián)誘導(dǎo)組和四聯(lián)誘導(dǎo)組。三聯(lián)誘導(dǎo)組誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ成分為常規(guī)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加用人胰島素10 mg/L，1-甲基-3-異丁基黃嘌呤（IBMX）0.5 mmol/L，地塞米松（DEX）1.0 μmol/L；四聯(lián)誘導(dǎo)組誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ的成分為在三聯(lián)誘導(dǎo)組基礎(chǔ)上加入吲哚美辛0.1 mmol/L。2組均誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ培養(yǎng)2 d，連續(xù)誘導(dǎo)2次后換用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅱ，成分為：高糖型DMEM培養(yǎng)基含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素混合液，人胰島素10 mg/ L。培養(yǎng)2 d，連續(xù)誘導(dǎo)2次。倒置顯微鏡和油紅O染色觀察誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后2組細(xì)胞的形態(tài)變化。結(jié)果 小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1狀態(tài)良好，呈現(xiàn)鋪路石狀生長(zhǎng)，均勻布滿培養(yǎng)瓶底，2 d傳代1次。四聯(lián)誘導(dǎo)組誘導(dǎo)分化結(jié)果優(yōu)于三聯(lián)誘導(dǎo)組。三聯(lián)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)并未發(fā)生明顯變化。四聯(lián)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞后，可達(dá)到90%以上的成熟脂肪細(xì)胞。成熟的脂肪細(xì)胞呈圓形，有大量脂滴聚集，油紅O染色顯現(xiàn)橘紅色。結(jié)論 在三聯(lián)誘導(dǎo)基礎(chǔ)上加入吲哚美辛的四聯(lián)誘導(dǎo)法可以更好地促進(jìn)脂肪前體細(xì)胞分化。

脂細(xì)胞；體外研究；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；3T3-L1細(xì)胞

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活方式的改變，低運(yùn)動(dòng)、高攝入、久坐等不良生活方式導(dǎo)致的肥胖已成為一個(gè)全球性的問題［1］。2010年我國(guó)成人超重率為29.3%，肥胖率為5.7%［2］。研究認(rèn)為，肥胖癥可以導(dǎo)致血脂異常、高血壓、冠心病、糖尿病、呼吸睡眠暫停、骨關(guān)節(jié)炎、部分腫瘤（如乳腺癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌）等一系列并發(fā)癥［3-4］，但具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1是首選的研究脂肪細(xì)胞分化的模型細(xì)胞，被廣泛應(yīng)用于肥胖的機(jī)制以及相關(guān)疾病的藥物篩選研究［5］。目前，常用的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化脂肪細(xì)胞的方法多為三聯(lián)誘導(dǎo)法，但該方法的誘導(dǎo)和分化效果并不理想。本研究旨在采用四聯(lián)誘導(dǎo)法優(yōu)化3T3-L1的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化，以期為肥胖藥物開發(fā)和研究提供更好的模型。

1 材料與方法

1.1 主要材料 小鼠前脂肪細(xì)胞系3T3-L1由天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室段宏泉教授饋贈(zèng)。高糖型 Dulbecco’5 modified Eagle’s medium（DMEM）液體培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，牛血清（FBS）購(gòu)自Hyclone公司；青霉素鈉100 U/mL，硫酸鏈霉素100 mg/L，0.25%胰蛋白酶含0.53 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）消化液購(gòu)自Bioroc公司，二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Amresco公司，油紅O購(gòu)自Solarbio公司；人胰島素購(gòu)自Biological Industries公司，1-甲基-3-異丁基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）及吲哚美辛購(gòu)自Sigma公司。10%甲醛PBS（成分：分析純甲醛10 mL、1×PBS緩沖液90 mL）購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ，成分：高糖型DMEM培養(yǎng)基含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素混合液，人胰島素10 mg/L，IBMX 0.5 mmol/L，DEX 1.0 μmol/L。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅱ，成分：高糖型DMEM培養(yǎng)基含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素混合液，人胰島素10 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，伸出偽足呈梭形，胞漿均勻細(xì)膩，無脂滴，細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞誘導(dǎo)分化 小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1生長(zhǎng)至完全匯合后開始計(jì)時(shí)，接觸抑制2 d即誘導(dǎo)分化0 d開始，細(xì)胞按誘導(dǎo)分化方式的不同分為2組。（1）三聯(lián)誘導(dǎo)組。誘導(dǎo)分化0 d起加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ，2 d后更換新的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ，繼續(xù)培養(yǎng)2 d后換成誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅱ，2 d后更換新的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅱ，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，完成誘導(dǎo)分化過程。（2）四聯(lián)誘導(dǎo)組。原誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ中加入吲哚美辛0.1 mmol/L，余誘導(dǎo)方法和步驟同三聯(lián)誘導(dǎo)組。

