乳礦物鹽復(fù)合粉免疫調(diào)節(jié)作用的研究

黃遠英，楊亞飛（湯臣倍健股份有限公司，廣東廣州510663）

乳礦物鹽復(fù)合粉免疫調(diào)節(jié)作用的研究

黃遠英，楊亞飛
（湯臣倍健股份有限公司，廣東廣州510663）

研究乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。分別以0.375、0.75、2.25 g/kg·bw劑量的乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠連續(xù)灌胃30 d后，測定各項免疫指標。乳礦物鹽復(fù)合粉能促進小鼠淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化作用，提高小鼠的抗體生成細胞及血清溶血素水平，促進小鼠的單核-巨噬細胞的吞噬功能。乳礦物鹽復(fù)合粉具有增強免疫力功能作用。

乳礦物鹽；低聚半乳糖；乳鐵蛋白；免疫力

乳礦物鹽又名乳鈣、乳清礦物質(zhì)濃縮物、乳清鈣，以乳清為原料，其主要成分是磷酸鈣，除此之外還包括蛋白質(zhì)、乳糖及鋅、磷、鈉、鉀、鎂等豐富的營養(yǎng)成分，含鈣量約為23%～28%，其鈣磷比為2∶1（質(zhì)量比），較利于人體吸收利用，作為一種新鈣源被廣泛用于各種食品［1］。

低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS），是一種具有天然屬性的功能性低聚糖。動物乳汁中存在微量GOS，而人母乳中含量較多，是母乳中重要的益生元，其安全性已受到廣泛認可。低聚半乳糖是唯一都能夠被人體腸內(nèi)8大有益菌所利用的，其還能有效地促進腸道對鈣的吸收［2］。

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種多功能的蛋白質(zhì)，含有人體所需的多種成分?？勺鳛槿梭w營養(yǎng)來源，補充鐵和氨基酸，又可作為預(yù)防和治療人類多種疾病的藥物，用于維持腸道內(nèi)菌群平衡，防止感染和抵抗病毒，抑制腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移，阻礙體內(nèi)產(chǎn)生自由基損傷機體等［3］。

本研究將乳礦物鹽、低聚半乳糖和乳鐵蛋白按一定比例進行復(fù)配，制得乳礦物鹽復(fù)合粉，對小鼠進行增強免疫力功能實驗，為開發(fā)增強免疫力的功能食品提供了理論參考。

1　材料與方法

1.1實驗動物

健康SPF級昆明種小鼠：山東大學(xué)動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK（魯）20130009。

1.2樣品

乳礦物鹽復(fù)合粉（MCCP）：內(nèi)容物為淡黃色粉狀，由湯臣倍健股份有限公司提供，推薦日服用建議劑量為4.5 g/袋。

1.3劑量選擇和受試物給予方式

實驗小鼠按隨機分組原則分為低劑量組（MCCPL，0.375 g/kg·bw）、中劑量組（MCCP-M，0.75 g/kg·bw）、高劑量組（MCCP-H，2.25 g/kg·bw）（分別相當(dāng)于日服用建議劑量的5、10、30倍）及對照組（Control組）。每天1次，灌胃體積按20 mL/kg·bw，連續(xù)灌胃30 d。對照組以等體積的蒸餾水灌胃。

1.4主要儀器與試劑

1.4.1主要儀器

BL3100電子天平：德國賽多利斯公司；3-18K高速冷凍離心機：德國SIGMA公司；722型可見-紫外分光光度計：上?，F(xiàn)科分光公司；ELX800酶標儀：美國BIO-TEK公司；DYX-DHS-40X50隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海市躍進醫(yī)療器械一廠；HWS-28恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；10 μL～100 μL微量加樣器：德國BRAND公司；DP71-IPP6.0光學(xué)顯微鏡：日本奧林巴斯株式會社；RE-5003旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海光學(xué)儀器廠。

1.4.2主要試劑

綿羊紅細胞（SRBC）、雞紅細胞（CRBC）、氧化型輔酶I，ConA、補體、Hank’s液青鏈霉素、MTT、小牛血清、PBS緩沖液、瓊脂糖：以上試劑均購自sigma公司；印度墨汁：購自上海信裕生物科技有限公司；1%冰醋酸：購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.5方法

1.5.1臟器體重比值測定

小鼠稱重后處死，取出胸腺、脾臟，去盡筋膜及表面血污，稱重，計算胸腺體重比值及脾臟體重比值。1.5.2遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)

采用足趾增厚法。免疫后4天，測量左后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射SRBC，注射后于24 h測量左后足跖部厚度，同一部位測量3次，取平均值。1.5.3ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴轉(zhuǎn)化實驗

取脾臟，制成細胞懸液，采用MTT法，波長570nm，酶標儀測定光密度。

1.5.4小鼠血清溶血素測定

分離血清，按血凝法觀察血細胞凝集程度，計算抗體積數(shù)。

1.5.5抗體生成細胞檢測

用脫纖維綿羊紅細胞免疫，取脾臟，制成脾細胞懸液，按Jerne改良玻片法，計數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.5.6小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗

