分娩方式影響嬰兒皮膚真菌群落組成

應　時，譚　淵，全哲學

(1. 復旦大學 生命科學學院 微生物學與微生物工程系，上海200438； 2. 強生(中國)有限公司 研發(fā)部，上海 200245)

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分娩方式影響嬰兒皮膚真菌群落組成

應時1，譚淵2，全哲學1

(1. 復旦大學 生命科學學院 微生物學與微生物工程系，上海200438； 2. 強生(中國)有限公司 研發(fā)部，上海 200245)

嬰兒出生之前生活在無菌的子宮里，出生以后嬰兒皮膚第一次暴露在有大量微生物的環(huán)境中，形成了初始的皮膚微生物群落.因此分娩方式的選擇，決定了嬰兒最初接觸的微生物源是母親的陰道還是周圍的環(huán)境.本研究對6對出生2～4個月的嬰兒和他們母親的皮膚表面6個部位的樣品進行3次重復采樣(共計189個達標樣品)并通過高通量測序來探究不同的分娩方式對嬰兒皮膚表面真菌群落組成的影響.研究發(fā)現(xiàn)不同分娩方式會造成2～4個月嬰兒皮膚真菌群落的顯著差異.孕期女性陰道里常見的念珠菌屬(Candida)在順產(chǎn)嬰兒皮膚表面的豐度顯著高于剖腹產(chǎn)嬰兒.而母親皮膚上最主要的馬拉色菌屬(Malassezia)在剖腹產(chǎn)嬰兒皮膚表面的豐度比順產(chǎn)嬰兒更高.同時還發(fā)現(xiàn)剖腹產(chǎn)的母親與自己孩子的皮膚真菌群落更相似，而順產(chǎn)的母嬰?yún)s沒有類似的特征.

分娩方式； 皮膚真菌； 高通量測序； 群落組成

一般認為健康人子宮是無菌狀態(tài)，所以出生前的嬰兒皮膚表面也是無菌狀態(tài).但出生時嬰兒就會立即接觸到大量的微生物，形成最初的皮膚微生物群落.對于通過順產(chǎn)出生的嬰兒來講，在生產(chǎn)時經(jīng)過母親陰道時將可能獲得很多類型的初始微生物.這些初始微生物只有很少一部分會在皮膚表面穩(wěn)定生存，并在以后成為成年時不同部位特異的微生物群落[1-3].但現(xiàn)代人越來越多地選擇剖腹產(chǎn)分娩方式，這就意味著許多嬰兒在出生時不能獲得陰道微生物.分娩方式是對初生兒腸道微生物的形成影響最大的因素[4-7].有研究發(fā)現(xiàn)不同分娩方式會影響到初生嬰兒的皮膚和口腔微生物，順產(chǎn)嬰兒的微生物群落往往與母親的陰道微生物群落有一定的相似性[8].這些都說明分娩方式對初生兒的微生物群落形成的重要性，但這些研究都主要是針對細菌組成的考察，而分娩方式對初生兒皮膚真菌群落影響的系統(tǒng)性研究至今還沒有.

皮膚作為人體最大的器官，是部位差異很大的微生物棲息地，其上除了細菌還存在大量的真菌[9].皮膚表面的真菌與人體健康或疾病密切相關，常見的銀屑病、痤瘡和脂溢性皮炎都可能與皮膚表面的常駐微生物馬拉色菌(Malassezia)相關[10-12].嬰兒在剛出生的第一年，其皮膚表面的微生物多樣性會隨著時間不斷增加[13].所以研究分娩方式對嬰兒皮膚表面真菌組成的影響就是從源頭探究人體微生物群落的發(fā)展，這既有助于對成年人更復雜穩(wěn)定的真菌群落演變的研究，也有助于對不同生產(chǎn)方式的嬰兒從剛出生時開始就能有針對性地進行的皮膚真菌疾病的預防.

