玉米低聚肽螯合鐵（II）的制備和結(jié)構(gòu)表征

張新雪，盧知浩，劉家生，劉 放，付少委，劉文穎,

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京 100015；2.廣東中食營科生物科技有限公司，廣東東莞 523122）

植物基食品原料綠色、環(huán)保、健康理念深入人心，以植物為基礎(chǔ)的食品開發(fā)將成為食品行業(yè)的主流趨勢[1]。玉米為我國主要的農(nóng)作物，以其為原料的加工利用多針對玉米淀粉，玉米蛋白研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，玉米蛋白含有較高比例的支鏈氨基酸，且玉米蛋白鏈的功能區(qū)可通過酶解技術(shù)被釋放[2]，具有較高的利用價值。玉米低聚肽是以玉米蛋白粉為原料，通過現(xiàn)代生物酶解技術(shù)制備的小分子短肽混合物[2]，具有抗氧化[3]、降血壓[4]、護肝[5]、解酒[5-7]等多種功能。相比于大分子蛋白，小分子肽類物質(zhì)具有良好的體外消化穩(wěn)定性。Wei等[8]、王憬等[9]以大豆肽、卵白肽、玉米肽、乳清肽、海洋骨原肽、海洋膠原肽、海洋蛋白肽7種食源性低聚肽為原料，通過體外模擬消化實驗發(fā)現(xiàn)，95%以上的低聚肽未被胃蛋白酶消化，90%以上的低聚肽未被胰蛋白酶消化，因此低聚肽更容易被人體吸收和發(fā)揮其生理功能。

鐵是人體必需的微量元素，作為血紅蛋白的重要部分，影響人體生長發(fā)育和新陳代謝[10]，鐵缺乏會導致人體貧血，抵抗力下降，容易疲勞[11]。目前，鐵補充劑主要通過無機鐵鹽（如FeSO4），但長期服用會引起腸胃不適，且穩(wěn)定性差，生物利用率低[12]。有研究指出，以海洋魚皮低聚肽、酪蛋白肽以及乳清蛋白肽為主要原料制備鐵螯合物，具有作為新型食源性鐵補充劑的潛力[13]，但目前以玉米低聚肽為原料進行鐵螯合物制備的研究較少。

本研究以玉米低聚肽和氯化亞鐵為原料制備玉米低聚肽螯合鐵（II），評價其氨基酸組成和相對分子質(zhì)量，以得率和螯合率評價螯合效果，通過單因素實驗、響應(yīng)面中心組合設(shè)計和驗證實驗確定最佳工藝，通過液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）測定玉米低聚肽螯合鐵（II）的氨基酸組成，并通過傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和掃描電鏡（SEM）對玉米低聚肽螯合鐵（II）的結(jié)構(gòu)進行表征，以期為食源性肽鐵補充劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)技術(shù)支持，為玉米低聚肽的高值化利用及植物基食品品質(zhì)提升提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米低聚肽 北京中食海氏生物技術(shù)有限公司提供；氯化亞鐵、硫酸亞鐵銨、鄰二氮菲、抗壞血酸、無水乙醇、鹽酸、氨水等化學試劑 均為分析純，北京化學試劑公司；溴化鉀（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher公司。

HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇區(qū)富華儀器有限公司；LRH-99-250型恒溫箱 上海一恒科技有限公司；CD 4-2型離心機 北京醫(yī)用離心機廠；SJ-3 F型pH計 上海精密儀器有限公司；SHZ-3型循環(huán)水多用真空泵 鄭州朋來儀器有限公司；Pl403型天平梅特勒-托利多儀器公司；Nicolet 6700型傅立葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本SHI-MADZU公司；A300全自動氨基酸分析儀 德國曼默博爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米低聚肽螯合鐵（II）的制備 準確稱取一定量的玉米低聚肽粉，用蒸餾水溶解，制備成一定濃度的玉米低聚肽溶液，并加入抗氧化劑。根據(jù)后續(xù)不同實驗參數(shù)條件，調(diào)節(jié)pH，按照一定的肽鹽比（w/w）加入FeCl2，在恒溫水浴振蕩器中恒溫螯合，反應(yīng)結(jié)束后蒸發(fā)濃縮，醇沉（乙醇）得到粗螯合物。對粗螯合物進行抽濾、洗滌、干燥，制備得到玉米低聚肽螯合鐵（II）。

