超聲波提取羅漢果渣中的黃酮優(yōu)化工藝研究

李麗，李杰民，盛金鳳，李昌寶，孫健，*，何雪梅，廖芬，鄭鳳錦，零東寧，劉國(guó)明（.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西南寧530007；2.廣西作物遺傳改良重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530007）

超聲波提取羅漢果渣中的黃酮優(yōu)化工藝研究

李麗1，2，李杰民1，2，盛金鳳1，2，李昌寶1，2，孫健1，2，*，何雪梅1，廖芬1，鄭鳳錦1，零東寧1，劉國(guó)明1
（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西南寧530007；2.廣西作物遺傳改良重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530007）

羅漢果中黃酮類化合物含量高。選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比3個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法研究了超聲波提取羅漢果渣中的黃酮的最佳工藝條件，結(jié)果表明，當(dāng)超聲溫度50.65℃，料液比為1∶34.75（g/mL），超聲時(shí)間為29.2 min，此時(shí)黃酮得率最高，為2.25%。采用超聲波輔助法能夠有效的提取羅漢果渣中黃酮，方法簡(jiǎn)單，時(shí)間短，效率高。

響應(yīng)曲面法；超聲波；羅漢果渣；黃酮

羅漢果的植物學(xué)名“光果木鱉”，為中國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)藥用植物［1］。羅漢果的栽培品種較多，主要品種有青皮果、長(zhǎng)灘果、拉江果、冬瓜果等［2］。在我國(guó)，羅漢果的產(chǎn)地主要在兩廣、福建省以及湖南省地區(qū)［3］，已有200多年的栽培歷史［4］。羅漢果在治療慢性氣管炎、百日咳、胃腸病、咽喉炎等方面有著非常顯著的療效［5-6］，日本學(xué)者竹本常送教授研究表明，羅漢果對(duì)各種疾病起主要療效作用的是一種被醫(yī)學(xué)上取名為甜甙的物質(zhì)［7］。羅漢果對(duì)治療癌癥也有一定功效，我國(guó)國(guó)家中醫(yī)藥管理局、衛(wèi)生局已將羅漢果列為第一批“既是食品又是藥品的品種名單”［8］。近幾十年來(lái)由于羅漢果甜甙及其制劑具有獨(dú)特的生理和臨床治療價(jià)值，國(guó)內(nèi)外甜甙成份和功能的研究十分關(guān)注。然而，對(duì)于提取甜甙之后的羅漢果渣卻沒(méi)有得到利用［9-10］。羅漢果中富含黃酮類化合物，具有抗抑郁，抗氧化與消除自由基活性的作用，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域［11-12］。

超聲波能在較低的溫度下大大促進(jìn)溶劑提取有效成分的效率，降低生產(chǎn)時(shí)間、能源、溶劑的消耗以及廢物的產(chǎn)生，提高有效產(chǎn)率和提取物的純度，既降低了生產(chǎn)的費(fèi)用，又合乎環(huán)境保護(hù)的要求，是一種有良好發(fā)展前途的新工藝［13-15］。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究了超聲時(shí)間、料液比、超聲溫度對(duì)羅漢果渣中黃酮得率的影響，采用響應(yīng)曲面法研究了超聲波提取羅漢果渣中的黃酮的最佳工藝條件，為羅漢果的綜合利用提供新的思路。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

羅漢果渣：桂林吉福斯生物技術(shù)有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海原葉生物科技有限公司。

JY-6002型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；DHS20-A型紅外水分測(cè)定儀：上海書(shū)培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ5200B型超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2方法