基于純培養(yǎng)的分析微生物群落的傳統(tǒng)方法只能針對特定的幾種微生物，即使是基于克隆文庫的不依賴培養(yǎng)的微生物群落結構分析也因測序數(shù)量的限制而無法準確體現(xiàn)整體微生物群落結構，但第二代高通量測序技術的發(fā)展可以解決這些問題[14].本研究對上海市區(qū)6位母親和她們剛出生2～4個月的嬰兒皮膚表面6個部位的3次采樣樣品進行焦磷酸測序，以探究不同分娩方式對嬰兒皮膚表面真菌群落組成的影響.

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1主要試劑和儀器

聚酯纖維拭子，MOBiO PowerSoilTMDNA Isolation Kit，MOBIO UltraCleanTMPCR Clean-up DNA Purification Kit，Axygen AxyPrep DNA膠回收試劑盒.

MOBIO VOTEX-Genie 2振蕩儀，TaKaRa PCR儀，TBS-380 微型熒光計，Roche 454 GS-FLX焦磷酸測序儀.

1.1.2采樣對象

本研究在實施并正式采樣前已通過復旦大學倫理委員會的審核.所有參與采樣的受試者或其監(jiān)護人都了解本課題的研究目的、采樣流程以及可能出現(xiàn)的不適癥狀，并簽署了知情同意書.所有受試者的數(shù)據(jù)信息都被嚴格保密并不用作本研究之外的用途.

表1　母親和嬰兒的基本信息

本研究招募了6對母嬰共12位受試者參與采樣，母親的年齡在26～33歲之間，嬰兒年齡在2～4個月之間(表1).對所有受試者都進行了全套的皮膚科檢查，通過問卷調(diào)查得到了他們的治療和藥物使用歷史，并排除了在采樣前6個月里患過皮膚病或使用過抗生素的受試者.通過篩選標準的受試者，都被要求在采樣前12個小時內(nèi)不對采樣部位進行水洗(其中手上的部位只要求2個小時不水洗).本次研究采樣了6個部位，依次為手背、指縫(采樣位置在中指與無名指之間)、前臂、肘窩、額頭和后背.對于對稱的部位，隨機選擇一側部位進行了采樣.對每位受試者隔天進行3次重復采樣.

1.2方法

1.2.1采樣和DNA提取

采樣時間集中在2011年7月份.具體的采樣和DNA提取方法參見文獻[15].其簡要過程如下：先用蘸取過潤濕液的無菌聚酯纖維拭子反復擦拭采樣部位，然后取下拭子頭放入DNA提取管中，最后按照改進過的MOBiO PowerSoilTMDNA Isolation Kit試劑盒說明書提取DNA.提取后的DNA樣品將在-20℃的冰柜內(nèi)儲藏，以備后續(xù)實驗.

1.2.2PCR擴增和高通量測序

采用巢式PCR對樣品中的真菌基因組轉錄間隔區(qū)1區(qū)(Internal Transcribed Spacer 1, ITS1)進行擴增，該區(qū)域為高變區(qū)，但PCR引物對應的是相對保守的18S或5.8S rRNA基因末端[16-17].第一輪PCR使用通用引物對NSA3和NLC2，第二輪PCR使用帶有焦磷酸測序用的接頭(Adaptor)的長引物AdaB-NSI1和AdaA-58A2R.然后對PCR產(chǎn)物進行純化、DNA濃度測定、樣品混合和割膠回收.最后送至測序公司，使用Roche 454 GS-FLX焦磷酸測序儀進行測序.具體的引物序列、PCR條件和測序樣品準備過程參見文獻[15].

1.2.3序列分析

所有的序列分析過程都在QIIME軟件集成平臺上進行[18].首先對得到的原始序列進行質量篩選，去除Q值小于25、長度小于200bp、含有模糊堿基N或連續(xù)8個及以上相同堿基的序列.接著根據(jù)特異的標簽序列對序列進行重命名，新的名字含有對應的樣品信息.然后所有序列與UNITE數(shù)據(jù)庫(https：∥unite.ut.ee/)比對進行嵌合體檢測和去除.篩選后的序列使用USEARCH61的算法[19]根據(jù)95%的相似度進行可操作分類單位(OTU)劃分，并挑選出每個OTU的代表序列，以80%的置信度使用RDP classifier方法[20]與UNITE數(shù)據(jù)庫比對得到對應的分類信息.

