IC法快速同時(shí)測(cè)定低分子右旋糖酐氨基酸注射液中EDTA和NaHSO3的含量

余燕，梁蔚陽(yáng)

(廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180)

IC法快速同時(shí)測(cè)定低分子右旋糖酐氨基酸注射液中EDTA和NaHSO3的含量

余燕，梁蔚陽(yáng)Δ

(廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180)

目的建立一種離子色譜抑制電導(dǎo)法，用于快速測(cè)定低分子右旋糖酐氨基酸注射液中EDTA和NaHSO3的含量。方法采用Dionex的陰離子交換色譜柱IonPac AS11-HC和IonPac AH11-HC保護(hù)柱對(duì)樣品進(jìn)行分離，以13 mmol/L的KOH溶液為淋洗液，流速為1.0 mL/min抑制性電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)。抑制電流為70 mA，電導(dǎo)檢測(cè)器溫度為35 ℃，樣品經(jīng)稀釋后直接經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣。結(jié)果實(shí)驗(yàn)表明，EDTA和NaHSO3分別在1.25～20.12、3.86～61.82(g/m范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R>0.9990)，2者平均回收率分別為100.89%、95.3%。結(jié)論該方法準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便快速，選擇性高，重現(xiàn)性好，可用于低分子右旋糖酐氨基酸注射液中EDTA和NaHSO3的含量的快速同時(shí)檢測(cè)。

離子色譜；低分子右旋糖酐氨基酸注射液；EDTA；NaHSO3

作為一種重要復(fù)方制劑，低分子右旋糖酐氨基酸注射液常用于治療兼有蛋白質(zhì)缺乏的血容量減少患者。該注射液是由右旋糖酐40和包括色氨酸、亮氨酸、胱氨酸等11種氨基酸制成的滅菌水溶液，因所含色氨酸、胱氨酸性質(zhì)不穩(wěn)定，在光照或遇氧化劑條件下易被氧化，故處方中加入了NaHSO3及EDTA二鈉(以下簡(jiǎn)稱(chēng)EDTA)。NaHSO3及EDTA是醫(yī)藥工業(yè)中常用的輔料，其中前者為抗氧化劑，后者則可與金屬離子形成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物，從而降低右旋糖酐40與金屬離子間的氧化反應(yīng)，提高藥物的穩(wěn)定性。但微過(guò)量的NaHSO3可使患者短時(shí)間內(nèi)發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，造成肝功能患者轉(zhuǎn)氨酶升高甚至肝壞死[1-2]；同樣過(guò)量的EDTA也會(huì)引起患者惡心、頭痛、尿急、血液凝固性降低甚至心臟停搏等不良反應(yīng)[3-6]。因此，對(duì)注射用藥物中NaHSO3及EDTA輔料的用量控制成為藥品質(zhì)量控制的關(guān)鍵之一。目前NaHSO3及EDTA的測(cè)定方法多采用電位滴定法、液相色譜法、氣相色譜法等[7-13]。其中電位滴定法選擇性差、靈敏度低；液相和氣相檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)成本高，不利于批量檢測(cè)。離子色譜法(IC)具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、可同時(shí)測(cè)定多組分等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥食品檢測(cè)行業(yè)中得到越來(lái)越廣泛的重視，如《中國(guó)藥典》(2010年版)在新增的3個(gè)附錄中其中就有離子色譜被一二三部附錄同時(shí)收載。

本文在建立對(duì)NaHSO3及EDTA同時(shí)檢測(cè)的IC法基礎(chǔ)上，對(duì)委托檢驗(yàn)樣品中2者的含量進(jìn)行測(cè)定，以控制低分子右旋糖酐氨基酸注射液的質(zhì)量，排除用藥安全的潛在隱患。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 美國(guó)Dionex ICS-2000型離子色譜儀(配有EGC Ⅱ KOH自動(dòng)淋洗液發(fā)生器，AS40自動(dòng)進(jìn)樣器)。試驗(yàn)用水由Mili Pore超純水機(jī)制備，電阻率為18.2MQ·cm。

NaHSO3對(duì)照品(購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)20110102-2，含量95.12%)、EDTA對(duì)照品(購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)20110201-1，分子量372.24，含量99.0%)、低分子右旋糖酐氨基酸注射液(由廣東韶關(guān)麗珠集團(tuán)利民制藥廠送檢，批號(hào)為1102032及1102038，規(guī)格為100 mL)

1.2 方法

1.2.1 色譜柱及色譜條件：陰離子交換色譜柱AS11分析柱：IonPac AS11-HC (4×250 mm)，Dionex公司；保護(hù)柱：IonPac AH11-HC (4×50 mm)，Dionex公司；淋洗液：KOH溶液(13 mmol/L)；淋洗液罐：EGCⅡ KOH(序列號(hào)090581489019)；抑制型電導(dǎo)檢測(cè)器：ASRS 400 4 mm；抑制電流：70 mA；自動(dòng)進(jìn)樣器：AS40 Automated Sampler；進(jìn)樣量：25uL；柱溫：35 ℃。

