桑黃不同組分抗氧化活性的比較分析

楊麗維，楊紅澎，確生，班立桐，*（.天津市林業(yè)果樹(shù)研究所，天津0084；.天津農(nóng)學(xué)院，天津0084；.青海師范大學(xué)民族師范學(xué)院化學(xué)系，青海西寧80008）

桑黃不同組分抗氧化活性的比較分析

楊麗維1，楊紅澎2，確生3，班立桐2，*
（1.天津市林業(yè)果樹(shù)研究所，天津300384；2.天津農(nóng)學(xué)院，天津300384；3.青海師范大學(xué)民族師范學(xué)院化學(xué)系，青海西寧810008）

采用鐵離子還原/抗氧化力測(cè)定法（ferric reducing/antioxidant power assay，F(xiàn)RAP）、鄰苯三酚法、水楊酸法，比較研究桑黃不同極性組分的抗氧化活性。結(jié)果顯示，4種桑黃不同組分體外總抗氧化能力高低順序依次是：水溶性組分＞乙酸乙酯組分＞乙醇組分。在清除羥自由基（·OH）試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)石油醚組分對(duì)羥自由基清除能力最強(qiáng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于水溶性成分，乙酸乙酯組分和乙醇組分也很強(qiáng)。在清除超氧陰離子（O2-·）試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)乙醇組分活性最高，石油醚組分次之。

桑黃；抗氧化；比較分析

桑黃屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、多孔菌目（polyporales）、多層孔菌科（Hymenoehaetacae）、針層孔菌屬（Phellinus），是一種多年生的珍稀藥用真菌［1-2］。桑黃主要含有多糖，其次還有黃酮、三萜和落葉松覃酸等化合物，具有抗癌、增強(qiáng)免疫力、抗肝纖維化、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗肺炎等功效［3］。由于其生理復(fù)雜性、特殊性以及對(duì)外部生長(zhǎng)環(huán)境的較高要求，其在自然界中形成子實(shí)體比較困難，尤其是需要多年才能形成可藥用的子實(shí)體。加之，近幾年人們對(duì)野生桑黃的大量采集，天然的桑黃資源已經(jīng)非常稀少。目前大多數(shù)研究集中在研究桑黃水溶性多糖的活性和結(jié)構(gòu)研究上［4-6］。對(duì)其不同極性組分的活性研究還鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。通過(guò)體外抗氧化試驗(yàn)研究桑黃不同極性化合物的活性對(duì)進(jìn)一步研究桑黃有一定的意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原料

桑黃于西藏拉薩購(gòu)買。

1.1.2主要試劑

三吡啶三吖嗪（tripyridyl-triazine、TPTZ）：Sigma；FeCl3、FeSO4、無(wú)水乙酸鈉、乙酸、鄰苯三酚、水楊酸、過(guò)氧化氫：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器

UV-8500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津；AEZ00電子天平：瑞士METTLER公司；HH-W21-600水浴箱：中國(guó)東方公司；LGJ-18S冷凍干燥機(jī)：北京松源華興。

1.2方法

1.2.1不同極性組分的獲得

將桑黃粉碎，稱取300 g分別用石油醚、乙酸乙酯、乙醇、水依次分別提取3次，并分別合并3次提取液濃縮冷凍干燥備用。

1.2.2抗氧化活性的測(cè)定

1.2.2.1總抗氧化能力的測(cè)定

采用FRAP法［7-8］。操作步驟：①標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取10 μL不同濃度FeSO4溶液，加入1.8 mL的FRAP工作液（pH3.6的醋酸鈉溶液、10 mmol/L的TPTZ甲醇溶液和20 mmol/L的FeCl3溶液按10∶1∶1比例配制），37℃水浴10 min，以醋酸鈉調(diào)零，在593 nm下測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。②分別取10 μL濃度為10 mg/mL上述4種不同極性組分樣品，處理方法同上，測(cè)定吸光度。③根據(jù)FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線，以1.0 mmol/LFeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的毫摩爾數(shù)表示。每份樣品重復(fù)測(cè)定5次。

