不溶性葡聚糖的研究進(jìn)展

韓瑨，吳正鈞，，鄢明輝，高彩霞，吳申懋（.乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海0046；.上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，上海0046；.光明乳業(yè)研究院光明乳業(yè)股份有限公司，上海0046）

不溶性葡聚糖的研究進(jìn)展

韓瑨1，吳正鈞1，2，鄢明輝2，高彩霞3，吳申懋3
（1.乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200436；2.上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，上海200436；3.光明乳業(yè)研究院光明乳業(yè)股份有限公司，上海200436）

不溶性葡聚糖是一類(lèi)不溶于水或堿溶液的葡萄糖多聚物，主要由微生物產(chǎn)生的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶催化蔗糖合成而來(lái)，其主鏈通常由葡萄糖以α-（1，3）、α-（1，6）、β-（1，3）或β-（1，4）糖苷鍵鍵合而成。本文從來(lái)源、功能與應(yīng)用、調(diào)控的角度總結(jié)了不溶性葡聚糖的研究進(jìn)展，并對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

不溶性葡聚糖；來(lái)源；功能；應(yīng)用；調(diào)控

不溶性葡聚糖（insoluble glucan，簡(jiǎn)稱(chēng)IG）是一類(lèi)不溶于特定溶劑（通常為水溶液或堿溶液）的葡萄糖多聚物，這種碳水化合物不但來(lái)源廣泛，在植物、真菌以及細(xì)菌的代謝產(chǎn)物中均有報(bào)道，而且種類(lèi)繁多，根據(jù)分子構(gòu)型的不同可分為：α-葡聚糖（α-glucan）［1］和β-葡聚糖（β-glucan）［2］，其葡萄糖殘基大多以α-（1，3）［3］、α-（1，6）［4］、β-（1，3）［5］或β-（1，4）［6］糖苷鍵連接而成，此外，根據(jù)溶解特性差異還有水不溶性葡聚糖（water-insoluble glucan，簡(jiǎn)稱(chēng)WIG）［7］和堿不溶性葡聚糖（alkaliinsoluble glucan，簡(jiǎn)稱(chēng)AIG）［8］之分。如細(xì)菌來(lái)源的IG主要來(lái)自糖苷水解酶第70家族（glycoside-hydrolase family 70）中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase，簡(jiǎn)稱(chēng)GTF）的合成作用，這些GTF主要存在于胞外生境中［9］或被錨定于胞壁上［10］，負(fù)責(zé)內(nèi)源性前體物質(zhì)（如短鏈葡聚糖）［11］和終產(chǎn)物（IG）［12］的合成。目前報(bào)道較多的IG有dextran、curdlan和cellulose 3種，其多糖結(jié)構(gòu)如圖1所示，與可溶性葡聚糖相比，IG因其狹隘的應(yīng)用范圍而少人問(wèn)津，因此，本文將從來(lái)源，功能以及合成調(diào)控角度對(duì)IG的研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1　不溶性葡聚糖的來(lái)源

不溶性葡聚糖的部分來(lái)源如表1所示，不難看出，植物中的IG主要存在于谷物，且均為β-構(gòu)型的WIG，研究表明，谷物中WIG的含量取決于谷物的品系，如Cyril和PS-100品系燕麥的WIG含量可達(dá)26.7%～28.2%，小米（Panicum miliaceum L.）、蕎麥（Fagopyrum）和莧屬植物（Amaranthus sp.L.）次之，為20%左右［2］。

與植物來(lái)源的IG相比，真菌IG的構(gòu)型、溶解特性以及分布范圍更具多樣性。以霉菌為例，來(lái)自不同種霉菌的IG往往構(gòu)型和溶解特性各異，如文氏曲霉（As－pergillus wentii）產(chǎn)水不溶性（1→3）-α-glucan［13］，樟疫霉（Phytophthora cinnamo）和枝頂孢雷（Acremonium diospyri）產(chǎn)的（1→3）-β-glucan分別是水不溶性和堿不溶性的［14-15］，而木霉（Trichoderma longibrachiatum）的WIG屬于（1→4）-β-glucan［16］。除霉菌以外，茯苓、虎奶菇、釀酒酵母等一些可食用真菌也是真菌類(lèi)IG的重

要來(lái)源［3，17-18］。

圖1　3種典型的不溶性葡聚糖：（A）右旋糖苷、（B）熱凝膠多糖、（C）纖維素Fig.1　Three typical insoluble-glucan：（A）dextran，（B）curdlan，（C）cellulose

