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    ID1對非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKI耐藥的影響

    2016-08-30 01:55:30鮑昱辰趙印敏陳斌羅潔鄧沁芳孫輝謝博雄周崧雯
    中國肺癌雜志 2016年12期
    關(guān)鍵詞:吉非細(xì)胞株磷酸化

    鮑昱辰 趙印敏 陳斌 羅潔 鄧沁芳 孫輝 謝博雄 周崧雯

    肺癌的發(fā)病率和死亡率很高,嚴(yán)重威脅人類健康[1,2]。在我國城市中肺癌死亡率已上升為第一位[3]。隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)展,靶向藥已成為治療非小細(xì)胞肺癌的重要手段[4]。然而,即使對于敏感人群,第一代表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKI)(包括易瑞沙、特羅凱、凱美納)或早或晚仍會出現(xiàn)獲得性耐藥,導(dǎo)致疾病進(jìn)展[5,6],因此,如何克服耐藥提高療效已成為靶向藥治療的重要瓶頸[7,8]。分化抑制因子(differentiation inhibitory factor, ID)是一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子[9,10]。近年的研究表明,ID蛋白在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[11]。ID1作為ID蛋白家族成員,在多種腫瘤中呈高表達(dá),是一種潛在的癌基因[12,13]。有研究[14,15]認(rèn)為ID1與肺癌靶向藥耐藥相關(guān),但相關(guān)報(bào)道甚少,具體分子機(jī)制未明。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與儀器 肺腺癌細(xì)胞株H522、H1975、A549、PC-9、PC-9R由上海市肺科醫(yī)院中心試驗(yàn)室提供。其中PC-9為EGFR-TKI敏感株,PC-9R為EGFR-TKI獲得性耐藥株,H1975為T790M突變EGFR-TKI耐藥株,A549、H522為EGFR-TKI原發(fā)耐藥株,獲取我院肺癌手術(shù)患者癌組織及癌旁組織。青霉素、鏈霉素購自上海先鋒藥業(yè)公司;Trizol試劑購自Invitrogen公司;SYBR Green PCR試劑盒購自TAKARA公司;RNaseI購自Fermentas公司;兔抗人單克隆抗體購自Abcam公司;BSA購自北京索萊寶生物科技有限公司;吉非替尼購自大連美侖;Realtime檢測儀購自ABI公司;流式細(xì)胞儀購自Backman Coulter公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng) H522、H1975、A549、PC-9、PC-9R細(xì)胞用10%DMEM含雙抗培養(yǎng)液在細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(溫度為37 ℃且含5%CO2)中培養(yǎng),次日換液。培養(yǎng)基為90%EMEM,10%胎牛血清。0.25%胰酶-EDTA消化傳代,所有試驗(yàn)均采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

    1.3 ID1 siRNA慢病毒載體及ID1過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建ID1 siRNA慢病毒載體構(gòu)建:shRNA序列:5’-CATGAACGGCTGTTACTCA-3’;病毒滴度:8×108U/mL,同時(shí)構(gòu)建陰性對照慢病毒,ID1過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建:ID1基因片段引物:上游5’-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGAAAGTCGCCAGTGGCAG-3’;下游5’-TCCTTGTAGTCCATACCGCGACACAAGATGCGATC-3’。病毒滴度:2×108U/mL,同時(shí)構(gòu)建陰性對照慢病毒。胰酶消化各組肺腺癌細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液;顯微鏡下數(shù)出細(xì)胞總數(shù),熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況。

    1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度,每孔懸液約100 μL,以5,000個(gè)/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,37 ℃、CO2培養(yǎng)24 h;棄培養(yǎng)基,加入含不同濃度吉非替尼(0 μmol/L、0.01 μmol/L、0.05 μmol/L、0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h;每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL,37 ℃培養(yǎng)4 h;吸去上清液,加入200 μL二甲基亞砜(DMSO),使結(jié)晶物充分溶解;采用酶標(biāo)儀檢測570 nm的吸光度(A)值,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔;按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖率:[(空白組吸光度平均值-DMSO空白組平均值)-(各組平均值-DMSO空白組平均值)]/(空白組平均值-DMSO空白組平均值) ×100%=抑制率;采用直線回歸方法計(jì)算藥物的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.5 Real-Time PCR檢測各組腫瘤細(xì)胞ID1 mRNA的表達(dá)情況 去對數(shù)生長的各組肺腺癌細(xì)胞,Trizol法提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,ID1上游引物序列:5’-AAACGTGCTGCTCTACGACA-3’,ID1下游引物序列:5’-GGAACGCATGCCGCCT-3’,GAPDH上游引物序列:5’-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3’,GAPDH下游引物序列:5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’;95 ℃變性10 min后,按下述條件擴(kuò)增40個(gè)循環(huán),95 ℃,15 s;60 ℃,45 s;60 ℃延伸1 min。