1.2.2 玉米低聚肽螯合鐵（II）螯合效果評價 采用宋莎莎等[14]的方法，利用分光光度法測定螯合前反應(yīng)體系中鐵的含量以及反應(yīng)生成的玉米低聚肽螯合鐵（II）中鐵的含量。通過公式（1）和公式（2）測定鐵的螯合率和玉米低聚肽螯合鐵（II）的得率，以評價玉米低聚肽螯合鐵（II）的螯合效果。

式中：m1為螯合物中鐵的量，mg；m0為加入反應(yīng)體系中鐵的總量，mg。

式中：W1為玉米低聚肽螯合鐵（II）的總質(zhì)量（II），mg；W0為玉米低聚肽與鐵鹽的總質(zhì)量，mg。

1.2.3 玉米低聚肽螯合鐵（II）制備工藝單因素實驗采用單因素實驗設(shè)計肽鹽比、pH、螯合溫度、螯合時間探究制備玉米低聚肽螯合鐵（II）的最佳工藝，具體實驗參數(shù)如下：

選用pH6.0，螯合溫度為65 ℃，螯合時間為45 min，肽鹽比為2:1、4:1、6:1、8:1和10:1，探究肽鹽比對玉米低聚肽螯合鐵（II）螯合效果的影響；

選用螯合溫度為65 ℃，螯合時間為45 min，肽鹽比為8:1，pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，探究pH對玉米低聚肽螯合鐵（II）螯合效果的影響；

選用pH6.0，螯合時間為45 min，肽鹽比為8:1，螯合溫度為35、45、55、65、75 ℃，探究螯合溫度對玉米低聚肽螯合鐵（II）螯合效果的影響；

選用pH6.0，螯合溫度為65 ℃，肽鹽比為8:1，螯合時間為15、30、45、60 min，探究螯合時間對玉米低聚肽螯合鐵（II）螯合效果的影響。

1.2.4 玉米低聚肽螯合鐵（II）制備工藝響應(yīng)面試驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以肽鹽比、pH、螯合時間、螯合溫度和為考察因素，采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計4因素3水的響應(yīng)面試驗，以玉米低聚肽螯合鐵（II）的得率和鐵的螯合率為響應(yīng)值，分析影響螯合效果各因素的交互作用，確定最佳工藝條件。中心組合實驗水平如表1所示。

表1 中心組合實驗水平表Table 1 Center combination experiment level

1.2.5 玉米低聚肽螯合鐵（II）的氨基酸組成分析利用全自動氨基酸分析儀，參考GB 5009.124-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》方法，對玉米低聚肽螯合鐵（II）的水解氨基酸和游離氨基酸組成進行分析[15]。

1.2.6 玉米低聚肽螯合鐵（II）相對分子質(zhì)量分布測定配制玉米低聚肽螯合鐵（II）溶液的質(zhì)量濃度為1 mg/mL，經(jīng)過0.2 μm聚四氟乙烯膜過濾，使用高效液相色譜儀測定樣品分子量。同時，分別配制0.1%乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子質(zhì)量189 u）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子質(zhì)量451 u）、桿菌酶（分子質(zhì)量1450 u）、細胞色素C（分子質(zhì)量12500 u）4種肽標準品溶液，經(jīng)過0.2 μm聚四氟乙烯膜過濾后進樣，制作校正曲線。色譜條件：色譜柱：TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動相：V乙腈:V水:V三氟乙酸=45:55:0.1；流速：0.5 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃[16]。

1.2.7 玉米低聚肽及玉米低聚肽螯合鐵（II）的FTIR表征 利用傅里葉變換紅外光譜對玉米低聚肽及玉米低聚肽鐵（II）進行結(jié)構(gòu)表征。具體為：準確稱取5 mg玉米低聚肽螯合鐵于瑪瑙研缽中，在其中加入500 mg KBr。打開紅外燈，在干燥環(huán)境下研磨并混合均勻，將均勻粉末置于模具中壓片處理，獲得均勻透明樣品后采用傅里葉變換紅外光譜儀掃描，掃描范圍為4000～500 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次。

