昆蟲細(xì)胞中共表達(dá)人糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)重組蛋白SEAP表達(dá)的影響

唐巍玲， 田苗苗， 黎健蓓， 鐘　江

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物學(xué)與微生物工程系 上海 200438)

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昆蟲細(xì)胞中共表達(dá)人糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)重組蛋白SEAP表達(dá)的影響

唐巍玲， 田苗苗， 黎健蓓， 鐘江

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物學(xué)與微生物工程系 上海 200438)

桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)有表達(dá)量高及蛋白翻譯后修飾較完善等特點(diǎn)，但與哺乳動(dòng)物相比其缺乏幾種關(guān)鍵的糖基轉(zhuǎn)移酶.許多研究表明將哺乳動(dòng)物的糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)入昆蟲細(xì)胞中，能使得昆蟲細(xì)胞表達(dá)蛋白的修飾得到有效改善.本研究通過RT-PCR克隆了人Ⅱ型N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶(β-1,2-N-acetylglucosaminyltransferase Ⅱ)和Ⅰ型β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(β-1,4-galactosyltransferase)基因，并將它們分別插入重組桿狀病毒上，獲得了表達(dá)GnT2和β4GalT1的重組桿狀病毒.以具有糖基化修飾位點(diǎn)的人分泌型堿性磷酸酶(Secreted Alkaline Phosphatase, SEAP)為對(duì)象，將表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶的重組桿狀病毒和表達(dá)SEAP的重組桿狀病毒共感染細(xì)胞，Western blot分析結(jié)果表明共感染時(shí)所表達(dá)的SEAP蛋白條帶分子量明顯大于其單獨(dú)表達(dá)時(shí)的分子量.結(jié)果表明重組病毒共感染對(duì)桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)的SEAP有修飾作用.

SEAP； 蛋白修飾； GnT2； β4GalT1； Bac-to-Bac

桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞作為應(yīng)用廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，具有安全、高效等優(yōu)點(diǎn).該表達(dá)系統(tǒng)擁有較完善的蛋白翻譯后修飾途徑[1]，但在蛋白質(zhì)修飾方面，昆蟲細(xì)胞與哺乳動(dòng)物細(xì)胞有較大的差別.例如，由于缺乏幾種關(guān)鍵的與蛋白糖基化相關(guān)的酶，其蛋白糖鏈為低甘露糖型，具有易使人產(chǎn)生過敏反應(yīng)的α-1,3-巖藻糖核心且末端沒有唾液酸殘基[2-3].而這種寡糖鏈的差異有可能影響蛋白的構(gòu)象乃至功能[4].改造昆蟲細(xì)胞蛋白修飾途徑，使其蛋白產(chǎn)物更加接近哺乳動(dòng)物蛋白是目前研究的熱點(diǎn)[5-7].Aumiller及同事構(gòu)建了穩(wěn)定遺傳的昆蟲細(xì)胞系SfSWT-5，含有人β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶Ⅱ型(β-1,2-N-acetylglucosaminyltransferase Ⅱ, GnT2)等6個(gè)哺乳動(dòng)物糖基化相關(guān)酶基因，與未經(jīng)改造的Sf9細(xì)胞相比，Sf SWT-5能對(duì)外源蛋白基因末端唾液酸化.這表明，通過改造昆蟲細(xì)胞修飾途徑來產(chǎn)生更復(fù)雜的蛋白產(chǎn)物是可行的，轉(zhuǎn)入的酶基因所表達(dá)的酶擁有生物學(xué)活性，也預(yù)示著將來昆蟲細(xì)胞在表達(dá)哺乳動(dòng)物糖蛋白方面有很大的應(yīng)用潛力[8-14].

本實(shí)驗(yàn)設(shè)想不通過建立穩(wěn)定細(xì)胞系，而是通過表達(dá)不同糖基轉(zhuǎn)移酶的重組桿狀病毒的共感染，對(duì)人分泌型堿性磷酸酶(Secreted Alkaline Phosphatase, SEAP)進(jìn)行加工，來驗(yàn)證這些酶在昆蟲細(xì)胞中不僅能表達(dá)，而且有生物學(xué)活性，為將來深入研究昆蟲細(xì)胞中蛋白糖基化的功能和機(jī)制，進(jìn)一步優(yōu)化昆蟲細(xì)胞蛋白修飾途徑做準(zhǔn)備.為此，選取了兩個(gè)人源糖基轉(zhuǎn)移酶，N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶Ⅱ型(GnT2)和β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ型(β-1,4-galactosyltransferase, β4GalT1)，通過Bac-to-Bac方法分別構(gòu)建重組桿狀病毒vGnT2和vβ4GalT1，并在感染重組桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞中檢測到酶的表達(dá).進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，vGnT2和vβ4GalT1共感染可以提高昆蟲細(xì)胞表達(dá)的SEAP的分子量，提示重組病毒表達(dá)的GnT2和β4GalT1對(duì)外源糖蛋白確實(shí)有修飾的作用.