1.2.3 結(jié)果觀察 倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后2組的細(xì)胞形態(tài)。油紅O染色：染色前將飽和油紅O原液按 3∶2（油紅O∶蒸餾水）加入去離子水，混勻，配制工作液，室溫放置5～10 min，過濾后使用。將誘導(dǎo)完成后的細(xì)胞棄去原培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定10 min，去離子水充分洗滌，60%異丙醇浸洗，取配制好的油紅O工作液進(jìn)行染色，室溫放置10 min，去離子水沖洗多余的油紅O染料，Mayer蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，去離子水沖洗后顯微鏡下觀察。前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為脂肪細(xì)胞后，使用油紅O染色，可見油紅O將脂滴染成紅色。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)分化前3T3-L1形態(tài) 倒置顯微鏡下可見小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1呈梭形，傳代后約2 h貼壁，4 h可伸出多偽足，呈片狀生長(zhǎng)，24 h長(zhǎng)滿細(xì)胞培養(yǎng)皿底面，呈鋪路石樣排列，可見細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)各不相同，部分處于分裂過程中，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，見圖1。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底面后會(huì)出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象，退出細(xì)胞周期，有絲分裂過程停止，此時(shí)前脂肪細(xì)胞進(jìn)入向成熟脂肪細(xì)胞分化階段，提示此時(shí)可以進(jìn)行誘導(dǎo)劑的分化培養(yǎng)。

Fig.1 The appearance of mouse preadipocytes 3T3-L1 before being induced differentiation（×100）圖1 誘導(dǎo)分化前小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1形態(tài)（×100）

2.2 誘導(dǎo)分化后2組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

2.2.1 三聯(lián)誘導(dǎo)組 誘導(dǎo)分化前，前脂肪細(xì)胞3T3-L1呈梭形的成纖維細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞漿均勻細(xì)膩無脂滴；誘導(dǎo)完成時(shí)，前脂肪細(xì)胞3T3-L1胞漿內(nèi)并未出現(xiàn)明顯的小脂滴，細(xì)胞形態(tài)也并未發(fā)生明顯變化，仍然呈梭形的成纖維細(xì)胞形態(tài)，見圖2。

2.2.2 四聯(lián)誘導(dǎo)組 誘導(dǎo)分化第4天即誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ誘導(dǎo)完成時(shí)，細(xì)胞體積變大、變圓，胞質(zhì)中出現(xiàn)散在細(xì)小脂滴；誘導(dǎo)分化第6天即使用人胰島素誘導(dǎo)分化2 d后，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大、變圓，脂滴聚集明顯增多，分布于細(xì)胞核周圍，形成“戒環(huán)”樣結(jié)構(gòu)，在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒熘炯?xì)胞；誘導(dǎo)分化第8天時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中積聚更多的脂滴，90%以上細(xì)胞已分化成熟，見圖3。

3 討論

小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1是1974年從Swiss 3T3-L1小鼠胚胎中分離克隆的細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有單一分化潛能，體外培養(yǎng)時(shí)適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑作用下可以分化為成熟脂肪細(xì)胞。脂肪細(xì)胞的分化是指胞漿均勻細(xì)膩不含脂滴的前體脂肪細(xì)胞定向分化為胞漿充滿脂滴的成熟脂肪細(xì)胞的過程，其分化過程包括細(xì)胞有絲分裂停止、細(xì)胞形態(tài)增大變圓、脂類合成酶表達(dá)增加、脂質(zhì)聚集以及增加胰島素敏感性等生物學(xué)變化過程［6］。在前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中，各種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式的轉(zhuǎn)變發(fā)揮了重要作用，其中過氧化物增殖活化受體（Peroxisome proliferative activated receptor，PPARs）家 族 和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族（CCAAT/enhance binding proteins，C/EBPs）轉(zhuǎn)錄因子的順序激活開啟了前脂肪細(xì)胞的分化過程，另外轉(zhuǎn)錄因子間的相互調(diào)控也促進(jìn)了脂肪細(xì)胞的成熟［7］。脂肪細(xì)胞分化過程中的相關(guān)分子機(jī)制研究，為能量代謝及相關(guān)代謝疾病發(fā)生的分子機(jī)制和有效治療提供了思路和方法。