1.2.8 玉米低聚肽及玉米低聚肽螯合鐵（II）的微觀形貌表征 采用SEM對玉米低聚肽及玉米低聚肽螯合鐵（II）的微觀形貌進行表征。具體為：取適量玉米低聚肽和玉米低聚肽螯合鐵（II）分別均勻涂抹于樣盤，噴金鍍膜處理，加壓3 kV，于電鏡下捕捉500×倍的均勻清晰圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 12進行響應(yīng)面分析，采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析，采用Origin 2019軟件繪制圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米低聚肽螯合鐵（II）制備工藝單因素實驗結(jié)果

2.1.1 肽鹽比對螯合效果的影響 玉米低聚肽螯合鐵（II）的制備是以玉米低聚肽和FeCl2的螯合反應(yīng)為基礎(chǔ)，因此反應(yīng)底物的相對含量是影響螯合效果的重要因素。選用5組不同肽鹽質(zhì)量比研究螯合效果，結(jié)果如圖1所示。由圖1a可知，隨著肽鹽質(zhì)量比的增加，玉米低聚肽螯合鐵（II）的得率呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢，在肽鹽質(zhì)量比為4:1時得率呈現(xiàn)最大值，為45.30%。鐵的螯合率取決于反應(yīng)體系中肽反應(yīng)基團的含量以及FeCl2和肽的反應(yīng)程度。當肽鹽質(zhì)量比較低時，過量的FeCl2無法充分與玉米低聚肽螯合，螯合率均較低，螯合效果差且所得螯合物不穩(wěn)定。隨著玉米低聚肽含量的增加，F(xiàn)eCl2和肽的反應(yīng)更充分，螯合率上升。但玉米低聚肽含量繼續(xù)增加，肽與肽之間會發(fā)生相互反應(yīng)，從而影響肽與FeCl2的反應(yīng)，又會導致螯合率的下降，同時造成得率降低，大量玉米低聚肽的浪費，成本提高[17]；由圖1b可知，鐵的螯合率最高時肽鹽質(zhì)量比為4:1和6:1。綜合得率和螯合率結(jié)果，后續(xù)優(yōu)化試驗中選擇肽鹽質(zhì)量比為4:1～6:1，這與宋莎莎等[14]結(jié)果相似。

圖1 肽鹽比對螯合效果的影響Fig.1 Effect of peptide-salt ratio on the chelating effect

2.1.2 pH對螯合效果的影響 選用pH4.0～8.0來探究其對螯合效果的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著pH的提高，玉米低聚肽螯合鐵（II）的得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當pH為7.0時，得率最大為46.11%；而鐵的螯合率呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，當pH為8.0時，螯合率最大為57.82%，但此時的螯合率和pH為7.0時（56.58%）的螯合率無顯著差異（P＞0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，在酸性環(huán)境中，過量的H+會與Fe2+爭奪電子基團；而在堿性環(huán)境中，OH-會與Fe2+生成氫氧化物沉淀，影響螯合效果。因此，一般中性環(huán)境中螯合效果最優(yōu)。但當大量多肽處于等電點附近時，其螯合效果受H＋和OH－影響較小，供電子基團可以充分與金屬離子通過配位鍵形成螯合物[18-19]。這與宋莎莎等[14]制備烏雞肽鐵（II）螯合物所選擇的pH6結(jié)果不同，說明在玉米低聚肽螯合鐵的制備工藝在中性環(huán)境螯合效果更好。

圖2 pH對螯合效果的影響Fig.2 Effect of pH on the chelating effect

2.1.3 螯合溫度對螯合效果的影響 螯合溫度不僅影響反應(yīng)速率，也是影響螯合效果的重要因素之一。如圖3所示，隨著螯合溫度的提升，得率和螯合率均整體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當螯合時間為65 ℃時，得率和螯合率取得最大值，為55.28%和54.98%。玉米低聚肽與FeCl2的螯合反應(yīng)是吸熱反應(yīng)，隨著溫度的提高，玉米低聚肽的溶解度逐漸增強，F(xiàn)e2+與肽基團的接觸面積增大，螯合反應(yīng)更徹底，得率和螯合率提高。但是，溫度繼續(xù)升高，會導致玉米低聚肽之間發(fā)生副反應(yīng)，與Fe2+形成競爭，且螯合物在高溫下不穩(wěn)定，極易分解，影響螯合效果，導致得率和螯合率下降[20]。