1　材料與方法

1.1材料

E.coliTG-1菌株、DH10Bac菌株和HeLa細(xì)胞系，草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda細(xì)胞系Sf9、及High Five細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存.細(xì)菌37℃培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基或者LB選擇培養(yǎng)基，HeLa細(xì)胞37℃培養(yǎng)，5% CO2中以RPMI1640培養(yǎng)基(北京索萊寶生物技術(shù)公司)添加10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng).昆蟲細(xì)胞Sf9 用TMN-FH (Sigma-Aldrich)添加10%胎牛血清，或用Sf900-Ⅲ無血清(Life Technology)，于27℃培養(yǎng)；昆蟲細(xì)胞High Five用Express 5無血清培養(yǎng)基(Life Technology)于27℃培養(yǎng).T載體質(zhì)粒、pFastBacHTB質(zhì)粒、表達(dá)SEAP的重組病毒AcSEAP[15]，表達(dá)EGFP的重組病毒AcGFP由本實(shí)驗(yàn)室保存.

各種限制性內(nèi)切酶，DNA聚合酶，T4 DNA連接酶，PNGaseF(peptideN-glycosidase F)及反轉(zhuǎn)錄試劑盒等均購自TaKaRa公司；瓊脂糖DNA回收試劑盒購自天根公司；引物由捷瑞公司和賽百盛公司合成，所用引物序列見表1；測序由博尚測序公司和美吉測序公司完成.鼠源抗His-tag抗體購自上海利堃貿(mào)易有限公司，兔源抗SEAP抗體購自Bio-Rad公司，羊源抗鼠及抗兔抗體均購自Sigma公司.

表1　糖基轉(zhuǎn)移酶引物序列

注：加下劃線部分表示酶切位點(diǎn).

1.2重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建

在培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞中加入500μL RNAiso Plus(TaKaRa)，平放1～2min，洗下細(xì)胞后，加入 100μL 氯仿抽提，12000g4℃離心15min，將上清轉(zhuǎn)移至RNA-free離心管中，用異丙醇沉淀RNA.沉淀于冰上干燥后加入43μL DEPC H2O，5μL 10×DNase Ⅰ Buffer和2μL rDNase Ⅰ，37℃反應(yīng)15min消化DNA，用PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄，并用GnT2和β4GalT1引物(表1)進(jìn)行PCR.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)T載體克隆，并測序驗(yàn)證.

取與已知正確序列相符的GnT2和β4GalT1基因克隆，提取質(zhì)粒，分別以BamHⅠ和XhoⅠ，及BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切，并克隆到pFastBacHTB的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacHTB-GnT2和pFastBacHTB-β4GalT1.

1.3重組病毒的構(gòu)建

利用Bac-to-Bac系統(tǒng)(Invitrogen)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行重組病毒的構(gòu)建.將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacHTB-GnT2和pFastBacHTB-β4GalT1分別轉(zhuǎn)化至E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，用含卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、X-Gal、IPTG的LB培養(yǎng)基篩選，選取白色克隆，經(jīng)PCR驗(yàn)證帶有目的基因后，提取Bacmid DNA.

Sf9細(xì)胞接入24孔細(xì)胞板(每孔2×105個(gè)細(xì)胞)，過夜培養(yǎng)后，用Cellfectin Ⅱ (Invitrogen)將Bacmid 轉(zhuǎn)入Sf9細(xì)胞，分別獲得表達(dá)GnT2和β4GalT1的重組病毒vGnT2和vβ4GalT1.原代病毒以極低感染復(fù)數(shù)感染Sf9細(xì)胞，獲得用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的病毒感染液.

1.4重組蛋白的檢測

用適量Sf9 或 High Five細(xì)胞接種96孔板，然后用重組病毒vGnT2和vβ4GalT1感染，3d后將貼壁細(xì)胞用1×PBS洗滌并吹下，2500r/min離心5min，用60μL PBS懸浮，加入SDS-PAGE樣品緩沖液，以8%濃度的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，一抗為鼠源抗His-tag抗體(1∶5000稀釋)，二抗為AP偶聯(lián)的羊源抗鼠抗體(1∶3×104稀釋).