表1　 不溶性葡聚糖的部分來(lái)源Table 1　Partial sources of insoluble glucan

有別于植物和真菌IG，細(xì)菌類(lèi)IG的構(gòu)型極為豐富，基本涵蓋了所有已知的構(gòu)型，但都是水不溶性多糖。在這些產(chǎn)IG的細(xì)菌中，鏈球菌屬細(xì)菌，尤其是變異鏈球菌（Streptococcus mutans），因其代謝產(chǎn)物水不溶性α-glucan的致齲性而成為最早引起人們關(guān)注的對(duì)象［19］，隨著IG研究的不斷深入，明串珠菌（Leuconostoc）［20］、芽孢桿菌（Bacillus）［5］等也先后加入了IG產(chǎn)生菌的行列，進(jìn)而成為研究的新熱點(diǎn)。

2　不溶性葡聚糖的功能與應(yīng)用

2.1免疫調(diào)控作用

目前有關(guān)IG功能與應(yīng)用的研究主要集中于免疫調(diào)控作用。Cassone等發(fā)現(xiàn)，以不同碳源培養(yǎng)獲得的白念珠菌（Candida Albicans）菌株，其細(xì)胞壁上可溶性和不溶性組分（β-glucan）的比例有差異，并且，胞壁中不溶性組分比例高的細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤作用，表明不溶性β-glucan是酵母細(xì)胞壁上唯一一種具備抗腫瘤活性的組分［30］。SUZUKI等的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，攝入Zymocel（一種酵母來(lái)源的IG）可引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而通過(guò)活化細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和巨噬細(xì)胞來(lái)激活免疫系統(tǒng)［31］。Graubaum等通過(guò)一項(xiàng)關(guān)于β-glucan對(duì)感冒的發(fā)生率和癥狀影響的臨床研究發(fā)現(xiàn)，每天攝入β-glucan不但可以顯著降低感冒的發(fā)生率（P=0.019），而且能明顯緩解咽痛、吞咽困難、聲音嘶啞、咳嗽、流涕等一些典型的感冒癥狀［32］。從枝頂孢霉（Acremonium diospyri）中可提取到AIG和堿溶性葡聚糖（alkali soluble glucan，簡(jiǎn)稱(chēng)ASG）兩類(lèi)葡聚糖，當(dāng)主要組分是（1→3）-β-glucan的WIG作用于印度明對(duì)蝦（Fenneropenaeus indicus）時(shí)，可增加酚氧化酶原（prophenoloxidase）和活性氧中間體（reactive oxygen intermediate）的活性，而以（1→3）-α-glucan為主的ASG卻不具備同樣的免疫刺激活性，因此Anas等認(rèn)為這種免疫刺激的差異主要是由受試樣品（AIG和ASG）中（1→3）-β-glucan含量不同引起的［15］。Maity等通過(guò)對(duì)兩株真菌（Pleurotus florida 和Calocybe indica var.APK2）原生質(zhì)體的融合獲得了雜交蘑菇PCH9FB，其雜交體中提取的水不溶性βglucan對(duì)巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞均有顯著的活化效果［33］。

2.2其他功能與應(yīng)用

除了上述的增強(qiáng)免疫作用外，IG在其他方面也有一定的應(yīng)用價(jià)值。WOOD等利用酶反應(yīng)基本規(guī)律，將燕麥和大麥中提取到的不溶性β-glucan作為底物來(lái)測(cè)定對(duì)應(yīng)酶（β-glucanase）的活性，建立了一種商業(yè)酶制劑中β-glucanase活力的檢測(cè)方法［34］。研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IG每天以小鼠體重0.2%的的劑量通過(guò)口服途徑作用于高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠，6周后受試對(duì)象的體重，糞便pH值，血清中膽固醇、甘油三酯和脂蛋白的含量均有顯著的降低，同時(shí)，腸道內(nèi)的乳桿菌數(shù)量與對(duì)照組相比，也得到明顯的恢復(fù)，這表明IG具有減肥和整腸的雙重特性［35］。通過(guò)2-環(huán)氧丙烷（Epichlorohydrin）處理IG的方法，Vaidya等成功地將IG中的自由羥基轉(zhuǎn)化為能與酶分子中各種基團(tuán)形成共價(jià)鍵的活性環(huán)氧基團(tuán)，環(huán)氧化的IG被用作基質(zhì)來(lái)固定皺褶念珠菌脂肪酶（Candida rugosa lipase）時(shí)，終產(chǎn)物的酶活與得率分別為8 136.7 U/g和59.6%，并且固定后的酶活相當(dāng)穩(wěn)定，4℃保藏條件下的半衰期可達(dá)285 d［36］。