1.2.4多樣性分析和統(tǒng)計學分析

Alpha多樣性是用來評估群落內(nèi)的多樣性程度，我們分析了2種Alpha多樣性指數(shù)：Chao1值和Shannon指數(shù).Chao1值主要反映物種豐富度，Shannon指數(shù)同時反映物種豐富度和均一度.Beta多樣性是用來評估不同群落間的組成差異，我們的分析中根據(jù)兩個樣品的OTU種類和豐度(A)使用Bray-Curtis算法計算樣品間的Bray-Curtis距離，距離數(shù)值越小說明兩個樣品的群落組成越相似.

我們使用t檢驗對不同分組樣品的Alpha多樣性指數(shù)值和Beta多樣性的Bray-Curtis距離進行顯著性檢驗，使用方差分析(ANOVA)檢驗真菌豐度在各分組間的差異.ANOSIM分析用于檢驗不同分組之間的群落組成差異，在P值顯著(P<0.01)的結果中R值的大小反映了差異程度.R值越接近于1說明不同分組之間的群落組成差異大，也就表示這種分組所依據(jù)的因素對微生物群落的影響大；而R值接近于0說明不同分組之間的群落組成差異小，也就表示這種分組所依據(jù)的因素對微生物群落的影響小.

2　結果與分析

2.1測序結果

經(jīng)過質量篩選得到長度在210～510bp之間的高質量序列100397條，這些序列聚類形成622個OTU(相似度閾值為95%).這些序列來自6對母嬰的6個部位(3次重復采樣)，共計216個樣品，其中27個樣品因為沒有達到每樣品150條序列的最低標準而被舍去，最終用于分析的樣品為189個.

2.2母親皮膚的真菌群落特點

母親皮膚表面的真菌主要來自兩個門，子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota).在屬水平占主導的是擔子菌門的馬拉色菌屬，它在不同部位樣品中的平均豐度達到了64.0%.除此之外，豐度大于2.0%的屬有子囊菌門的念珠菌屬(Candida, 8.4%)、枝孢霉屬(Cladosporium, 4.2%)和鏈格孢霉屬(Alternaria, 2.9%).根據(jù)ANOSIM檢驗的結果，3次重復采樣之間沒有顯著差異，對母親皮膚表面的真菌群落組成影響最大的因素是不同的皮膚部位，而且其差異大于不同個體之間的差異(表2).

表2　不同分組的ANOSIM檢驗的結果

*：P<0.01, N.S.：P>0.01,無顯著差異.

表3　母親不同部位的Alpha多樣性指數(shù)

不同皮膚部位的真菌群落多樣性差異較大，油性部位(額頭和背部)的Alpha多樣性低于干性部位(手背和前臂)和濕性部位(指縫和肘窩)(表3)，其中指縫部位的Shannon指數(shù)顯著高于額頭和背部(P=0.004和P=0.008).因此，不同屬的真菌在各個部位中的豐度也存在著差異.豐度最高的馬拉色菌屬在油性部位額頭和背部的豐度分別為82.4%和85.8%，顯著高于手背(43.1%，P=0.006和P=0.002)和指縫(44.7%，P=0.008和P=0.003).其他幾個主要屬的真菌在不同部位的豐度雖然沒有顯著差異，但也有所不同(表4，圖1，見第242頁).念珠菌屬在濕性和干性部位的豐度較高(8.3%～14.4%)，而在油性部位的豐度較低(3.4%～5.0%).枝孢霉屬則是在手背的豐度較高(8.9%)，在其他部位較低(1.3%～5.4%).而鏈格孢霉屬在手背豐度最高(7.6%)，在后背豐度最低(0.5%).