1.2.2.2清除超氧陰離子（O2-·）能力的測(cè)定

采用鄰苯三酚法［9］。操作步驟：①分別取10 μL濃度為10 mg/mL上述4種不同極性組分樣品，加入3 mL pH為8.2的tris-HCl緩沖液，25℃水浴20 min。②水浴結(jié)束時(shí)，各樣品中加入7 mmol/L的鄰苯三酚溶液，反應(yīng)4 min后加入28 μL 10 mol/L的鹽酸終止反應(yīng)，以tris-HCl緩沖液調(diào)零在420 nm處測(cè)吸光度值，根據(jù)抑制率判斷樣品對(duì)清除的能力。每份樣品重復(fù)測(cè)定5次。

抑制率/%=［A對(duì)照-（A樣品-A樣品空白）］/A對(duì)照×100

式中：A對(duì)照為不加樣品的反應(yīng)體系；A樣品為加入樣品的反應(yīng)體系；A樣品空白為不加鄰苯三酚的反應(yīng)體系。1.2.2.3清除羥自由基（·OH）能力的測(cè)定（水楊酸法）

采用水楊酸法［10］。操作步驟：①分別取10 μL濃度為10 mg/mL上述4種不同極性組分，分別加入8.8 mmol/L H2O21 mL，10 mmol/L FeSO41 mL，10 mmol/L水楊酸1 mL。②加H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5 h。③以蒸餾水作參比，在510 nm下測(cè)吸光度。每份樣品重復(fù)測(cè)定5次。

式中：A0為對(duì)照液的吸光度；A1為加入樣品后的吸光度；A2為不加顯色劑H2O2樣品溶液的吸光度。

2　結(jié)果

2.1桑黃總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果

取10 μL濃度為0.05、0.5、1、1.5、2、2.5 mol/L FeSO4溶液，加入1.8 mL的FRAP工作液，37℃水浴10 min，以醋酸鈉調(diào)零，在593 nm下測(cè)得各濃度吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)對(duì)應(yīng)各濃度FeSO4作橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1　FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve for FeSO4

檢測(cè)結(jié)果表明，593 nm處FeSO4濃度與吸光度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.089 1x+ 0.559 4，R2=0.992 2。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得4種桑黃不同組分體外總抗氧化能力結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　桑黃不同組分總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果（±s，n=5）Table 1　The total antioxidant capacity from Phellinus igniarius （±s，n=5）

表1　桑黃不同組分總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果（±s，n=5）Table 1　The total antioxidant capacity from Phellinus igniarius （±s，n=5）

桑黃不同組分　總抗氧化能力石油醚組分乙酸乙酯組分乙醇組分水溶性組分0 23.5±0.18 22.9±0.21 25.8±0.13

總抗氧化能力高低順序依次是水溶性組分＞乙酸乙酯組分＞乙醇組分。其中水溶性組分總抗氧化能力最強(qiáng)，為25.8。

2.2桑黃不同組分清除羥自由基能力測(cè)定結(jié)果

4種桑黃不同組分清除羥自由基（·OH）能力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　桑黃不同組分清除羥自由基（·OH）能力測(cè)定結(jié)果（±s，n=5）Table 2　The scavenging activities of Phellinus igniarius on hydroxyl radical（±s，n=5）

表2　桑黃不同組分清除羥自由基（·OH）能力測(cè)定結(jié)果（±s，n=5）Table 2　The scavenging activities of Phellinus igniarius on hydroxyl radical（±s，n=5）

注：**與水溶性組分比較，P＜0.01。

桑黃不同組分　清除率/%石油醚組分乙酸乙酯組分乙醇組分水溶性組分104.8±1.33** 90.19±0.87** 86.43±0.56** 28.18±0.27

清除羥自由基（·OH）能力的高低順序依次是石油醚提取物＞乙酸乙酯提取物＞乙醇取物＞水提取物，其中石油醚提取物清除羥自由基能力最強(qiáng)。

2.3桑黃不同組分清除超氧陰離子（O2-·）能力測(cè)定結(jié)果

4種桑黃不同組分清除超氧陰離子（O2-·）能力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　桑黃不同組分物清除超氧陰離子（O2-·）能力測(cè)定（±s，n=5）Table 3　The scavenging activities of ten kinds of Phellinus igniarius on superoxide anion（±s，n=5）