3　不溶性葡聚糖的調(diào)控

3.1抑制IG的合成

傳統(tǒng)藥用植物是自然界中IG合成抑制劑的重要來(lái)源之一，例如民間專(zhuān)治齲齒和牙周疾病的中草藥細(xì)辛（Asarum sieboldii），其水提取物和乙醇提取物均可有效抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)酸及合成IG能力，并顯著降低菌體的吸附性［37］，無(wú)獨(dú)有偶的是，這種抑菌降吸附作用同樣被發(fā)現(xiàn)于云南木香（Saussurea lappa）的乙醇提取物中［38］。和烏龍茶或者綠茶相比，啤酒花球果花托（hop bract）中的高分子多酚類(lèi)物質(zhì)（36 000 Da～40 000 Da）可以更高效地抑制變異鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌中GTF的活性和菌體細(xì)胞的粘附作用，但卻不影響菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酸［39］。除了上述多酚類(lèi)物質(zhì)以外，游離脂肪酸（free fatty acid）［40］、酵素（mutastein）［41］、細(xì)菌素（nisin）［42］、阿卡波糖（acarbose）［43］、鞣酸（tannic acid）［44］等一些結(jié)構(gòu)相對(duì)明確的化合物均可被用于抑制GFT的活性，進(jìn)而阻遏IG的形成。植物內(nèi)生菌（鏈霉菌ST8）的發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取后得到的提取物在一定濃度范圍（0.05 mg/mL～5 mg/mL）內(nèi)可阻止變異鏈球菌ATCC25175和104B在玻璃和唾液包被的羥磷灰石表面吸附［45］。對(duì)于以蔗糖為底物的IG合成反應(yīng)而言，木糖基果糖苷（xylosylfructoside）、麥芽糖基果糖苷（maltosylfructoside）、麥芽糖基蔗糖（maltosylsucrose）、黑曲霉糖基葡萄糖（nigerosylglucose）、異麥芽糖（isomaltose）、異麥芽糖基果糖苷（isomaltosylfructoside）等蔗糖的衍生物或結(jié)構(gòu)類(lèi)似物具有抗IG合成與粘附的功能，而其自身只會(huì)被微生物少量地代謝利用，因此可作為抗齲齒的碳源來(lái)應(yīng)用［46］。憑借單克隆抗體的技術(shù)手段，Ochiai等從骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的雜交細(xì)胞分泌物中篩選GTF的單克隆抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于其他抗體對(duì)GTF無(wú)抑制活性而言，抗體（lgM型免疫球蛋白）29EG的抑制效果可達(dá)50%，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抗體29EG和GTF的結(jié)合位點(diǎn)與其他抗體不同，由此可見(jiàn)，抗體對(duì)GTF的特異性抑制與酶分子上抗原抗體的結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)［47］。有趣的是，中性或堿性條件下幾種特定蛋白（α-casein，albumin）與醛糖（glucose，glyceraldehyde，glycolaldehyde）的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)負(fù)責(zé)合成IG的GTF也有特異性抑制的效果，但不影響可溶性葡聚糖合成酶的活性［48］。

3.2減少I(mǎi)G的積累

采用相應(yīng)的酶對(duì)IG進(jìn)行酶解是減少I(mǎi)G在生物合成后進(jìn)一步積累的最行之有效的方法之一。Ebisu等發(fā)現(xiàn)，胰酪胨培養(yǎng)基經(jīng)黃質(zhì)菌屬菌株Ek-14發(fā)酵后的上清液中，含有一種可特異性?xún)?nèi)切IG中α-（1→3）糖苷鍵的水解酶（mutanase），該酶的等電點(diǎn)與分子量分別為pH 8.5和65 000 Da，在pH6.3、42℃的反應(yīng)條件下的酶解效果最佳，當(dāng)此酶作用于變異鏈球菌OMZ 176來(lái)源的IG時(shí)可釋放出多種糖類(lèi)產(chǎn)物（葡萄糖、異麥芽糖、黑曲霉糖等），從而增強(qiáng)了底物（IG）的可溶性［49］，當(dāng)mutanase濃度達(dá)到40 mU/mL時(shí)即可使貼壁葡聚糖基本完全解體。一項(xiàng)有關(guān)口腔菌以色列放線菌C和黃褐?jǐn)M桿菌來(lái)源的dextranase（EC 3.2.1.11）對(duì)變異鏈球菌IG產(chǎn)量影響的研究指出，濃度為2 mU/mL的酶液可抑制60%IG的形成，濃度為5 mU/mL的酶液可使變異鏈球菌在玻璃表面吸附的機(jī)率降低80%，此外，低濃度酶液對(duì)已吸附在玻璃上的變異鏈球菌也有較強(qiáng)的清除作用（50%～60%）［50］。導(dǎo)致齲齒的鏈球菌通過(guò)合成不溶性的（1→3）-α-glucan和（1→6）-α-glucan來(lái)形成牙齒表面生物膜，進(jìn)而增加菌體在牙齒表面的吸附效果，因此，采用mutanase和dextranase混合作用于可以更有效地控制牙齒表面不溶性葡聚糖生物膜的形成［51］。