采用半體內(nèi)法。制備雞紅細胞懸液，每只鼠腹腔注射，間隔30 min，腹腔注入生理鹽水2 mL，吸出腹腔洗液1 mL，移置37℃溫箱孵育30 min，然后，于生理鹽水中漂洗，晾干，以體積比1∶1丙酮—甲醇溶液固定，體積分數(shù)4%Giemsa-磷酸緩沖液染色3 min，再用蒸餾水漂洗晾干，光鏡下觀察。1.5.7小鼠碳廓清實驗

經(jīng)尾靜脈注入稀釋的印度墨汁，并立即計時。注入墨汁后2 min及10 min分別從眼內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并將其加到2 mL處0.1%Na2CO3溶液中，用722分光光度計600 nm波長處測光密度值。

1.5.8NK細胞活性測定

取脾臟，制成細胞懸液，按乳酸脫氫酶（LDH）法，用酶標儀在490 nm處測定光密度值。

1.6實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件對各實驗原始數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，滿足“方差齊”要求的數(shù)據(jù)資料用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計處理；對方差不齊的數(shù)據(jù)資料進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足“方差齊”要求后，用轉(zhuǎn)換所得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。

2　結(jié)果

2.1乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠臟器體重比值的影響

2.1.1脾臟/體重比值

小鼠臟器體重比值試驗中，與對照組相比，高、中、低各劑量組小鼠的脾臟/體重比值和胸腺/體重比值均無顯著性差異，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。經(jīng)方差分析，P=0.783，各劑量組分別與水對照組小鼠相比，其脾臟/體重比值均無顯著性差異（P＞0.05），見表1。

表1　乳礦物鹽復(fù)合粉臟器/體重比值的影響Table 1　Effects of milk calcium compound powder on mice immune organ/body weigh ratio（±s，n=10）

表1　乳礦物鹽復(fù)合粉臟器/體重比值的影響Table 1　Effects of milk calcium compound powder on mice immune organ/body weigh ratio（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水。

組別　劑量/ （g/kg·bw）脾臟/體重比值/ （mg/g）胸腺/體重比值/ （mg/g）對照組　-　5.119±0.619　 4.208±0.727 MCCP-L　0.375　4.989±0.883　4.685±0.884 MCCP-M　0.75　5.294±0.892　4.677±0.613 MCCP-H　2.25　5.327±0.909　4.893±1.083

2.1.2胸腺/體重比值

經(jīng)方差分析，P=0.333，各劑量組分別與水對照組小鼠相比，其胸腺/體重比值均無顯著性差異（P＞0.05），見表1。

2.2乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）的影響

經(jīng)方差分析，P=0.820，各劑量組分別與水對照組小鼠相比，其足跖腫脹度差異無顯著性（P＞0.05），結(jié)果見表2。

2.3ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗（MTT法）

經(jīng)方差分析，P=0.006。低劑量組與水對照組小鼠相比，其淋巴細胞增殖能力無顯著性差異（P＞0.05）；中、高劑量組與水對照組小鼠相比，其淋巴細胞增殖能力有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3　乳礦物鹽復(fù)合粉對ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的影響Table 3　Effects of milk calcium compound powder on lymphocyte transformation test induced by ConA in mice（±s，n=10）

表3　乳礦物鹽復(fù)合粉對ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的影響Table 3　Effects of milk calcium compound powder on lymphocyte transformation test induced by ConA in mice（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水；與對照組比較，*P＜0.05。

組別　劑量/（g/kg·bw）　淋巴細胞增值能力/mm對照組　-　0.235±0.033 MCCP-L　0.375　0.258±0.033 MCCP-M　0.75　0.278±0.032* MCCP-H　2.25　0.298±0.052*

表2　乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）的影響Table 2　Effects of milk calcium compound powder on DTH against SRBC（±s，n=10）

表2　乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）的影響Table 2　Effects of milk calcium compound powder on DTH against SRBC（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水。

組別　劑量/（g/kg·bw）　足跖腫脹度/mm對照組　-　0.605±0.219 MCCP-L　0.375g　0.614±0.328 MCCP-M　0.75　0.654±0.301 MCCP-H　2.25　0.708±0.203

2.4乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠血清溶血素產(chǎn)生的影響

經(jīng)方差分析，P=0.002。低劑量組與水對照組小鼠相比，其小鼠血清抗體積數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）；中、高劑量組與水對照組小鼠相比，其小鼠血清抗體積數(shù)有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4　乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠血清溶血素產(chǎn)生的影響Table 4　Effects of milk calcium compound powder on serum HC50（±s，n=10）

表4　乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠血清溶血素產(chǎn)生的影響Table 4　Effects of milk calcium compound powder on serum HC50（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水；與對照組比較，*P＜0.05。

組別　劑量/（g/kg·bw）　抗體積數(shù)對照組　-　171.8±21.1 MCCP-L　0.375　176.8±17.0 MCCP-M　0.75　198.2±17.1* MCCP-H　2.25　201.6±22.1*