    1.6 免疫組化檢測ID1蛋白的表達(dá) 選取標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定后,常規(guī)石蠟包埋、切片,厚度4 μm。采用免疫組化SP法,用PBS液代替一抗作為陰性對照,按照試劑說明書進(jìn)行操作。結(jié)果判斷:所有切片均采用雙盲法由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片。ID1陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜,呈淺黃色、黃色或棕黃色。隨機(jī)選擇10個(gè)高倍鏡視野(400倍),每個(gè)視野連續(xù)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,共計(jì)數(shù)1,000個(gè)細(xì)胞。最后表達(dá)以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率的得分之和進(jìn)行判斷:無染色記0分,弱染色記1分,中等染色記2分,強(qiáng)染色記3分;陽性細(xì)胞率<5%記0分,5%-25%記1分,26%-50%記2分,>50%記3分。上述兩項(xiàng)評分相加,<3分為陰性,≥3分為陽性。

    1.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期的經(jīng)siRNA慢病毒載體及ID1過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染的H522、H1975、A549、PC-9、PC-9R細(xì)胞,收集細(xì)胞裂解提取蛋白。BCA法測定細(xì)胞裂解物的蛋白含量,取等量蛋白質(zhì)以12% SDS-PAGE法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,以單克隆抗體4 ℃過夜孵育以檢測目標(biāo)蛋白(p-ERK、ERK、p-AKT、AKT、p-STAT3、STAT3、p-EGFR、EGFR),GAPDH作為內(nèi)參。洗去一抗,以HRP連接的二抗于室溫孵育2 h,洗滌后以ECL試劑盒顯示免疫印跡條帶。

    1.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 將肺腺癌細(xì)胞PC-9、PC-9/ID1-OE、PC-9/R、PC-9/R/ID1-KD細(xì)胞接種至75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞擴(kuò)增至90%,胰酶消化,接種至BALB/c-nu裸鼠腋下;每只接種1×108個(gè)細(xì)胞。每株肺腺癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各設(shè)空白對照和吉非替尼兩組。待腫瘤直徑生長至3 mm左右時(shí),空白對照組使用生理鹽水灌胃治療,吉非替尼組使用吉非替尼灌胃治療(劑量為2 mg/kg/d),每天灌胃一次,持續(xù)4周;4周后,頸椎脫臼法處死,剝離腫瘤組織,測量腫瘤大小。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)均以Meab±SD表示,單變量兩組間資料比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 ID1在肺癌細(xì)胞株中高表達(dá) 肺癌細(xì)胞株H522、H1975、A549、PC-9、PC-9R中的ID1 mRNA均有表達(dá)(圖1)。肺癌組織ID1 mRNA的表達(dá)比癌旁組織中高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖2A)。肺癌組織ID1蛋白的表達(dá)比癌旁組織中表達(dá)高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖2B)。

    2.2 ID1與肺癌耐靶向藥的關(guān)系 PC-9R細(xì)胞中ID1 mRNA表達(dá)量高于PC-9細(xì)胞,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1,圖3)。根據(jù)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇PC-9細(xì)胞株感染ID1過表達(dá)慢病毒載體(ID1-OE),H522、H1975、A549、PC-9R細(xì)胞株感染ID1干擾慢病毒載體。72 h后用熒光顯微鏡觀察,各組病毒感染率均大于90%,符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。MTT法檢測吉非替尼對各組細(xì)胞增殖抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PC-9細(xì)胞感染ID1過表達(dá)慢病毒后,對吉非替尼的IC50值為0.64 μmol/L,較對照組(0.05 μmol/L)有一定程度的上升。PC-9R細(xì)胞感染ID1干擾慢病毒后,對吉非替尼的IC50值為1.14 μmol/L,較對照組(5.05 μmol/L)有一定程度的下降(表1)。而A549、H522、H1975細(xì)胞在感染ID1干擾慢病毒后,對吉非替尼的IC50值無明顯改變。