3.3促進(jìn)IG的合成

鑒于早期人們對(duì)IG的認(rèn)知僅限于增加細(xì)菌吸附性、形成牙菌斑和造成成齲齒等負(fù)面影響，因此有關(guān)IG調(diào)控的報(bào)道幾乎都是負(fù)向調(diào)控研究，而促進(jìn)IG的合成卻極少關(guān)注。Mukasa等發(fā)現(xiàn)，高濃度的一價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子可大幅刺激WIG的生成，其原理為：（1）提高GTF活性。當(dāng)反應(yīng)體系中缺失和存在反應(yīng)前體dextran時(shí)，高濃度陽(yáng)離子可分別將GTF活性提高1.6和2.7倍；（2）改變反應(yīng)產(chǎn)物特性。在高濃度陽(yáng)離子的影響下，反應(yīng)產(chǎn)物可由原先的可溶性葡聚糖改變?yōu)椴蝗苄云暇厶牵?2］。Fukushima等注意到，利用變異鏈球菌來(lái)源的GTF酶制劑合成IG時(shí)首先會(huì)經(jīng)歷一個(gè)持續(xù)幾分鐘的滯后期，但若在反應(yīng)體系中加入少量外源性的（1→3）-α-glucan即可在不改變反應(yīng)速率的情況下，顯著縮短滯后時(shí)間，研究者指出，這種滯后期縮短的作用具有其特異性，只在合成含有大量α-（1→3）鍵的葡聚糖時(shí)有效［53］。

4　展望

長(zhǎng)久以來(lái)，大量有關(guān)不溶性葡聚糖增加口腔中致齲細(xì)菌粘附性的報(bào)道使IG被視作一類(lèi)有害的微生物代謝產(chǎn)物，甚至有人將IG合成能力作為衡量口腔中變異鏈球菌致齲性的重要指標(biāo)［54］，盡管之后有研究認(rèn)為變異鏈球菌在牙齒表面的粘附作用是GTF和細(xì)胞表面蛋白類(lèi)組分反應(yīng)的結(jié)果，并非與IG的形成有關(guān)［55］，但長(zhǎng)期對(duì)IG的負(fù)面認(rèn)知，加上狹隘的加工性能依然令I(lǐng)G極少被人們所關(guān)注。直到近年來(lái)，借助飛速發(fā)展的研究手段，IG才得以在許多生理功能或產(chǎn)品應(yīng)用方面有了前所未有的“零”的突破，但還存在一些問(wèn)題有待解決：一、導(dǎo)致IG其不溶性發(fā)生的特殊結(jié)構(gòu)或特定機(jī)制有必要進(jìn)一步闡明；二、需要在更多領(lǐng)域深入發(fā)掘IG潛在的功效和應(yīng)用價(jià)值，從而擴(kuò)大IG的應(yīng)用前景；三、通過(guò)篩選高安全性IG產(chǎn)生菌的方法來(lái)拓展IG的來(lái)源，進(jìn)而更好的服務(wù)于可應(yīng)用領(lǐng)域。

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Progress in the Study of Insoluble Glucan

HAN Jin1，WU Zheng-jun1，2，YAN Ming-hui2，GAO Cai-xia3，WU Shen-mao3（1.State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Shanghai 200436，China；2.Shanghai Engineering Research
Center of Dairy Biotechnology，Shanghai 200436，China；3.Dairy Research Institute，Bright Dairy&Foods Co.Ltd.，Shanghai 200436，China）

Insoluble glucan，a typical glucose polymer with α-（1，3）-，α-（1，6）-，β-（1，3）-or β-（1，4）-glycosidic linkage in the backbone，is insoluble in water or alkali solution and mainly biosynthesized by microbial glucosyltransferase catalysing sucrose as the substrate.In this article，the progress in the research and development of insoluble glucan resource，functionality，application and regulation was reviewed and the future perspective is also predicted.

insolubleglucan；resource；functionality；application；regulation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.049

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題：發(fā)酵乳制品乳酸菌菌種與發(fā)酵劑的研究與開(kāi)發(fā)（2013BAD18B01）；“十二五”國(guó)家863項(xiàng)目：優(yōu)良益生菌高效篩選與應(yīng)用關(guān)鍵技術(shù)（2011AA100901）

韓瑨（1980—），男（漢），高級(jí)工程師，碩士，研究方向：乳品科學(xué)。

2015-08-26