表4　母親和不同分娩方式嬰兒各部位的主要真菌組成

2.3嬰兒皮膚的真菌群落特點

和母親一樣，嬰兒皮膚表面的真菌也主要來自子囊菌門和擔子菌門.各個部位中平均豐度最高的屬也是擔子菌門的馬拉色菌屬(59.4%).除此之外，豐度大于2.0%的屬有來自子囊菌門的念珠菌屬(8.9%)、枝孢霉屬(3.2%)、曲霉屬(Aspergillus，3.0%)和鏈格孢霉屬(2.5%).比較母親和嬰兒相同部位的主要真菌的豐度差異，只發(fā)現(xiàn)指縫(母親：44.7%，嬰兒：73.9%，P=0.003)和后背(母親：85.8%，嬰兒：51.7%，P=0.003)的馬拉色菌有顯著差異.母嬰相同部位的真菌群落的Alpha多樣性沒有顯著差異.

ANOSIM檢驗結果與母親相反，對嬰兒皮膚表面真菌群落組成影響最大的因素是不同個體，其次是分娩方式以及部位，3次重復采樣之間沒有顯著差異(表2).而且順產(chǎn)嬰兒的皮膚真菌群落組成受不同部位和個體因素的影響程度大于剖腹產(chǎn)嬰兒受這些因素的影響；進一步比較嬰兒不同部位所受分娩方式的影響，發(fā)現(xiàn)順產(chǎn)嬰兒和剖腹產(chǎn)嬰兒真菌群落組成差異最大的部位是肘窩和前臂(表2).對于Alpha多樣性，無論是Chao1值還是Shannon指數(shù)都表明順產(chǎn)嬰兒的皮膚真菌群落多樣性顯著高于剖腹產(chǎn)的嬰兒(P=5.9×10-5和0.01).

順產(chǎn)嬰兒皮膚的馬拉色菌屬的豐度略小于剖腹產(chǎn)嬰兒(52.5%，64.8%，P=0.03)，而念珠菌屬的豐度則顯著高于剖腹產(chǎn)嬰兒(17.9%，2.1%，P=1.6×10-6).具體到各個部位中，不同分娩方式的嬰兒只在肘窩、前臂和指縫部位存在豐度差異顯著的真菌(圖2，表4).其中，順產(chǎn)嬰兒的念珠菌屬的豐度在肘窩、前臂和指縫3個部位中都顯著高于剖腹產(chǎn)嬰兒(肘窩：45.5%，0.8%；前臂：29.3%，2.8%；指縫：10.3%，0.3%；P=0.001, 0.0007和0.001)，而馬拉色菌屬的豐度只在前臂部位顯著小于剖腹產(chǎn)嬰兒(33.4%，66.6%，P=0.0004)，另外，紅酵母屬(Rhodotorula)的豐度在指縫部位高于剖腹產(chǎn)嬰兒(1.8%,0.05%,P=0.03).

2.4母親和嬰兒皮膚真菌群落的關聯(lián)性

根據(jù)Beta多樣性得到的樣品間的Bray-Curtis距離，分別計算了每個母親與1)自己的嬰兒，2)相同生產(chǎn)方式的其他嬰兒，以及3)不同生產(chǎn)方式嬰兒的平均Bray-Curtis距離，以此來比較互相之間真菌群落差異的大小.在3個剖腹產(chǎn)的母親中有兩個母親(M01和M03)的皮膚真菌群落，相比其他嬰兒，都與自己的嬰兒皮膚真菌群落更相似(P<0.05).如果與順產(chǎn)嬰兒相比，所有剖腹產(chǎn)母親的真菌群落都與剖腹產(chǎn)嬰兒的更接近(P<0.05，圖3(a)).相反，順產(chǎn)母親的皮膚真菌群落并沒有與自己的嬰兒更相似(除了M05，圖3(b)).