    2.3 各組細(xì)胞株在感染ID1干擾慢病毒后,ID1的表達(dá)情況 慢病毒感染后,H522、H1975、PC-9R、A549細(xì)胞中ID1表達(dá)下降,PC-9細(xì)胞中ID1表達(dá)上升(圖4)。ID1-siRNA慢病毒感染PC-9R后,p-ERK、p-AKT、p-STAT3、p-EGFR有不同程度下降,ERK、AKT、STAT3、EGFR無明顯改變;吉非替尼處理后,ID1-siRNA組ERK、AKT、EGFR磷酸化程度較對照組明顯降低。ID1-OE慢病毒感染PC-9后,磷酸及非磷酸ERK、AKT、STAT3、EGFR均無明顯改變;吉非替尼處理后,PC-9-ID1-OE組AKT、STAT3磷酸化程度較對照組有一定程度升高(圖5)。

    2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果 PC-9實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均體積為50.8 mm3,對照組腫瘤平均體積3,283.6 mm3,腫瘤抑制率為98.5%;PC-9(ID1 OE)實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均體積為465.5 mm3,對照組腫瘤平均體積為1,084.7 mm3,腫瘤抑制率為57.1%,組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。PC-9/R實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均體積為81.2 mm3,PC-9/R對照組腫瘤平均體積為371.8 mm3(圖5A),腫瘤抑制率為78.2%;PC-9/R(ID1 siRNA)實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均體積為0,對照組腫瘤平均體積為85.3 mm3(圖5B),腫瘤抑制率為100%,組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2),值得注意的是,ID1基因沉默后,PC-9/R腫瘤生長極為緩慢,28 d僅增長0.9倍。

    3 討論

    本研究證實(shí)了ID1參與非小細(xì)胞肺癌對EGFR-TKI耐藥,且與手術(shù)患者預(yù)后相關(guān)。在探討ID1是否參與肺癌靶向藥耐藥的相關(guān)研究中,我們檢測了PC9及PC-9/R、H1975、A549、H522多組肺癌細(xì)胞株中ID1 mRNA。發(fā)現(xiàn)PC-9細(xì)胞中ID1 mRNA相對表達(dá)量較低,而PC-9/R細(xì)胞則明顯升高,說明ID1與肺癌EGFR-TKI耐藥相關(guān)。同時(shí),發(fā)現(xiàn)H1975、A549、H522多組肺癌細(xì)胞株中ID1高表達(dá),故對非小細(xì)胞肺癌手術(shù)標(biāo)本免疫組化及RT-PCR檢測,提示ID1在肺癌組織中較正常組織明顯升高(P<0.05);分層分析顯示,病理類型對ID1表達(dá)有意義,在鱗癌患者中呈高表達(dá);分期及性別與ID1表達(dá)無相關(guān)性;1年OS與ID1表達(dá)分析提示,ID1與肺癌預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步探討ID1與非小細(xì)胞肺癌對EGFR-TKI耐藥的相關(guān)性:使用慢病毒干擾技術(shù),過表達(dá)及沉默肺癌細(xì)胞株ID基因的表達(dá),再檢測ID1蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示:PC-9細(xì)胞感染ID1過表達(dá)慢病毒后,對吉非替尼的IC50值為0.64 μmol/L,較對照組(0.05 μmol/L)有一定程度的上升,說明PC-9敏感性降低;PC-9/R細(xì)胞感染ID1干擾慢病毒后,對吉非替尼的IC50值為1.14 μmol/L,較對照組(5.05 μmol/L)有一定程度的下降,說明PC-9/R耐藥性降低(表1)。荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果:PC-9 ID1-OE吉非替尼用藥組腫瘤體積大于PC-9吉非替尼用藥組。同時(shí)發(fā)現(xiàn),吉非替尼處理后,ID1-siRNA組ERK、AKT、EGFR磷酸化程度較對照組明顯降低,ID1-OE組AKT、STAT3磷酸化程度較對照組有一定程度升高。這說明:ID1表達(dá)量與肺癌EGFR-TKI耐藥性呈正相關(guān);STAT3可能通過磷酸化機(jī)制參與EGFR-TKI耐藥。有研究[16]發(fā)現(xiàn),STAT3的siRNA或抑制劑通過抑制STAT3激活,增強(qiáng)了肺癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感性。但目前STAT3介導(dǎo)吉非替尼耐藥的機(jī)制還不是很明確,需要進(jìn)一步研究。

    圖1 肺癌細(xì)胞株H522、H1975、A549、PC-9、PC-9R中的ID1 mRNA相對表達(dá)量(P<0.05)Fig 1 Relative expression of ID1 mRNA in H522, H1975, A549, PC-9 and PC-9R lung cancer cell lines (P<0.05)

    圖2 ID1在肺癌組織與癌旁組織的相對表達(dá)量(P<0.05)。A:肺癌組織ID1 mRNA的表達(dá)量比癌旁組織中ID1 mRNA的表達(dá)量高(P<0.05);B:肺癌組織ID1蛋白的表達(dá)比癌旁組織中ID1蛋白的表達(dá)高(P<0.05)。Fig 2 Relative expression of ID1 in lung cancer tissues and adjacent tissues.A: The expression of ID1 mRNA in lung cancer tissues is relatively higher than that in adjacent tissues (P<0.05); B, C: The expression of ID1 protein in lung cancer tissues is higher than that in adjacent tissues(P<0.05).iOD: integral optical density.