1.5SEAP活性的檢測

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接入等量High Five細(xì)胞，并按相同病毒感染復(fù)數(shù)的AcSEAP及vGnT2，vβ4GalT1感染細(xì)胞，并用AcGFP病毒平衡感染復(fù)數(shù)，使得各樣品總的病毒感染復(fù)數(shù)相同.感染72h后收上清.測定酶活時(shí)，96孔板每孔加入5μL感染上清液，20μL 0.05% CHAPS(溶于PBS)、和200μL顯色劑(含2mol/L二乙醇胺，1mmol/L MgCl2，0.5mmol/L ZnCl2)，室溫暗處孵育45min后，在405nm測量吸光度.

1.6Western blot

先用vGnT2或vβ4GalT1感染Sf9或High Five細(xì)胞，24h后再用AcSEAP感染，72h后收集上清液，進(jìn)行Western blot，一抗為兔源抗SEAP抗體(1∶400稀釋)，二抗為AP偶聯(lián)的羊源抗兔抗體(1∶104稀釋).

1.7MALDI-TOF MS

用vGnT2、vβ4GalT1及AcSEAP感染High Five細(xì)胞，3d后收集上清，將2mL上清液超濾濃縮至100μL，其間加幾次雙蒸水將鹽洗脫除去，得到蛋白樣品.將未感染vGnT2及vβ4GalT1的SEAP蛋白樣品和感染vGnT2及vβ4GalT1的SEAP蛋白樣品交由生工公司(Sangon)進(jìn)行MALDI TOF MS分析.

2　結(jié)　果

2.1重組桿狀病毒的獲得

從HeLa細(xì)胞中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用表1中的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增GnT2和β4GalT1基因，將擴(kuò)增條帶連接到T載體上，經(jīng)DNA測序確認(rèn)獲得正確的GnT2和β4GalT1基因.進(jìn)一步將這兩個(gè)基因分別通過雙酶切和連接接入pFastBacHTB，分別獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacHTB-GnT2和pFastBacHTB-β4GalT1.利用Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建分別帶有GnT2和β4GalT1的Bacmid，將Bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，得到重組病毒vGnT2和vβ4GalT1.效價(jià)測定表明，vGnT2和vβ4GalT1與野生型病毒相當(dāng)，表明這兩個(gè)酶的表達(dá)對(duì)病毒復(fù)制沒有顯著影響.

將病毒感染Sf9細(xì)胞3d后，收集細(xì)胞樣品進(jìn)行Western blot檢測.由于pFastBacHTB載體帶有6×His-tag，可以用His-tag抗體檢測重組蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖1所示.帶His-tag的GnT2蛋白和β4GalT1蛋白理論大小分別為 54.5kDa 和47kDa，可以看出，在細(xì)胞中β4GalT1和GnT2都能表達(dá)，其中未感染病毒的Sf9細(xì)胞樣品為陰性對(duì)照.

2.2重組病毒共感染對(duì)SEAP蛋白表達(dá)量的影響

將AcSEAP單獨(dú)感染High Five細(xì)胞，或與vGnT2和/或 vβ4GalT1共同感染細(xì)胞，感染72 h后，測量培養(yǎng)基中SEAP活性，如圖2所示.可看出在用等量AcSEAP感染細(xì)胞，并用AcGFP平衡感染總效價(jià)時(shí)，加入AcGFP組的酶活略低于AcSEAP單獨(dú)感染的對(duì)照組酶活(AcSEAP+AcGFP為單獨(dú)感染組的96.4%)，而加入vGnT2或者vβ4GalT1的樣品吸光度明顯低于陽性對(duì)照(AcSEAP+vGnT2+AcGFP為單獨(dú)感染組的86.7%；AcSEAP+vβ4GalT1+AcGFP為單獨(dú)感染組的89.25%)，AcSEAP與vGnT2和vβ4GalT1同時(shí)感染時(shí)吸光度最低(AcSEAP+vβ4GalT1+vGnT2+AcGFP為單獨(dú)感染組的73.12%).說明在共感染重組病毒時(shí)，SEAP蛋白的活性水平有所降低.