圖3 螯合溫度對螯合效果的影響Fig.3 Effect of chelatng temperature on the chelating effect

2.1.4 螯合時間對螯合效果的影響 螯合時間是影響螯合反應(yīng)的重要因素之一，選擇螯合時間為15～60 min，探究其對螯合效果的影響，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，螯合時間為15～30 min時，得率呈現(xiàn)上升趨勢。螯合反應(yīng)達到30、45 min時，得率均達到50%，螯合時間為60 min時，螯合率略有下降。而鐵的螯合率整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當反應(yīng)時間為30 min時，螯合率達到最大值51.88%。這是因為當反應(yīng)時間過短時，螯合反應(yīng)不徹底，反應(yīng)體系中存在大量游離的Fe2+和玉米低聚肽配體，原料利用率低下；反應(yīng)時間過長，螯合反應(yīng)發(fā)生解離作用，且可能產(chǎn)生副產(chǎn)物，得率和螯合率過低，螯合效果差。綜合考慮得率和螯合率結(jié)果，選擇25～45 min進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

圖4 螯合時間對螯合效果的影響Fig.4 Effect of chelating time on the chelating effect

2.2 響應(yīng)面設(shè)計試驗結(jié)果及分析

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，設(shè)計肽鹽比、pH、螯合溫度和螯合時間4因素3水平響應(yīng)面試驗探究各影響因素對螯合效果的交互影響，所得結(jié)果如表2所示。采用Design Expert 8.0.6軟件擬合回歸多項參數(shù)，得到玉米低聚肽螯合鐵（II）得率（f（x））及螯合率（g（x））對肽鹽比（A）、pH（B）、螯合溫度（C）、螯合時間（D）的二次多項回歸模型方程分別為：

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

對回歸模型進行方差分析，結(jié)果如表3和表4所示。結(jié)果表明，兩個模型的回歸項顯著（P＜0.05），且失擬項均為不顯著（P＞0.05），說明模型擬合程度較好，可用于對響應(yīng)值的預(yù)測和分析。表3中結(jié)果顯示，二次項A2、C2、D2均對玉米低聚肽螯合鐵（II）得率有極顯著性影響（P＜0.01），而二次項B2對玉米低聚肽螯合鐵（II）得率有顯著影響（P＜0.05），其他項對得率無顯著影響。綜合F值結(jié)果，可得各因素對玉米低聚肽螯合鐵（II）得率影響主次順序為：C（螯合溫度）＞D（螯合時間）＞A（肽鹽比）＞B（pH）。表4結(jié)果顯示，二次項A2、B2、C2、D2均對鐵螯合率有極顯著性影響（P＜0.01），綜合F值結(jié)果，可得各因素對鐵螯合率的影響主次順序為：D（螯合時間）＞B（pH）＞C（螯合溫度）＞A（肽鹽比）。

表3 以玉米低聚肽螯合鐵（II）得率為響應(yīng)指標的回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model with the yield of corn oligopeptide chelated iron (II) as the response index

表4 以鐵螯合率為響應(yīng)指標的回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of the regression model with iron chelation as the response index

根據(jù)實驗結(jié)果和回歸模型，利用Design Expert 8.0.6軟件繪制肽鹽比、pH、螯合溫度和螯合時間4因素對螯合效果影響的響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖5所示，響應(yīng)面坡度和顏色的變化能反映各因素交互作用對結(jié)果影響的顯著性。結(jié)果表明，肽鹽比和pH、肽鹽比和螯合溫度、肽鹽比和螯合時間、螯合溫度和螯合時間的交互作用對玉米低聚肽螯合鐵（II）的得率影響較小，而對鐵螯合率影響較大。在肽鹽比相同的情況下，pH是玉米低聚肽螯合鐵得率最主要的影響因素，這說明螯合反應(yīng)過程中，螯合體系中的H+、OH-以及等電點的因素會較大程度上影響Fe2+與肽的螯合反應(yīng)[16-17]；在肽鹽比相同的情況下，螯合溫度是鐵（II）螯合率最主要的影響因素，這說明對于螯合反應(yīng)（吸熱）而言，高溫下存在的副反應(yīng)，且螯合物不穩(wěn)定，極易分解[20]。

圖5 各因素交互作用對螯合效果影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of the interaction of various factors on the effect of chelation

