肽鈣螯合物的工藝研究

楊文博（黑龍江旅游職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，黑龍江哈爾濱150086）

肽鈣螯合物的工藝研究

楊文博
（黑龍江旅游職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，黑龍江哈爾濱150086）

肽鈣螯合物具有第一代、第二代和第三代鈣制劑都無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，探討最佳肽鈣螯合方法：以螯合率為指標(biāo)，對干酪素水解肽和鈣螯合工藝進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明，最佳的螯合條件為肽鈣質(zhì)量比為2∶1，pH為8.0，溫度為50℃，時(shí)間為40min，此時(shí)螯合率為72.78%。螯合率的高低除了以上討論的5個(gè)因素之外，也有可能與蛋白質(zhì)的種類及蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中肽鏈的長短有關(guān)，肽鏈越短，越容易和鈣離子螯合，而本試驗(yàn)在選擇肽粉時(shí)是用復(fù)合酶水解的干酪素，這就使蛋白水解液中可能都是小分子肽，所以螯合率較高。

氯化鈣；螯合；多肽

鈣是人體內(nèi)最重要的礦物質(zhì)元素之一，是機(jī)體維持各項(xiàng)生命活動(dòng)不可或缺無機(jī)元素，它參與人體的新陳代謝，并維持著人體許多細(xì)胞的正常運(yùn)轉(zhuǎn)工作。但人體對鈣并不能夠全部的吸收，通常有70%～80%不能夠被吸收，而隨著人體的代謝排出體外，主要原因是鈣離子與一些事物中的酸性物質(zhì)，例如草酸、脂肪酸等形成不溶于水的鹽物質(zhì)［1］。除此之外，鈣的吸收還與人類年齡、人體的機(jī)能狀態(tài)有關(guān)。

為了提高鈣在人體的吸收利用程度，我國食品行業(yè)主要研發(fā)了三代鈣制劑產(chǎn)品。第一代鈣制劑產(chǎn)品主要以無機(jī)鹽為主，這類鈣制劑產(chǎn)品具有較高的含鈣量，但它消耗了大量的胃酸，引起很大程度的副作用；第二代鈣制劑產(chǎn)品主要以有機(jī)酸鹽為主，這類鈣制劑產(chǎn)品需要有維生素D的參與才可完成，而鈣被人體吸收后大量進(jìn)入血液，導(dǎo)致血清中游離鈣含量的升高，雖說通過維生素D的調(diào)節(jié)，但穩(wěn)定系統(tǒng)會(huì)使鈣的吸收利用收到抑制；第三代鈣制劑主要是氨基酸螯合鈣，雖說這類鈣制劑彌補(bǔ)了第一代和第二代鈣制劑的不足，但它在螯合機(jī)制和轉(zhuǎn)運(yùn)方面與多肽螯合鈣相比就存在著一定的缺陷［2］。

1　材料與儀器

肽粉、碳酸鈣（AR）、氧化鈣（AR）、硫酸鈣（AR）、氯化鈣（AR）：天津市本辰方正試劑廠；氫氧化鈣（AR）：天津博迪化工股份有限公司；丙酮（AR）、乙醇（AR）：上海銀典化工有限公司；二硫腙（AR）、茚三酮（AR）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；真空抽氣泵、FA1004B型電子天平、722S可見分光光度計(jì)、PHS-25C型精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；80-1型沉淀離心機(jī)：上海手術(shù)器械廠；DZKW-8-6型電熱恒溫水浴鍋：北京永光明醫(yī)療儀器廠；DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

2　方法

2.1肽螯合鈣的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

干酪素水解肽粉在常溫下不溶于水，因此本試驗(yàn)設(shè)計(jì)第一步就是要在加熱的情況下將肽粉溶解，并加入鈣源，在一定溫度、pH和一定時(shí)間的條件下將肽鈣螯合，螯合后的產(chǎn)物利用螯合物不溶于有機(jī)溶劑中不溶的原理將肽鈣螯合物離心分離、抽濾并干燥得到螯合物的粗制品。

肽鈣螯合工藝流程如下：

干酪素水解肽粉→蒸餾水溶解，并于37℃保溫10 min使其溶解徹底→按比例加入可溶性鈣源→混勻→調(diào)節(jié)pH→水浴保溫一定時(shí)間進(jìn)行肽鈣的螯合→加入不同體積的有機(jī)溶劑沉淀→離心→沉淀洗滌→離心抽濾→鼓風(fēng)干燥→得干酪素螯合鈣制品［3］。