2.3共感染表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶的病毒對(duì)SEAP分子量的影響

將AcSEAP與vGnT2和vβ4GalT1同時(shí)感染昆蟲High Five細(xì)胞.感染3d后收集上清樣品，濃縮后分別用PNGaseF進(jìn)行處理，進(jìn)行Western blot，結(jié)果見圖3.PNGaseF能將蛋白的N-糖鏈水解切除，Western blot結(jié)果僅顯示除去糖鏈后的蛋白條帶.圖3(a)中，AcGFP作用為平衡病毒感染復(fù)數(shù)，不影響SEAP分子量大小，經(jīng)過PNGaseF水解后二者SEAP條帶大小基本一致，且明顯小于未水解的樣品；而未經(jīng)PNGaseF處理時(shí)，加入vGnT2和vβ4GalT1共感染時(shí)的SEAP條帶比感染AcGFP的條帶略有滯后，SEAP分子量前者比后者大.

圖3(b)雖未用AcGFP來平衡總病毒感染復(fù)數(shù)，但可以看出，各樣品經(jīng)PNGaseF水解后條帶大小無明顯差異，而未經(jīng)水解的樣品中，在vGnT2或vβ4GalT1存在時(shí)產(chǎn)生的SEAP分子量比對(duì)照組略大.

2.4MALDI-TOF MS分析

取AcSEAP單獨(dú)感染及AcSEAP與vGnT2及vβ4GalT1共感染的High Five細(xì)胞培養(yǎng)液上清，經(jīng)超濾濃縮后，用MALDI-TOF MS檢測上清液的蛋白質(zhì)信號(hào)，結(jié)果如圖4(見第236頁)所示.

SEAP蛋白分子量約為56.4kDa，去除信號(hào)肽后約為54.3kDa. 圖4中可看出共感染vGnT2及vβ4GalT1(圖4(a))與AcSEAP單獨(dú)感染時(shí)的蛋白信號(hào)(圖4(b))相比，發(fā)生了明顯的變化.單獨(dú)感染時(shí)的主要峰在 55086 Da處，而共感染時(shí)在 55378.6680(峰1)、56840.6133(峰2)、58763.7578 和 60736.5625 的位置均有明顯信號(hào)峰，意味著相應(yīng)大小的蛋白所占比例有所提高.

3　討　論

本文構(gòu)建了表達(dá)兩種人糖基轉(zhuǎn)移酶的重組桿狀病毒vGnT2和vβ4GalT1，并分析了它們?cè)诶ハx細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白以及對(duì)外源糖蛋白表達(dá)修飾的影響，證明兩種酶均能在細(xì)胞中得到有效表達(dá)，且有生物活性.

蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)重要活性物質(zhì)，作為藥物治療疾病的前景遠(yuǎn)闊.蛋白的修飾對(duì)于蛋白質(zhì)性質(zhì)具有極大影響[16].例如，在腫瘤細(xì)胞中，糖鏈的唾液酸化修飾異常會(huì)引起腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲和遷移等[17]；促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種糖蛋白藥物，糖鏈對(duì)于其體內(nèi)活性有重要作用，若缺乏糖鏈則會(huì)在體內(nèi)被迅速水解失活.昆蟲細(xì)胞糖基化途徑的限制性阻礙了其表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的能力，進(jìn)一步影響它在醫(yī)藥上特別是在治療上的應(yīng)用.隨著研究深入和技術(shù)進(jìn)步，越來越多證據(jù)表明往昆蟲細(xì)胞中引入其缺乏的糖基轉(zhuǎn)移酶，有助于改善其蛋白修飾能力，這在醫(yī)藥科研上有重要意義.例如，改造細(xì)胞株Sf β4GalT/ST6與Sf9相比能產(chǎn)生末端唾液酸化的N-多糖，且在缺乏CMP-唾液酸的情況下進(jìn)行唾液酸化；Sf SWT-5除了表型能穩(wěn)定遺傳外，其產(chǎn)生的糖鏈末端唾液酸化程度很高[18].