綜上分析，利用Design Expert 8.0.6軟件得出玉米低聚肽螯合鐵（II）得率（48.80%）最高的工藝參數(shù)為：肽鹽比為5.05:1，pH6.93，螯合時間為33.77 min，螯合溫度為64.21 ℃；鐵螯合率最高（52.86%）的工藝參數(shù)為肽鹽比為4.99:1，pH7.02，螯合時間為35.10 min，螯合溫度為64.89 ℃。根據(jù)螯合效果的最優(yōu)參數(shù)和實際制備的可操作性，確定玉米低聚肽螯合鐵（II）的制備工藝為肽鹽比5.0:1，pH7.0，螯合時間35 min，螯合溫度65 ℃。

2.3 工藝驗證

通過響應(yīng)面的回歸模型得到玉米低聚肽螯合鐵（II）的最佳工藝條件為為肽鹽比5.0:1，pH7.0，螯合時間35 min，螯合溫度65 ℃。此條件下模型理論值得率為48.64%，螯合率為52.16%，通過驗證試驗，可知在此條件下玉米低聚肽螯合鐵（II）的得率為46.59%±1.69%，鐵的螯合率為51.75%±2.10%，與理論值差異較小，該模型得到的優(yōu)化參數(shù)準確性較高。

2.4 玉米低聚肽螯合鐵（II）氨基酸組成

對以上最優(yōu)工藝下制備的玉米低聚肽螯合鐵（II）進行氨基酸組成分析，結(jié)果如表5所示。玉米低聚肽螯合鐵（II）中谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）含量較高，總量達到了14.86 g/100 g，甲硫氨酸（Met）和纈氨酸（Val）含量最低，含量分別是0.530和0.673 g/100 g。在這些氨基酸中，必需氨基酸含量占氨基酸總和的25.58%，說明玉米低聚肽螯合鐵（II）必需氨基酸含量較為豐富，營養(yǎng)價值較高。此外，谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）含量較高，這有助于玉米低聚肽螯合鐵（II）呈現(xiàn)良好風味，在食品工業(yè)廣泛應(yīng)用[21]。

表5 玉米低聚肽螯合鐵（II）氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of iron (II)-chelating corn oligopeptides

2.5 玉米低聚肽螯合鐵（II）相對分子質(zhì)量分布

采用HPLC對玉米低聚肽螯合鐵（II）相對分子質(zhì)量分布進行了測定，結(jié)果如表6所示。在R2為0.9979，標準曲線方程為lg MW＝-0.2142t+6.8866（MW為相對分子量，t為時間）的條件下，玉米低聚肽螯合鐵（II）中多為小分子肽混合物，且相對分子質(zhì)量小于1000 u的水解物占比高達89.77%。相對分子質(zhì)量分布于1000～2000 u和2000～3000 u的水解物占比分別為8.22%和1.09%，而相對分子質(zhì)量高于3000 u的水解物占比為0.93%。研究發(fā)現(xiàn)，玉米低聚肽的相對分子質(zhì)量分布在150～1000的比例達到90%以上，其水解物多為小分子肽混合物[22]。這說明玉米低聚肽螯合鐵（II）相對分子質(zhì)量分布和玉米低聚肽相似。

表6 玉米低聚肽螯合鐵（II）相對分子量分布Table 6 Molecular weight distribution of iron (II)-chelating corn oligopeptides