2.2含鈣物質(zhì)和有機(jī)沉淀劑的選擇

市面上的有機(jī)含鈣物質(zhì)成本費(fèi)用較高，因此本試驗(yàn)針對幾種無機(jī)含鈣物質(zhì)［CaCO3、Ca（OH）2、CaO、Ca－SO4、CaCl2］在一些不同濃度的有機(jī)溶劑（丙酮、乙醇）和水中的溶解程度進(jìn)行探討，來確定本試驗(yàn)最佳鈣源［4］。

2.3單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以干酪素水解肽螯合鈣的螯合率作為指標(biāo)，選取以下因素：肽鈣質(zhì)量比、pH、DH、螯合時(shí)間、螯合溫度和乙醇用量進(jìn)行單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)，反應(yīng)結(jié)束后，將螯合物分離純化后，通過測定其螯合率而確定最佳的螯合條件。

鈣含量的測定選擇EDTA滴定法（GB/T 5009.92-2003《食品中鈣的測定》），螯合率的測定公式如下：

螯合率/%=螯合產(chǎn)物中鈣含量/樣品反應(yīng)物中總鈣含量×100

2.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇肽鈣體積比、pH、DH和時(shí)間這4個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)對螯合工藝進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳的螯合工藝，因素水平設(shè)定見表1。

表1　因素水平編碼表Table 1　The factor levels of design

3　結(jié)果與分析

3.1有機(jī)沉淀劑及鈣源的選擇

本試驗(yàn)在對無機(jī)鈣源CaCO3、Ca（OH）2，CaO、Ca－SO4和CaCl2在水中進(jìn)行溶解比較，除此之外本試驗(yàn)還針對幾種不同鈣源在不同體積分?jǐn)?shù)的無水乙醇和丙酮溶液中的溶解情況進(jìn)行試驗(yàn)而選擇合適的有機(jī)沉淀劑。通過試驗(yàn)比較結(jié)果可知氯化鈣在水中、不同濃度的丙酮和乙醇溶液中都有較高的溶解度，這就有利于肽鈣螯合反應(yīng)的進(jìn)行，也有利于肽鈣螯合物和游離鈣的分離，因此本試驗(yàn)選擇氯化鈣為最佳的鈣源。

3.2單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果與分析

3.2.1肽鈣比對肽鈣螯合率的影響

配位體與金屬離子的質(zhì)量比是影響配位螯合反應(yīng)的一個(gè)重要因素，配位比過高，會(huì)使多肽的利用率下降，不經(jīng)濟(jì)；配位體過低，螯合物不穩(wěn)定。因此，本試驗(yàn)針對不同配位比下的螯合反應(yīng)進(jìn)行了研究，確定最佳的配位比。

將干酪素水解多肽與CaCl2按質(zhì)量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1進(jìn)行混合，調(diào)節(jié)pH8.0，充分?jǐn)嚢枋蛊渚鶆颍?0℃下水浴保溫40 min，之后加入8倍體積的無水乙醇，離心，抽濾，鼓風(fēng)干燥得肽鈣螯合物，測其螯合率，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1　 肽鈣質(zhì)量比對螯合率的影響Fig.1　The effects of peptide calcium quality on chelating rate

從圖1可以看出，質(zhì)量比對螯合率影響很大，當(dāng)肽鈣質(zhì)量比達(dá)到2∶1～3∶1時(shí)，反應(yīng)體系中螯合率比較平緩，并達(dá)到最大值，隨后，隨著質(zhì)量比的增加，螯合率反而下降，因此，本試驗(yàn)證明肽鈣質(zhì)量比為2∶1～3∶1為螯合最佳的肽鈣配位比。