本研究顯示，小鼠前體脂肪細(xì)胞3T3-L1在分化過程中，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底面后出現(xiàn)接觸抑制，停止有絲分裂，退出細(xì)胞周期，提示此時(shí)可以進(jìn)行誘導(dǎo)劑的分化培養(yǎng)。傳統(tǒng)的脂肪細(xì)胞觀察方法有2種，即倒置顯微鏡明場(chǎng)下直接觀察脂肪空泡的出現(xiàn)和使用油紅O將脂滴染成紅色后再進(jìn)行觀察。本研究同時(shí)使用了2種方法驗(yàn)證脂肪細(xì)胞的出現(xiàn)，結(jié)果顯示，使用三聯(lián)誘導(dǎo)劑至誘導(dǎo)完成時(shí)，前脂肪細(xì)胞3T3-L1胞漿內(nèi)并未出現(xiàn)明顯的小脂滴，細(xì)胞形態(tài)也并未發(fā)生明顯變化，仍然呈梭形的成纖維細(xì)胞形態(tài)。在四聯(lián)誘導(dǎo)劑的刺激下，前體脂肪細(xì)胞再次進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)入第二輪細(xì)胞分裂，隨后調(diào)控分化的一系列轉(zhuǎn)錄因子相繼表達(dá)，長(zhǎng)梭形細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閳A球形，細(xì)胞體積增大，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴，分布于細(xì)胞核周圍，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，脂滴逐漸由小變大，并融合形成“戒環(huán)”樣結(jié)構(gòu)，最后細(xì)胞進(jìn)入脂滴永久性累積的終端分化狀態(tài)。細(xì)胞形態(tài)的改變與文獻(xiàn)［8］報(bào)道一致。與以往脂肪前體細(xì)胞誘導(dǎo)方法［9］不同，以往的方法中3T3-L1細(xì)胞體外成脂需10 d，本研究誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ加入吲哚美辛0.1 mmol/L，可以在更短的時(shí)間內(nèi)將前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞，并達(dá)到90%以上的誘導(dǎo)成功率。吲哚美辛屬于非甾體類抗炎藥。研究顯示，部分非甾體類藥物具有激活PPARγ的活性［10］。PPARγ是調(diào)控脂肪細(xì)胞分化主要核受體，主要存在于脂肪細(xì)胞中，是脂肪細(xì)胞分化的重要調(diào)控因子，并與胰島素增敏存在密切關(guān)系。吲哚美辛是PPARγ的配體，能夠活化PPARγ，從而發(fā)揮成脂誘導(dǎo)作用［11］。因此，結(jié)合本研究結(jié)果，筆者認(rèn)為加入吲哚美辛可以更好地促進(jìn)脂肪前體細(xì)胞分化。

綜上所述，隨著體外細(xì)胞培養(yǎng)模型的改建與相關(guān)研究的不斷深入，小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1的成功培養(yǎng)和更好的誘導(dǎo)分化是后續(xù)相關(guān)研究的基本前提。本研究為肥胖相關(guān)疾病的藥物開發(fā)和研究，小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化提供了可靠的參考方法。

（圖2、3見插頁(yè)）

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（2016-03-26收稿 2016-05-24修回）

（本文編輯 陸榮展）

Discussion on cultivation and methodology of four-drug combination-induced differentiation in mouse preadipocytes 3T3-L1 cells

SUN Huizhi1，TIAN Derun1△，MENG Jie2，ZHAO Nan2，HAN Jie1，GAN Chunchun3，WANG Yong2
1 Department of Anatomy and Histology and Embryology，2 Department of Pathology，3 Department of Pharmacy，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China△

Objective To optimize and establish the methodology for culturing and inducing differentiation of mouse preadipocytes 3T3-L1.Methods The mouse cells 3T3-L1 were incubated in DMEM medium contained with 10%FBS，during which the incubation medium was refreshed every 2 to 3 days.Two methods were used to introduce differentiation，including three-drug combination group and four-drug combination group.The protocol of mediumⅠin three-drug combination group including insulin 10 mg/L，IBMX 0.5 mmol/L and DEX 1.0 μmol/L.The protocol of mediumⅠin fourdrug combination group including indometacin 0.1 mmol/L based on those of three-drug combination group.Both of them were incubated for 2 days and continuous for 2 times.And mediumⅡincluded insulin 10 mg/L for 2-day culturing and continuous for 2 times.Oil red O staining was used to observe the morphological changes of two groups of cells before and after treatment under inverted microscope.Results Mouse preadipocytes 3T3-L1 appeared in good conditions and grew in a paving stone fashion.These cells covered homogeneously the bottom of incubators，the culture medium refreshed every 2 days.The results of four-drug combination group were better than those of three-drug combination group.After three-drug combination induced differentiation，there was no significant change in cell morphology.Comparing with three-drug combination induced differentiation，four-drug combination was successfully achieved in over 90%of the cell inducing，which were round-shaped，with jacinth ester droplets by oil-red O staining.Conclusion We have optimized the method for culturing and inducing differentiation of mouse preadipocytes 3T3-L1 by adding indometacin on the basis of the three-drug combination induced differentiation.

adipocytes；in vitro；cell culture techniques；3T3-L1 cells

R329.24

A

10.11958/20160214

1國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81270927）；2天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研基金

1天津醫(yī)科大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)系（郵編300070），2病理教研室，3藥學(xué)院

孫慧誌（1998），女，臨床七年制在讀，主要從事肥胖發(fā)生機(jī)制的研究

△通訊作者 E-mail：tianderun@aliyun.com