2.5抗體生成細胞檢測（Jerne改良玻片法）

經(jīng)方差分析，P=0.002。低劑量組與水對照組小鼠相比，其小鼠抗體生成細胞數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）；中、高劑量組與水對照組小鼠相比，其小鼠抗體生成細胞數(shù)有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果見表5。

表5　乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響Table 5　Effects of milk calcium compound powder on the ability of antibody（±s，n=10）

表5　乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響Table 5　Effects of milk calcium compound powder on the ability of antibody（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水；與對照組比較，*P＜0.05。

組別　劑量/（g/kg·bw）　PFC/（×103/WSC）對照組　-　40.80±25.00 MCCP-L　0.375　51.52±23.67 MCCP-M　0.75　74.25±24.81* MCCP-H　2.25　88.65±36.26*

2.6乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響

各劑量組與水對照組小鼠相比，其腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬百分率及吞噬指數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果見表6。

表6　乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響Table 6　Effects of milk calcium compound powder on macrophage phagocytosis in rats（±s，n=10）

表6　乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響Table 6　Effects of milk calcium compound powder on macrophage phagocytosis in rats（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水。

組別　劑量/（g/kg·bw）　吞噬率/%　吞噬指數(shù)對照組　-　25.8±11.2　0.37±0.12 MCCP-L　0.375　31.0±13.2　0.45±0.15 MCCP-M　0.75　34.5±14.8　0.47±0.17 MCCP-H　2.25　37.7±16.4　0.51±0.18

2.7小鼠碳廓清實驗

經(jīng)方差分析，P=0.008。低劑量組與水對照組小鼠相比，其對小鼠單核-巨噬細胞吞噬指數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）；中、高劑量組與水對照組小鼠相比，其對小鼠單核-巨噬細胞吞噬指數(shù)有顯著性差異（P＜0.05），結(jié)果見表7。2.8乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠NK細胞活性的影響

表7　乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠單核-巨噬細胞碳廓清能力的影響Table 7　Effects of milk calcium compound powder on carbon clearance index（K）（±s，n=10）

表7　乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠單核-巨噬細胞碳廓清能力的影響Table 7　Effects of milk calcium compound powder on carbon clearance index（K）（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水；與對照組比較，*P＜0.05。

組別　劑量/（g/kg·bw）　吞噬指數(shù)對照組　-　4.563±0.584 MCCP-L　0.375　5.035±0.531 MCCP-M　0.75　5.350±0.762* MCCP-H　2.25　5.562±0.659*

經(jīng)方差分析，P=0.174。各劑量組與水對照組小鼠相比，其NK細胞活性率均無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果見表8。

表8　 乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠NK細胞活性的影響Table 8　Effects of milk calcium compound powder on NK cell activity（±s，n=10）

表8　 乳礦物鹽復(fù)合粉對小鼠NK細胞活性的影響Table 8　Effects of milk calcium compound powder on NK cell activity（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水。

組別　劑量/（g/kg·bw）　NK細胞活性率/%對照組　-　17.27±4.34 MCCP-L　0.375　12.72±2.95 MCCP-M　0.75　14.20±5.75 MCCP-H　2.25　14.68±5.46

3　小結(jié)

分別經(jīng)口給予小鼠0.375、0.75、2.25 g/kg·bw劑量的乳礦物鹽復(fù)合粉30 d，對小鼠體重增長無不良影響，對小鼠脾臟體重比值和胸腺體重比值無影響，小鼠細胞免疫功能、體液免疫功能、小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能各中高劑量組指標與對照組比較均有顯著差異（P﹤0.05），且有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果均為陽性。小鼠NK細胞活性測定結(jié)果為陰性。按照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》對增強免疫力功能保健食品的判定標準可知，乳礦物鹽復(fù)合粉具有增強小鼠免疫功能的作用。

［1］邵勝榮，孫俊.乳礦物鹽的研究動態(tài)及應(yīng)用進展［J］.添加劑與營養(yǎng)，2013，1（2）：58-59

［2］薛雅鶯，袁衛(wèi)濤，楊海軍，等.低聚半乳糖的特性及應(yīng)用前景［J］.發(fā)酵科技通訊，2011，40（3）：50-52

［3］李林，劉思國，成國祥.乳鐵蛋白的結(jié)構(gòu)與功能［J］.食品與藥品，2006，8（12A）：28-31

Study on the Immunoregulatory Function of Milk Calcium Compound Powder

HUANG Yuan-ying，YANG Ya-fei （BY-HEALTH CO.LTD.，Guangzhou 510663，Guangdong，China）

To study the immunoregulation effect of milk calcium compound powder in mice.After administration of milk calcium compound powder for 30 days conscutively with the dose of 0.375，0.75，2.25 g/kg·bw，immunological indexes were measured.Proliferation and transformation of spleen lymphocytes in the mice was increased.The number of antibody-producing cells and the level of serum hemolysin was enhanced.Phagocytic function of monocyte-macrophage was promoted.Milk calcium compound powder can strengthen the immunofunction in mice.

milkcalcium；galactooligosaccharides；lactoferrin；immunofunction

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.047

黃遠英（1982—），女（漢），公共營養(yǎng)師，本科，研究方向：功能食品與藥物制劑。

2015-08-14