3.2.2pH值對肽鈣螯合率的影響

將干酪素水解多肽與CaCl2按質(zhì)量比3∶1進(jìn)行混合，調(diào)節(jié)不同的pH進(jìn)行試驗(yàn)（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），在50℃下水浴保溫40min，之后加入8倍體積的無水乙醇，離心，抽濾，鼓風(fēng)干燥得肽鈣螯合物，測其螯合率［4］，選擇最佳的pH，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，產(chǎn)品的螯合率隨著pH的升高而增大，到后來慢慢的趨于平緩，在堿性條件下的肽鈣的螯合率明顯高于酸性條件。當(dāng)pH小于8.0時(shí)，肽鈣的螯合率不高，當(dāng)pH在8.0～10.0之間時(shí)，肽鈣螯合率比較平緩，不會(huì)下降，但是堿性過強(qiáng)，而且產(chǎn)生的氫氧化鈣沉淀，這些都會(huì)使產(chǎn)物產(chǎn)生一種不愉快的堿味，所以經(jīng)本試驗(yàn)驗(yàn)證，肽鈣螯合的最佳pH為8.0～9.0。

圖2　pH對螯合率的影響Fig.2　The influence of pH value of chelating rate

3.2.3溫度對肽鈣螯合率的影響

將干酪素水解多肽與CaCl2按質(zhì)量比3∶1進(jìn)行混合，調(diào)節(jié)pH8.0，充分?jǐn)嚢枋蛊渚鶆?，分別在不同溫度下水浴保溫40 min（20、30、40、50、60℃），之后加入8倍體積的無水乙醇，離心，抽濾，鼓風(fēng)干燥得肽鈣螯合物，測其螯合率，選擇最佳的螯合溫度，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3　 溫度對螯合率的影響Fig.3　The influence of temperature on the chelating rate

從圖3可以看出，螯合率隨著溫度值的升高先增大后減小，在30℃～50℃時(shí)，螯合率明顯呈上升的趨勢，但當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，肽鈣螯合率將明顯下降。說明溫度過高不利于螯合反應(yīng)的進(jìn)行，升高溫度可能會(huì)使蛋白質(zhì)變性或使螯合物分解，也可能產(chǎn)生其他的反應(yīng)。由此可見，螯合的最佳溫度是50℃左右。

3.2.4時(shí)間對肽鈣螯合率的影響

將干酪素水解多肽與CaCl2按質(zhì)量比3∶1進(jìn)行混合，調(diào)節(jié)pH8.0，充分?jǐn)嚢枋蛊渚鶆?，?0℃溫度下水浴保溫20、30、40、50、60 min，之后加入8倍體積的無水乙醇，離心，抽濾，鼓風(fēng)干燥得肽鈣螯合物，測其螯合率，選擇最佳的螯合時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，隨著時(shí)間的延長，螯合率是先增大后減小，在40 min時(shí)，肽鈣的螯合率最大。有些文獻(xiàn)報(bào)道，時(shí)間對螯合反應(yīng)沒有多大的影響，但本試驗(yàn)經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間延長，螯合率的走勢呈拋物線的形狀，這說明肽鈣螯合物的生成是通過吸附反應(yīng)發(fā)生著動(dòng)態(tài)的吸附和解析的過程，在反應(yīng)前期，吸附反應(yīng)大于解析反應(yīng)，肽鈣進(jìn)行著螯合，隨著時(shí)間的延長，解析反應(yīng)占主導(dǎo)，這就不利于肽鈣的螯合，在40 min時(shí)，這種吸附解析過程達(dá)到了動(dòng)態(tài)的平衡。因此，肽鈣螯合的最佳時(shí)間是40 min。

圖4　時(shí)間對螯合率的影響Fig.4　The effects of time on chelating rate

3.2.5沉淀劑用量對肽鈣螯合率的影響

用無水乙醇沉淀分離螯合物時(shí)，沉淀劑的用量對產(chǎn)物的得率有一定的影響。因此，本試驗(yàn)將干酪素水解多肽與CaCl2按質(zhì)量比3∶1進(jìn)行混合，調(diào)節(jié)pH8.0，充分?jǐn)嚢枋蛊渚鶆?，?0℃溫度下水浴保溫40 min之后，分別加入一定體積的無水乙醇（體系中乙醇濃度為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%）沉淀螯合物，離心，抽濾，鼓風(fēng)干燥得肽鈣螯合物，測其螯合率，確定最佳的沉淀劑用量，試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5　無水乙醇濃度對螯合率的影響Fig.5　The effects of anhydrous ethanol concentration on chelating rate