1.2.2 儲(chǔ)備液、混合對(duì)照品溶液及供試品溶液的配置：對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制：精密稱(chēng)取EDTA對(duì)照品0.05059g置100 mL量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，作為EDTA對(duì)照品儲(chǔ)備液1；再精密量取1 mL至100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度。精密稱(chēng)取NaHSO3對(duì)照品0.15990g，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，作為NaHSO3對(duì)照品儲(chǔ)備液2。

混合對(duì)照品溶液的配制：分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2各1 mL至100 mL量瓶中，用水定量稀釋制成每1 mL中分別約含EDTA 5 μg和NaHSO316 μg的溶液作為混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液的配制：精密量取本品1 mL置50 mL量瓶中，加水定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾即得。

1.2.3 線性關(guān)系考察：分別取EDTA 和NaHSO3對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密量取0.5 mL至200 mL量瓶、0.5 mL至100 mL量瓶、1 mL至100 mL量瓶、2 mL至100 mL量瓶、4 mL至100 mL量瓶；然后分別加水溶解、定量稀釋制成每1 mL分別含EDTA 1.25、2.5、5、10、20 μg，以及每1 mL含NaHSO34、8、16、32、64 μg的溶液，分別作為對(duì)照品溶液S1、S2、S3、S4、S5。分別以EDTA和NaHSO3的峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸。

1.2.4 精密度試驗(yàn)：取其中一批(批號(hào)為1102032)的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算EDTA和NaHSO3峰面積的RSD。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)：取批號(hào)為1102032同批注射液6份，分別進(jìn)樣，計(jì)算峰面積的RSD。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取批號(hào)為1102032含量測(cè)定下的樣品，放置1、2、4、8、12、24、48h后測(cè)定EDTA和NaHSO3峰面積的RSD。

1.2.7 加樣回收率試驗(yàn)：精密移取批號(hào)為1102032樣品0.5 mL至100 mL量瓶中，共9份，平均分成3組，分別加入EDTA對(duì)照品儲(chǔ)備液和NaHSO3儲(chǔ)備液300、500、700 μL。計(jì)算EDTA和NaHSO3的回收率、平均回收率和RSD。

1.2.8 檢測(cè)限試驗(yàn)：將EDTA和NaHSO3對(duì)照品儲(chǔ)備液按照比例定量稀釋?zhuān)孕旁氡?s/n=3)時(shí)，測(cè)定EDTA和NaHSO3的檢測(cè)限濃度。

1.2.9 樣品測(cè)定：取送檢的2批樣品，量取1 mL至50 mL量瓶中并定容，并依建立的IC檢測(cè)方法測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 線性回歸方程 經(jīng)計(jì)算EDTA的線性方程為：y=0.0395x-0.0327(R=0.9990)；NaHSO3的線性方程為：y=0.1438x-0.3908(R=0.9993)。表明EDTA在1.25～20.03 μg/mL范圍內(nèi)、NaHSO3在3.82～60.84 μg/mL范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度試驗(yàn) 批號(hào)為1102032的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得EDTA和NaHSO3峰面積的RSD分別為0.35%和0.53%。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 批號(hào)為1102032同批注射液6份，分別進(jìn)樣后峰面積的RSD為0.89%。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 批號(hào)為1102032含量測(cè)定下的樣品，在放置1、2、4、8、12、24、48 h后測(cè)定結(jié)果顯示EDTA峰面積的RSD為1.49%、NaHSO3峰面積的RSD為0.87%，表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率試驗(yàn) 結(jié)果顯示，EDTA的回收率為99.4%～102.3%，平均回收率為100.8%，RSD為1.30% ；NaHSO3的回收率為94.2%～96.6%，平均回收率為95.3%，RSD為0.93%。表明該方法測(cè)定低分子右旋糖酐氨基酸注射液中NaHSO3和EDTA的含量回收率較好。

2.6 檢測(cè)限試驗(yàn) 結(jié)果顯示，EDTA的檢測(cè)限濃度為0.1 μg/mL，NaHSO3的檢測(cè)限濃度為0.06 μg/mL。

2.7 樣品測(cè)定 批號(hào)1102032 EDTA的含量為4.6%，NaHSO3的含量為10.2%；批號(hào)1102032 EDTA的含量為4.5%，NaHSO3的含量為9.8%。