1.2.1羅漢果渣預(yù)處理

將羅漢果渣在熱泵干燥房中60℃干燥12 h，用多功能粉碎機(jī)將其打成粉末狀，混勻并裝于自封袋中備用（經(jīng)測(cè)定水分含量為13%）。

1.2.2試驗(yàn)測(cè)定流程與方法

準(zhǔn)確稱取羅漢果碎渣適量，按一定料液比加入乙醇-水系統(tǒng)溶液，用超聲波清洗機(jī)超聲適當(dāng)時(shí)間，抽濾，把濾液轉(zhuǎn)至100 mL容量瓶中，加入2 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻，5 min后加2 mL10%的硝酸鋁溶液，搖勻，5 min后加5 mL 1 moL/L的氫氧化鈉溶液，搖勻10 min后于500 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)。每個(gè)試驗(yàn)均做3次，各平行測(cè)定3次A并取平均值，計(jì)算黃酮含量。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用70%乙醇溶解后轉(zhuǎn)到100 mL容量瓶中，淋洗燒杯3次，把淋洗液并入容量瓶中。最后用70%乙醇定容，搖勻后備用，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.2 mg/mL。用移液器準(zhǔn)確吸取0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5、6、7 mL，分別置于8支25 mL比試管中，各加70%的乙醇至10 mL，分別加入0.4 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，震蕩搖勻后靜置5 min。分別加入0.4 mL 10%的硝酸鋁溶液，搖勻后靜置5 min。再分別加入1 mL 1 moL/L的氫氧化鈉溶液，震蕩搖勻，用70%的乙醇溶液定容到20 mL刻度處，震蕩搖勻，靜置10 min后于500 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)（測(cè)3次取平均值），制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程A=8.840 48X-0.003 42（R2=0.999 04）。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Rutin standard curve

1.2.4提取工藝最優(yōu)參數(shù)的確定

在單因素試驗(yàn)時(shí)，依次改變超聲波提取時(shí)間、提取溫度、料液比，以羅漢果渣黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行研究和分析，結(jié)合以上單因素，采用Box-Behnken軟件來(lái)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。選取超聲提取溫度、料液比、超聲提取時(shí)間這3因素以及以-1、0、+1分別代表變量水平進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素水平的設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)下表1。

表1　響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)因素水平及編碼表Table 1　Factors and levels coding of the response surface analysis

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件（美國(guó)SPSS公司）中的Duncantest進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05），Excel 2003作圖，圖表中各數(shù)據(jù)結(jié)果為3次試驗(yàn)均值。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1超聲時(shí)間對(duì)提取羅漢果渣中的黃酮的影響

稱取10g羅漢果渣粉末，設(shè)定料液比1∶10（g/mL），超聲溫度50℃，分別調(diào)節(jié)不同的超聲時(shí)間10、20、30、40、50 min進(jìn)行試驗(yàn)，得到的超聲時(shí)間對(duì)黃酮得率影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取黃酮的效率出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。黃酮得率最低值出現(xiàn)在10 min處，最高值出現(xiàn)在30 min處。這是因?yàn)樵诜磻?yīng)開(kāi)始后，羅漢果渣中的有效成分迅速溶出，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，部分有效成分分解，由此可見(jiàn)，超聲時(shí)間過(guò)短或者過(guò)長(zhǎng)都不利于羅漢果渣中的黃酮提取，選擇超聲時(shí)間30 min提取效果最好。

圖2　超聲時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.2　Effect of ultrasonic extraction time on extraction rate of flavonoids

2.1.2超聲溫度對(duì)提取羅漢果渣中的黃酮的影響

稱取10 g羅漢果渣粉末，設(shè)定料液比1∶10（g/mL），調(diào)節(jié)超聲時(shí)間30 min，并設(shè)定不同的超聲溫度30、40、50、60、70℃，得到的超聲溫度對(duì)黃酮得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　超聲溫度對(duì)黃酮得率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic extraction temperature on extraction rate of flavonoids

由圖3可知，隨著超聲溫度的升高，黃酮得率先增加，當(dāng)溫度到達(dá)50℃后，隨著溫度的升高，黃酮得率基本保持不變。為節(jié)約能源，降低成本，選用黃酮提取最佳溫度為50℃，黃酮得率達(dá)到2.27%。

2.1.3料液比對(duì)提取羅漢果渣中的黃酮的影響

稱取10 g羅漢果渣粉末，分別設(shè)定1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的料液比，超聲提取30 min，超聲溫度50℃，考察黃酮得率隨料液比變化的情況，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4表明，隨著提取溶液的增加，黃酮得率呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，在料液比為1∶30（g/mL）時(shí)黃酮得率到達(dá)最高值，之后隨著提取溶液的增加，黃酮得率變化不大。這主要是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，料液比越高，單位料樣所接觸到的提取液的有效面積就越大，細(xì)胞的溶脹作用增強(qiáng)，有利于料樣中黃酮的溶出，表現(xiàn)為提取率的顯著升高；當(dāng)繼續(xù)增加料液比時(shí)，單位料樣接觸到的有效溶液反而減少，因此隨著料液比的繼續(xù)升高，黃酮緩慢降低。故選取提取的最佳料液比為1∶30（g/mL）。

圖4　料液比對(duì)黃酮得率的影響Fig.4　Effect of material liquid ratio on extraction rate of flavonoids

2.2響應(yīng)曲面法選擇最優(yōu)試驗(yàn)條件

用Design-Expert8.0.6 Trial軟件對(duì)表1進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)并優(yōu)化出15組響應(yīng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，其中零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表2　響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 2　The methods and results of the response surface analysis