    圖3 PC-9R細(xì)胞中ID1 mRNA表達(dá)量高于PC-9細(xì)胞(P<0.05)。Fig 3 The expression of ID1 mRNA in PC-9/R cell lines is higher than that in PC-9 cell lines (P<0.05).

    本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞、動(dòng)物到臨床標(biāo)本深入探討了ID1與肺癌之間的關(guān)系,證實(shí)ID1在肺癌組織中高表達(dá),其中以腺癌尤為明顯,且ID1參與非小細(xì)胞肺癌對EGFR-TKI的獲得性耐藥。ID1或可成為非小細(xì)胞肺癌有價(jià)值的檢測項(xiàng)目[17];ID1參與肺癌對EGFR-TKI的耐藥,可能與STAT3的磷酸化有關(guān),具體機(jī)制還有待我們接下來更深入地研究[17]。

    圖4 慢病毒感染后,各組細(xì)胞ID1的表達(dá)情況以及PC-9R中不同信號通路的酶表達(dá)情況。A:慢病毒感染后,H522、H1975、PC-9R、A549細(xì)胞中ID1表達(dá)下降,PC-9細(xì)胞中ID1表達(dá)上升;B:ID1-siRNA慢病毒感染PC-9R后,p-ERK、p-AKT、p-STAT3、p-EGFR有不同程度下降,ERK、AKT、STAT3、EGFR無明顯改變;吉非替尼處理后,ID1-siRNA組ERK、AKT、EGFR磷酸化程度較對照組明顯降低。ID1-OE慢病毒感染PC-9后,磷酸及非磷酸ERK、AKT、STAT3、EGFR均無明顯改變;吉非替尼處理后,PC-9-ID1-OE組AKT、STAT3磷酸化程度較對照組有一定程度升高。Fig 4 After slow viral infection, groups of cells expressed the ID1 enzyme in different signaling pathways of PC-9R.A: After infection of ID1-siRNA; ID1 expression decreases in H522, H1975, PC-9R, and A549 while increasing in PC-9;B: After infection of ID1-siRNA in PC-9R, p-ERK, p-AKT, p-STAT3 and p-EGFR decreased, whereas ERK, AKT, STAT3 and EGFR showed no change.Following gefitinib treatment, the extent of phosphorylation of ERK, AKT and EGFR in ID1-siRNA is lower than that in the control group.After infection of ID1-OE in PC-9, the extent of phosphorylation or non-phosphorylation of ERK, AKT and EGFR showed no change.After gefitinib treatment, the extent of phosphorylation of AKT and STAT3 in PC-9-ID1-OE is higher than that in the control group.

    圖5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A:PC-9/R(ID1-OE)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(標(biāo)尺上方,第一行:對照組剝離腫瘤;第二行:灌胃組剝離腫瘤);B:PC-9R(ID1-siRNA)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(標(biāo)尺上方,第一行:對照組剝離腫瘤,第二行:灌胃組因腫瘤消失,故空行),值得注意的是,ID1基因沉默后,PC-9R(ID1 siRNA)腫瘤生長極為緩慢,28天僅增長0.9倍。Fig 5 Animal experiment.A: Experimental result of PC-9/R (ID1-OE)(Above scale, first line: control group stripping tumor, second line:lavage group stripping tumor); B: Experimental result of PC-9/R(ID1-siRNA) (Above scale, first line: control group stripping tumor,second line: when the tumor disappears, the lavage group is zero).Notably, with silence of the ID1 gene, tumor growth is very slow in PC-9R (ID1 siRNA), which grew only 0.9 times after 28 days.

    表1 各組腫瘤細(xì)胞IC50值和吉非替尼處理后凋亡率Tab 1 IC50 value in groups of tumor cells and apoptosis rate after treatment with gefitinib

    表2 吉非替尼治療組與對照組的瘤體體積與抑瘤率Tab 2 Gefitinib treatment group and control group in the volume of tumors and inhibitory rate

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