3 討論

已有部分文獻(xiàn)對(duì)不同藥物中的EDTA及NaHSO3進(jìn)行IC檢測(cè)，如容彥華等[7]以10 mmol/L Na2CO3+1 mmol/L NaHCO3混合溶液為淋洗液，檢測(cè)卡絡(luò)磺鈉氯化鈉注射液中NaHSO3的含量；李恒等[8]以5 mmol/L Na2CO3+1 mmol/L NaHCO3混合溶液為淋洗液測(cè)定氨甲環(huán)酸注射液中EDTA的含量。筆者發(fā)現(xiàn)采用傳統(tǒng)的Na2CO3/NaHCO3淋洗液進(jìn)行分析時(shí)，背景電導(dǎo)較高，且EDTA和SO32-峰形較差。由于EDTA峰值和峰面積相對(duì)較小，且與相鄰的Cl-峰及NO3-峰保留時(shí)間非常接近，造成實(shí)際檢測(cè)上的困難；同樣SO32-峰與由于氧化產(chǎn)生的少量SO42-峰保留時(shí)間也非常接近，區(qū)分難度較大。筆者從進(jìn)樣的穩(wěn)定性、淋洗液成分與配比的優(yōu)化開(kāi)展大量試驗(yàn)，最終采用自動(dòng)精準(zhǔn)的在線淋洗液發(fā)生器，克服了人工配置淋洗液帶來(lái)的擾動(dòng)；并改用電導(dǎo)較低的KOH淋洗液，在保證背景噪聲穩(wěn)定的同時(shí)，最大限度降低了背景電導(dǎo)值，檢測(cè)峰對(duì)稱(chēng)性及峰形得以改善，EDTA及SO32-峰的分離度顯著提高。見(jiàn)圖1。

圖1 IC同時(shí)檢測(cè)EDTA和NaHSO3Fig.1 Detection of EDTA and NaHSO3 simultaneously

淋洗液濃度是影響陰離子分離效果的另一個(gè)重要因素，當(dāng)淋洗液濃度為4 mmol/L KOH溶液，NaHSO3對(duì)應(yīng)峰與少量由于氧化生成的NaHSO4雜質(zhì)峰重疊嚴(yán)重，當(dāng)溶液濃度提高到6～10 mmol/L時(shí)，EDTA峰形較差，當(dāng)KOH淋洗液濃度大于15 mmol/L，EDTA對(duì)應(yīng)峰與Cl-、NO3-等雜質(zhì)峰重疊嚴(yán)重。經(jīng)反復(fù)摸索，確定最佳淋洗液濃度為13 mmol/L，在該濃度淋洗液下EDTA2-、SO32-、Cl-、SO42-等多種陰離子可良好分離，與其他雜質(zhì)峰也無(wú)顯著干擾，能很好的同時(shí)對(duì)低分子右旋糖酐氨基酸注射液使用的金屬離子螯合劑EDTA和抗氧化劑NaHSO3進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

需要指出的是，雖然亞硫酸鈉和EDTA作為穩(wěn)定劑可以保持藥品的穩(wěn)定性在多種注射液中應(yīng)用，如奧拉西坦注射液、氨甲環(huán)酸注射液、硫酸依提米星注射液及中藥注射劑，但隨之而來(lái)的副反應(yīng)更加需要關(guān)注，如有研究表明亞硫酸鈉對(duì)多種生命物質(zhì)有影響，與染色體的交聯(lián)反應(yīng)可能是副反應(yīng)的主要原因[14]，美國(guó)FDA已正式要求廠家明確標(biāo)出藥品中所添加的抗氧化劑含量及臨床副作用，更有甚者如歐洲的愛(ài)爾蘭等國(guó)家已禁止含亞硫酸鹽的氨基酸溶液在臨床上的使用[15]。而我國(guó)現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)均未有EDTA及NaHSO3的限度控制，且不同企業(yè)在實(shí)際生產(chǎn)中加入抗氧化劑的量差異較大，從檢測(cè)方法的可靠性、藥品使用的安全性并參考國(guó)外相關(guān)藥品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合我國(guó)現(xiàn)有企業(yè)技術(shù)工藝水平，筆者推薦以2%和4%作為目前EDTA及NaHSO3輔料控制限值。

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(編校：吳茜)

DeterminationofsodiumhydrogensulfiteandEDTAindextran40andaminoacidsinjectionbyionchromatography

YU Yan, LIANG Wei-yang
(Guangdong Institute for Drug Control, Guangzhou 510180, China)

ObjectiveTo develop a suppressed conductivity ion chromatography method for the determination of antioxidant sodium bisulfite and EDTA in dextran 40 and amino acids injection.MethodsAn IonPac AS11-HC anion column was used, with 13 mmol/L potassium hydroxide solution as eluent and using suppressed conductivity detector. The current rate was controlled to 1.0 mL/min and electric current was 70 mA. The samples were injected by automatic sampler after diluted.ResultsThe calibration curve for sodium bisulfite was linear in the range of 1.25-20.12 and 3.86-61.82(g/L) respective to antioxidant sodium bisulfite and EDTA(R>0.9990). The average recovery was 100.89% and 95.3%.ConclusionThe method developed was accurate and convenient. It also has the characteristics of high selectivity and good reproducibility. This method is available for the determination of antioxidant sodium bisulfite and EDTA in dextran 40 and amino acids injection.

ion chromatography; dextran 40 and amino acids injection; sodium bisulfite; EDTA

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.005

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020218011，、2016A040403076)；越秀區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015-PT-004)

余燕，女，碩士，主管藥師，研究方向：生檢生化，E-mail：494409425@qq.com；梁蔚陽(yáng)，女，碩士,主任藥師，研究方向：生檢生化，E-mail：wl_1023@163.com

R453.9

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