對(duì)表2用Design-Expert8.0.6 Trial軟件進(jìn)行回歸分析，得到黃酮提取率的二元多次回歸模型為：

對(duì)模型進(jìn)行方差分析，得到分析表如表3。

表3　方差分析Table 3　Analysis of variance for regression model

各因素對(duì)黃酮得率影響的大小順序?yàn)椋撼晻r(shí)間（X3）＞溫度（X1）＞料液比（X2）。模型中溫度（X1）、超聲時(shí)間（X3）影響極顯著（P＜0.01）；料液比（X2）影響顯著（P＜0.05）；二次項(xiàng)X32影響極顯著（P＜0.01），X2X3，X12影響顯著（P＜0.05），其余項(xiàng)均不顯著。

超聲溫度和料液比對(duì)黃酮得率的影響見(jiàn)圖5，超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響見(jiàn)圖6，料液比和超聲時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響見(jiàn)圖7。

圖5　超聲溫度和料液比對(duì)黃酮得率的影響Fig.5　Effects of ultrasonic extraction temperature and material liquid ratio on extraction rate of flavonoids

根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面和等高線，觀察擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析NaOH濃度、料液比和超聲波處理時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響，如圖5～圖7所示。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。由圖5～圖7可以看出，料液比和超聲時(shí)間交互作用顯著，其他因素之間的交互作用較小。

圖6　超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.6　Effects of ultrasonic extraction temperature and ultrasonic extraction time on extraction rate of flavonoids

圖7　料液比和超聲時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.7　Effects of material liquid ratio and ultrasonic extraction time on extraction rate of flavonoids

2.3最佳提取工藝條件的確定

為了確定最佳提取工藝條件，對(duì)模型（1）取一階偏導(dǎo)等于零，得到一個(gè)三元一次方程組。用Matlab對(duì)該方程組求解，即可得超聲溫度50.65℃，料液比1∶34.75（g/mL），超聲時(shí)間29.2 min，此時(shí)黃酮得率最高為2.2642%。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，表明在此條件下實(shí)際測(cè)得的平均提取率為2.25%，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差小于5%，說(shuō)明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的超聲波提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)選取超聲溫度、超聲時(shí)間以及料液比等因素，研究其對(duì)羅漢果渣中的黃酮提取效果的影響，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果得出超聲波提取羅漢果渣的最佳工藝條件。各因素對(duì)黃酮得率影響的大小順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞溫度＞料液比，溫度、超聲時(shí)間對(duì)黃酮得率影響極顯著；料液比影響顯著，當(dāng)超聲溫度50.65℃，料液比1∶34.75（g/mL），超聲時(shí)間29.2 min，此時(shí)黃酮得率最高2.25%。采用超聲波輔助法能夠有效的提取羅漢果渣，方法簡(jiǎn)單，時(shí)間短，效率高。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Flavonoids from Marc of Siraitia grosvenorii

LI Li1，2，LI Jie-min1，2，SHENG Jin-feng1，2，LI Chang-bao1，2，SUN Jian1，2，*，HE Xue-mei1，LIAO Fen1，ZHENG Feng-jin1，LING Dong-ning1，LIU Guo-ming1
（1.Agro-food Science and Technology Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences （GXAAS），Nanning 530007，Guangxi，China；2.Guangxi Crop Genetic Improvement Laboratory，Nanning 530007，Guangxi，China）

Siraitia grosvenorii is rich in flavonoids.On the basis of single factor test，the response surface method was designed to study the effects of extraction temperature，extraction time，and material liquid rate on flavonoid extraction rate from mare of Siraitia grosvenorii so as to optimize experimental conditions.The results showed that the optimum condition for ultrasonic-assisted extraction of flavonoids was as follows：extraction temperature of 50.65℃，material liquid rate of 1∶34.75（g/mL），and ultrasonic processing time of 29.2 min. Under this condition，the extraction rate of flavonoids was 2.25%.Ultrasonic-assisted method which was simple and efficiency could effectively extract flavonoids from mare of Siraitia grosvenorii.

responsesurfacemethodology；ultrasonicwave；mareofSiraitia grosvenorii；flavonoids

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.015

2014年中央財(cái)政農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)資金項(xiàng)目（桂財(cái)農(nóng)函［2014］294號(hào)）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（桂農(nóng)科2015YT86；桂農(nóng)科2015JM14）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院發(fā)展基金（桂農(nóng)科2013JQ13）

李麗（1983—），女（漢），副研究員，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)工作。

孫健（1978—），男，研究員，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)工作。

2016-04-19