表3　桑黃不同組分物清除超氧陰離子（O2-·）能力測(cè)定（±s，n=5）Table 3　The scavenging activities of ten kinds of Phellinus igniarius on superoxide anion（±s，n=5）

注：*與水溶性組分比較，P＜0.05。

桑黃不同組分　清除率/%石油醚組分乙酸乙酯組分乙醇組分水溶性組分41.04±0.19* 28.18±0.12* 52.38±0.42* 6.58±0.12

清除超氧陰離子（O2-·）能力的高低順序依次是乙醇提取物＞石油醚提取物＞乙酸乙酯提取物＞水提取物。

3　結(jié)論與討論

研究報(bào)道桑黃石油醚組分中有二十碳烷、二十六碳烷、9，12-十八碳二烯酸甲酯、棕櫚酸、二丁基羥基甲苯、類固醇木脂素（+）-松脂醇、麥角甾醇過(guò)氧化物［11-13］。乙酸乙酯組分中有柚皮素、櫻花亭、二氫茨非素、7-甲氧基二氫茨非素、北美圣草素、香豆素、莨菪亭、4-乙烯基苯酚、甲基苯醌、4-乙烯基間苯二酚［14-15］。乙醇組分中有桑黃黃酮A、桑黃黃酮B、桑黃素C，桑黃素D，二聚桑黃素，桑黃素J［16-17］。水溶性成分中有多糖、芳香酸、三萜酸、落葉松蕈酸、蟲(chóng)草酸、脲酶、過(guò)氧化氫酶、酯酶、木糖氧化酶、聚酚類等成分［17］。

本研究結(jié)果表明，4種桑黃不同組分體外總抗氧化能力高低順序依次是：水溶性組分＞乙酸乙酯組分＞乙醇組分。水溶性組分總抗氧化能力最強(qiáng)，為25.8。提示桑黃中水溶性成分多糖、芳香酸、三萜酸、落葉松蕈酸、蟲(chóng)草酸、脲酶、過(guò)氧化氫酶、酯酶、木糖氧化酶、聚酚類等成分在總抗氧化活性中可能某種或幾種有一定的貢獻(xiàn)，不一定就是多糖成分在起作用。其中的活性差異還需進(jìn)一步通過(guò)單一物質(zhì)進(jìn)行對(duì)比研究。需要注意的是，在清除羥自由基（·OH）試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)石油醚組分對(duì)羥自由基清除能力最強(qiáng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于水溶性成分，乙酸乙酯組分和乙醇組分也很強(qiáng)。在清除超氧陰離子（O2-·）試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)乙醇組分活性最高，石油醚組分次之。這些結(jié)果提示桑黃中非多糖成分也是桑黃的重要活性成分。在今后的研究中更需研究這幾類成分。

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Comparative Analysis of the Antioxidant Activity of the Different Components from Phellinus igniarius

YANG Li-wei1，YANG Hong-peng2，QUE Sheng3，BAN Li-tong2，*（1.Forestry and Fruiter Institute of Tianjin，Tianjin 300384，China；2.Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384 China；3.Department of Chemistry，Teachers College for Nationalities，Qinghai Normal University，Xining 810008，Qinghai，China）

FRAP method，pyrogallol antioxidation method and salicylic acid method were used to determine the antioxidant activities of the different components from Phellinus igniarius.The results suggested that the total antioxidant capacity order from strong to weak was as followes：water soluble fractions＞ethyl acetate fractions＞ethanol fractions.In the scavenging of hydroxyl radical（·OH），the highest scavenging capacity of the petroleum ether fraction was found in the experiment.Ethyl acetate fractions and ethanol fractions were also very strong in the scavenging of hydroxyl radical（·OH）.In the scavenging activities on superoxide anion free radical（O2-·），the scavenging capacity of ethanol fractions was the highest.The second was petroleum ether fractions in the scavenging activities of superoxide anion free radical（O2-·）.These results suggested that the non polysaccharide component in Phellinus phellinus were important.In future research，the study of these components should be studied more.

Phellinusigniarius；antioxidation；comparativeanalysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.048

楊麗維（1981—），女（漢），助理研究員，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工方面的研究工作。

2015-09-11