3　討　論

本研究的測序深度相對來說比較低，平均每個樣品只有531條序列，最少的樣品只有150條.不過150條的測序深度也足夠覆蓋皮膚表面大部分豐度較高的微生物[21].有研究表明相似的測序深度并不會影響對主要的微生物群落特征的考察，并且還發(fā)現(xiàn)100～400條不等的測序深度反映出來的樣品之間的相互關系是一致的[22].此外，有研究還發(fā)現(xiàn)測序深度較淺但樣品數(shù)多的數(shù)據(jù)集，其優(yōu)點明顯大于樣品數(shù)少而測序量大的數(shù)據(jù)集[23-24].本研究中所有部位的樣品都間隔一天進行了3次重復采樣，大大增加了樣品數(shù).而且3次重復采樣的樣品之間沒有顯著差異，證明了實驗結果的可再現(xiàn)性，同時也說明人的皮膚真菌群落具有與細菌群落一致的隨時間推移而相對穩(wěn)定的特點[1, 25].

母親皮膚表面的真菌群落中馬拉色菌占主導，其他主要屬包括念珠菌屬、枝孢霉屬和鏈格孢霉屬，這與我們以前研究中的成年人女性皮膚真菌群落組成的結果一致[15].本研究中發(fā)現(xiàn)母親不同皮膚部位的真菌群落有著顯著差異，并且皮膚表面的微環(huán)境(油性、濕性和干性)是影響群落結構的重要因素.這與成年人皮膚表面微生物群落(不論是真菌還是細菌)具有部位特異性的研究結論一致[1,25-26].有研究進一步發(fā)現(xiàn)真菌群落多樣性最高的是與腳相關的部位，如腳后跟、腳趾等；其次是與手相關的部位，如前臂、肘窩等；多樣性最低的是軀干上的部位如額頭、背部、腹股溝等[26].本研究雖然沒有考察如此多的皮膚部位，但在分析的6個部位里也發(fā)現(xiàn)與手相關部位(手背、前臂、指縫和肘窩)的真菌群落多樣性高于軀干上的皮膚部位(額頭和背部).同時我們注意到多樣性較低的兩個部位均是油性部位，而馬拉色菌作為嗜脂菌偏好油脂含量高的部位[27]，所以這兩個部位上的馬拉色菌含量也遠高于其他部位.可能也正是基于此，大量的馬拉色菌擠占了其他真菌的生長空間，從而降低了油性部位的多樣性.結果中也確實發(fā)現(xiàn)除了馬拉色菌外的主要真菌在油性部位的豐度都要比在其他部位的豐度低.

而對于出生2～4個月的嬰兒，他們不同皮膚部位間的真菌群落差異并沒有作為成年人的母親不同部位間的差異大.有研究采集了剛出生5分鐘嬰兒的皮膚、口腔、呼吸道分泌物和糞便的微生物，發(fā)現(xiàn)不同部位間的細菌群落沒有顯著性差異[8].但是嬰兒的皮膚細菌群落多樣性在出生的第一年會隨著時間不斷增加[13].皮膚的真菌群落可能也和細菌群落類似，有一個不斷發(fā)展變化的過程.2～4個月嬰兒的皮膚真菌群落雖然還沒有體現(xiàn)出和成年人一樣的部位特異性，但和剛出生的嬰兒相比還是體現(xiàn)了一定的部位差異.而且母嬰相同部位的主要真菌(除了馬拉色菌)的豐度以及Alpha多樣性都沒有顯著差異，說明2～4個月的嬰兒的皮膚真菌群落組成已經(jīng)與母親的皮膚真菌群落比較接近.除了部位的差異性.本研究還發(fā)現(xiàn)分娩方式對嬰兒的皮膚真菌群落的影響顯著.順產(chǎn)嬰兒的皮膚真菌群落多樣性顯著高于剖腹產(chǎn)嬰兒，并且順產(chǎn)嬰兒的個體差異和部位差異也都比剖腹產(chǎn)嬰兒大.這可能是因為相比剖腹產(chǎn)嬰兒，順產(chǎn)嬰兒由于分娩時經(jīng)過陰道，多了真菌的一種來源.并且確實有研究發(fā)現(xiàn)剛出生嬰兒皮膚表面的細菌群落與母親陰道的細菌群落極為相似[8]，說明順產(chǎn)這種分娩方式確實會將陰道的微生物轉移到嬰兒的皮膚上.而且本研究中還發(fā)現(xiàn)順產(chǎn)嬰兒的念珠菌豐度顯著高于剖腹產(chǎn)的嬰兒.念珠菌是一種在大多數(shù)孕期女性陰道中比較常見的真菌[28]，即使是健康的未孕女性中也有近20%的人陰道攜帶念珠菌[29].這意味著順產(chǎn)嬰兒皮膚上的念珠菌很有可能來自分娩時與母親陰道的接觸.而且念珠菌是一種常見的條件致病菌，會感染人體不同部位引起各種疾病[30].所以對于順產(chǎn)嬰兒皮膚含有較多的念珠菌的現(xiàn)象要引起重視，做好相關真菌疾病的早期防治.