2.6 玉米低聚肽螯合鐵（II）結(jié)構(gòu)表征

2.6.1 玉米低聚肽及玉米低聚肽螯合鐵（II）的FTIR結(jié)果分析 采用FTIR對玉米低聚肽及玉米低聚肽螯合鐵（II）的結(jié)構(gòu)進行表征，結(jié)果如圖6所示。由結(jié)果可知，玉米低聚肽螯合前后的FTIR圖發(fā)生了明顯變化，尤其在1000～1650 cm-1波段。在玉米低聚肽的FTIR圖中，3276 cm-1處（酰胺A帶）出現(xiàn)了N—H伸縮振動引起的寬吸收峰[23]，1640 cm-1處（酰胺I帶）出現(xiàn)了C＝O伸縮振動引起的吸收峰[24-25]，1529 cm-1處（酰胺II帶）出現(xiàn)了N—H彎曲振動和C-N伸縮振動引起的吸收峰[26]，1394 cm-1處出現(xiàn)了氨基酸殘基側(cè)鏈基團—COO—伸縮振動引起的吸收峰，1246 cm-1處出現(xiàn)了C—O單鍵伸縮振動引起的吸收峰，表明玉米低聚肽中含有—COOH結(jié)構(gòu)[27]，1044 cm-1處出現(xiàn)了NH2吸收峰[28]。而在玉米低聚肽螯合鐵（II）的FTIR圖中，也在3276 cm-1處（酰胺A帶）出現(xiàn)了N—H伸縮振動的吸收峰，1608 cm-1處出現(xiàn)了C＝O伸縮振動引起的吸收峰，但相比螯合前發(fā)生了藍移，且未出現(xiàn)玉米低聚肽在1529 cm-1處出現(xiàn)的N—H彎曲振動和C—N伸縮振動引起的吸收峰，這說明肽中的N原子是鐵螯合反應(yīng)的配位原子[28]；1394、1044 cm-1處的吸收峰發(fā)生了藍移，且1246 cm-1處吸收峰的強度明顯減弱，這說明肽中的—COOH也是發(fā)生螯合反應(yīng)的主要部位[29]。周名洋等[30]通過鈣螯合鵝骨膠原蛋白制備鵝骨膠原蛋白鈣螯合肽，探究螯合機理發(fā)現(xiàn)螯合反應(yīng)主要發(fā)生在氨基酸的羧基和氨基上，王孟麗等[31]總結(jié)了肽金屬離子螯合物的螯合機理指出，肽與金屬離子的螯合位點是肽的羧基、氨基和肽鍵，這與本實驗研究結(jié)果一致，說明鐵主要通過與玉米低聚肽末端羧基或氨基中的氮原子、氧原子形成配位鍵，從而形成螯合物。

圖6 玉米低聚肽及玉米低聚肽螯合鐵（II）傅里葉變換紅外光譜圖Fig.6 FTIR of corn oligopeptides and iron (II)-chelating corn oligopeptides

2.6.2 玉米低聚肽及玉米低聚肽螯合鐵（II）的SEM結(jié)果分析 采用SEM對玉米低聚肽及玉米低聚肽螯合鐵（II）的微觀形貌進行表征，結(jié)果如圖7所示。玉米低聚肽表面粗糙，存在明顯的圓球狀和球狀破裂體的形貌，圓球形物體表面凹凸不平，可能與真空干燥過程中的失水有關(guān)[20]，球狀破裂體的表面光滑。而玉米低聚肽螯合鐵（II）的形貌與螯合前相差較大，其結(jié)構(gòu)中無圓球狀結(jié)構(gòu)存在，微觀形貌更為疏松。通過鐵螯合后，玉米低聚肽螯合鐵的微觀形貌中存在聚集體，這可能是由于鐵在螯合過程中破壞了玉米低聚肽的微觀結(jié)構(gòu)，通過離子鍵和配位鍵生成了玉米低聚肽螯合鐵小顆粒[32-33]，且玉米低聚肽螯合鐵的SEM圖中可發(fā)現(xiàn)冰晶狀物質(zhì)存在，這可能是吸附在玉米低聚肽上的鐵晶體[20]。

圖7 玉米低聚肽（A）及玉米低聚肽螯合鐵（B）掃描電鏡圖Fig.7 SEM of corn oligopeptides (A) and iron (II)-chelating corn oligopeptides (B)

3 結(jié)論

本研究利用玉米低聚肽與氯化亞鐵螯合制備玉米低聚肽螯合鐵（II），綜合考慮得率和螯合率確定最佳制備工藝為：肽鹽比5:1，pH7.0，螯合時間35 min，螯合溫度65 ℃，得到的玉米低聚肽螯合鐵（II）得率為46.59%±1.69%，鐵（II）的螯合率為51.75%±2.10%。玉米低聚肽螯合鐵（II）中必需氨基酸含量占氨基酸總和的25.58%，富含谷氨酸（7.619 g/100 g）和天冬氨酸（3.118 g/100 g）。且其相對分子質(zhì)量小于1000 u的水解物占比高達89.77%。進一步，對玉米低聚肽及玉米低聚肽螯合鐵（II）進行傅里葉變換紅外光譜掃描和掃描電鏡表征，結(jié)果表明玉米低聚肽與鐵主要通過肽末端羧基或氨基中的氮原子、氧原子形成配位鍵，進而形成穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，兩者微觀形貌存在明顯差異，屬于不同的物質(zhì)，證明玉米低聚肽螯合鐵（II）的成功制備。關(guān)于肽螯合鐵的研究可進一步探究其安全性，為金屬離子螯合肽的制備和表征提供技術(shù)支持，拓展鐵補充劑的來源，為其在食品、醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。