SEAP蛋白是人胚胎堿性磷酸酶突變體，缺乏胎盤堿性磷酸酶羧基末端的24個(gè)氨基酸，在High Five細(xì)胞內(nèi)沒有類似蛋白的表達(dá)，因此在Western blot時(shí)不會(huì)有內(nèi)源表達(dá)干擾.SEAP蛋白有兩個(gè)糖基化位點(diǎn)，Asn-144和Asn-271，但它只在Asn-271處有一個(gè)N-型連接的側(cè)糖鏈，改變這個(gè)糖鏈結(jié)構(gòu)對(duì)于SEAP的影響很大，且因?yàn)樵摰鞍讕в行盘?hào)肽，可以分泌到細(xì)胞外，無須裂解細(xì)胞就可以檢測其活性，因此SEAP很適合用于蛋白修飾相關(guān)的研究[19].AcSEAP是用桿狀病毒多角體啟動(dòng)子超表達(dá)SEAP基因的重組病毒.在Western blot的結(jié)果中，感染vGnT2、vβ4GalT1或二者同時(shí)感染的SEAP條帶比陰性對(duì)照SEAP條帶有滯后，說明GnT2和β4GalT1對(duì)外源糖蛋白SEAP有直接修飾作用，導(dǎo)致該蛋白分子量有所上升；而經(jīng)過PNGaseF處理后各樣品蛋白條帶大小無差別，說明GnT2和β4GalT1極有可能是通過對(duì)糖鏈的影響來改變SEAP的分子量及活性的.

SEAP理論大小約55371.1Da，在MALDI-TOF的結(jié)果中，感染vGnT2及vβ4GalT1的細(xì)胞上清液與未感染重組病毒的相比，出現(xiàn)了疑似經(jīng)過修飾的SEAP糖蛋白信號(hào)峰，位置與Western blot結(jié)果中條帶大小基本相符.GnT2是Ⅱ型β-1,2-N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，β4GalT1是Ⅰ型β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，重組病毒編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶可能是在SEAP的N-糖鏈支鏈末端分別或同時(shí)加上N-乙酰氨基葡萄糖或者半乳糖，但其具體是如何修飾的，在修飾后昆蟲細(xì)胞是否對(duì)蛋白進(jìn)一步加工或者進(jìn)行了怎樣的進(jìn)一步加工，修飾前后的糖鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了具體怎樣的變化，以及驗(yàn)證疑似SEAP峰是否真的就是修飾前和修飾后的SEAP，還有待更細(xì)致的生化實(shí)驗(yàn)來深入研究[20].

本文的結(jié)果表明，vGnT2和vβ4GalT1不僅可以在昆蟲細(xì)胞High Five中表達(dá)，而且可以通過共感染的方式改變?nèi)朔置谛蛪A性磷酸酶SEAP的修飾并增大其分子量，與國外已有研究中將糖基轉(zhuǎn)移酶基因整合到昆蟲細(xì)胞基因組中建立穩(wěn)定遺傳細(xì)胞系的方法不同，本文采用的感染表達(dá)方法更加靈活和快速，這意味著將來有可能通過選擇性采用表達(dá)不同相關(guān)酶的重組病毒，較為方便地針對(duì)性改變外源蛋白翻譯后修飾情況，為將來研究蛋白糖鏈的功能和機(jī)制，優(yōu)化昆蟲細(xì)胞蛋白翻譯后修飾打下了基礎(chǔ).

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The Effect of Human Glycosyltransferases Co-expression on the Expression of SEAP in Insect Cells

TANG Weiling, TIAN Miaomiao, LI Jianbei, ZHONG Jiang

(Department of Microbiology and Microbial Engineering, School of Life Sciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

The baculovirus-insect cell expression system has the characteristics of high expression level and good post-translational protein modificaiton. But comparing to mammalian cells, it lacks several key glyco-syltransferases. In the current work, human β-1,2-N-acetylglucosaminyltransferase Ⅱ (GnT2) and β-1,4-galactosyltransferase (β4GalT1) were obtained by RT-PCR and used to construct two baculoviruses expressing GnT2 and β4GalT1. Then, the two recombinant viruses were used to infect insect cells together with another recombinant baculovirus expressing a human glycoprotein SEAP (secreted embryonic alkline phosphatase) to test their effect on SEAP glycosylation. Western blot showed that co-infection increased the molecular weight of SEAP. This result was confirmed by MALDI-TOF MS. It is suggested that co-infection of baculoviruses expressing human glycosyltransferase could be used to modify the baculovirus-expressed SEAP in insect cells.

SEAP; protein modification; GnT2; β4GalT1; Bac-to-Bac

0427-7104(2016)02-0232-07

2015-10-16

國家科技重大專項(xiàng)(2011ZX09506-001)

唐巍玲(1990—)，女，碩士研究生. 鐘 江，男，教授，通訊聯(lián)系人，E-mail：jzhong@fudan.edu.cn.

Q 786

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