本研究還考察了每一對母嬰之間真菌群落的關聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)剖腹產(chǎn)的母親與自己孩子的皮膚真菌群落更相似，而順產(chǎn)的母親卻并不都與自己的小孩更相似.有研究發(fā)現(xiàn)嬰兒臉頰的馬拉色菌可能來自其母親皮膚，并且從出生第一天起馬拉色菌的豐度就不斷增加，在第30天達到成人皮膚中馬拉色菌的豐度[31].這說明嬰兒在出生后由于與自己的母親有更多的接觸，使得母親皮膚表面的真菌成為其真菌群落組成的重要來源.雖然與剖腹產(chǎn)的嬰兒一樣，順產(chǎn)嬰兒也都與自己的母親生活在一起，但幾個月之后也能保留順產(chǎn)時所接觸的母親陰道的真菌，說明分娩方式對皮膚微生物組成的影響是較長期的.

本次的研究證實了嬰兒皮膚的真菌群落如同細菌群落會受到分娩方式的影響，而且母親陰道的真菌可能是順產(chǎn)嬰兒皮膚真菌群落的一個重要來源.這個結論提示我們對于青少年的皮膚真菌群落的演變與建立，需要從包括分娩方式等因素在內(nèi)的更長時間軸去考量.雖然在本研究中對189個樣本進行了分析，但因這些樣本來源于6對母嬰，所以個體差異可能引起一些干擾，因此需要對更多的母嬰進行分析，提高所得結論的可信度.對于不同分娩方式嬰兒皮膚真菌組成差異的考察，將有助于對嬰幼兒皮膚清潔產(chǎn)品的開發(fā)以及早期真菌皮膚病的防治.

致謝: 本研究得到強生(中國)有限公司的資助.

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Delivery Modes Affected Skin Fungal Communities of Infants

YING Shi1, TAN Yuan2, QUAN Zhexue1

(1.Department of Microbiology and Microbial Engineering, School of Life Sciences, FudanUniversity,Shanghai200438,China; 2.ScientificAffairs,Johnson&JohnsonChinaLtd.,Shanghai200245,China)

Upon delivery, infants leave the microorganism-free uterus and are exposed for the first time to a wide variety of microbes which shape the initial microbiota’s establishment. Thus the delivery modes determine whether microbe source that an infant first contact is mother’s vagina or surrounding environments. To determine the influence of different delivery modes to the fungal community composition on infants’ skin, we analyzed fungal communities of six skin sites from 6 mothers and their corresponding 2—4 month old infants with three replications (189 qualified samples in total) through high-throughput pyrosequencing. The results show that delivery mode had significant influence on the skin fungal community compositions of 2-4 month old infants.Candida, the common fungi in vagina of pregnant women, was significantly more abundant on the skin of vaginally delivered infants than on the skin of infants born via C-section. In contrast,Malassezia, the dominant fungi on mothers’ skin, was more abundant on the skin of infants born via C-section. Meanwhile, C-section mother’s fungal community was significantly more similar to her own infant’s microbiota than to the microbiota of other infants. However, skin fungal communities of vaginally delivered mothers were no more similar to their own infants than to the other infants.

delivery modes; skin fungi; high-throughput pyrosequencing; community composition

0427-7104(2016)02-0239-08

2015-04-23

應時(1989—)，男，碩士；全哲學，男，教授，通訊聯(lián)系人，E-mail：quanzx@fudan.edu.cn.

Q 938.1+5

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