從圖5可以看出，當(dāng)無水乙醇的濃度低于80%時(shí)，隨著無水乙醇的加入，螯合率有明顯的增加，但是當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，繼續(xù)增加無水乙醇的用量，螯合率的變化不大。說明加入無水乙醇的量不足的話，乙醇會(huì)被溶液中的水稀釋，一定量的螯合物會(huì)溶解到乙醇-水溶液中，造成螯合物的損失；所以無水乙醇的加入量越多，螯合物分離的效果越好，但是，當(dāng)無水乙醇加到一定量的時(shí)候，在繼續(xù)加入無水乙醇，螯合物的得率不再變化，如果此時(shí)在繼續(xù)加入乙醇，勢必會(huì)造成不必要的浪費(fèi)。綜上所述，沉淀劑無水乙醇的用量最好的是80%即可。

3.3正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇肽鈣質(zhì)量比、pH、干酪素水解度和螯合時(shí)間這4個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對螯合工藝進(jìn)行優(yōu)化，刪選出最佳肽鈣螯合條件。

干酪素水解多肽螯合鈣正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2　The results of orthogonal experiment

由表2可知，肽鈣比、pH、螯合溫度、螯合時(shí)間對肽鈣螯合率均有影響，影響的次序依次為肽鈣比＞pH值＞螯合溫度＞螯合時(shí)間，最佳組合條件為A1B2C2D2，即肽鈣質(zhì)量比為2∶1、pH為8.0，螯合溫度為50℃，螯合時(shí)間為40 min，此時(shí)多肽螯合鈣的螯合率為72.78%。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)方差分析，找出影響肽鈣螯合的極顯著因素和顯著因素，正交試驗(yàn)方差分析表見表3。

表3　 正交試驗(yàn)方差分析表Table 3　Orthogonal experiment anova table

從表3方差分析結(jié)果可知，肽鈣比對螯合率影響最大，呈極顯著水平，pH對肽鈣螯合率的影響次之，呈顯著水平。

4　結(jié)論

在肽鈣螯合鈣制品工藝研究中，通過選擇合適的鈣源，嚴(yán)格控制肽鈣質(zhì)量比、溫度、pH和時(shí)間這些螯合條件，選擇無水乙醇作為有機(jī)沉淀劑，分離沉淀肽鈣制品，本課題通過單因素試驗(yàn)和四因素三水平正交試驗(yàn)，確定最佳螯合工藝為鈣源選擇為氯化鈣，有機(jī)沉淀劑為無水乙醇且無水乙醇的用量為80%，肽鈣質(zhì)量比為2∶1，pH為8.0，螯合溫度為50℃，時(shí)間為40 min，這就得到螯合率為72.78%的肽鈣螯合制品。

［1］于平，勵(lì)建榮.補(bǔ)鈣劑的現(xiàn)狀及營養(yǎng)評價(jià)方法［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2002，2（1）：57-61

［2］曾敏莉，周遠(yuǎn)大.鈣制劑的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢［J］.兒童藥學(xué)雜志，2004，10（3）：16-18

［3］孫莉潔，梁金鐘.響應(yīng)面法優(yōu)化大豆肽與鈣離子螯合的研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2010，25（1）：22-27

［4］原龍，王新.牛奶中酪蛋白和乳糖的分離方法研究［J］.應(yīng)用化工，2009，38（3）：389-394

Study on the Process of Peptide Calcium Chelate

YANG Wen-bo
（Department of Biological Engineering，Heilongjiang Vocational College of Tourism，Harbin 150086，Heilongjiang，China）

Calcium peptide chelate has at present，the first generation，second and third generation calcium preparations are incomparable advantages，this topic discusses the best method of peptide chelate calcium：with the aojiang rate as index，hydrolysis of casein peptide and calcium aojiang process was studied，the results showed that，the best aojiang eligible for peptide calcium quality ratio of 2∶1，pH 8.0，temperature of 50℃，time of 40 min，the rock at a rate of 72.78%.Rock and rate of five factors in addition to the above discussion，it is also possible and the types of protein and protein hydrolysate in the length of the peptide chain，the shorter the peptide chain，the easier and calcium aojiang，and this study choose the casein hydrolysis enzyme is a complex enzyme，this makes may be small molecular peptide protein hydrolysate，so the aojiang rate is higher.

calciumchloride；chelate；polypeptide

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.034

楊文博（1983—），女（漢），中級講師，碩士，研究方向：食品檢驗(yàn)檢測。

2015-08-19