巖藻糖基化與腫瘤

張坤 綜述 王紅 審校

50%以上的真核生物蛋白存在翻譯后糖基化修飾，影響蛋白質(zhì)折疊、穩(wěn)定、運(yùn)輸、分泌以及生物功能[1-3]。在哺乳動(dòng)物寡糖合成系統(tǒng)中，巖藻糖是十種單糖之一，巖藻糖基化是糖蛋白、糖脂寡糖修飾中最常見的修飾方式；已知的巖藻糖修飾有ABO血型系統(tǒng)的H抗原、Lewis血型抗原；巖藻糖還參與選擇素介導(dǎo)的白細(xì)胞外滲或淋巴細(xì)胞歸巢、病原宿主相互作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的修飾；在多種病理情況下（如免疫、腫瘤），存在巖藻糖基化水平異常[4]。白細(xì)胞粘附缺陷II患者巖藻糖基化異常導(dǎo)致白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附缺陷[5]。Baumann等[6]于1979年首次報(bào)道了肝癌細(xì)胞中的巖藻糖基化的存在。AFP-L3，巖藻糖基化的甲胎蛋白（α-fetoprotein, AFP），AFP三種亞型之一，在日本（1996年）和美國（2005年）批準(zhǔn)作為肝細(xì)胞肝癌的腫瘤標(biāo)志物[7,8]。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)以及糖生物學(xué)研究手段的進(jìn)步，腫瘤中越來越多的異常巖藻糖基化被發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸以及治療抵抗方面發(fā)揮重要作用。

1 腫瘤中異常巖藻糖基化

1.1 生理?xiàng)l件下巖藻糖基化過程 巖藻糖基化是典型的末端修飾方式。包括N聚糖、粘蛋白型O糖以及直接與蛋白質(zhì)絲/蘇氨酸殘基羥基上相連的巖藻糖[4]。GDP巖藻糖是巖藻糖基化的唯一供體，其在細(xì)胞質(zhì)中合成，而后通過GDP巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GDP-L-fucose transporter, GDPL-Fuc Tr）進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體[9,10]。哺乳動(dòng)物可通過兩種途徑合成GDP巖藻糖。從頭合成途徑：通過3步反應(yīng)將GDP甘露糖轉(zhuǎn)化為GDP巖藻糖，催化反應(yīng)的酶為GDP甘露糖-4,6-脫水酶（GDP-mannose-4,6-dehydratase,GMDS）[11,12]和GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖-3,5異構(gòu)酶-4-還原酶（GDP-4-keto-6-deoxymannose-3,5-epimerase-4-reductase,FX）[13]；補(bǔ)救合成途徑：通過兩步反應(yīng)將L-巖藻糖轉(zhuǎn)化為GDP巖藻糖，催化反應(yīng)的酶為L-巖藻糖激酶[14]和GDP巖藻糖焦磷酸酶[15]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞僅有中10%GDP巖藻糖由補(bǔ)救合成途徑合成，因此從頭合成途徑在GDP巖藻糖合成中起關(guān)鍵作用[4]。

細(xì)胞中所有的巖藻糖基化都是由巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferases, FUT）催化。目前已知的人類巖藻糖基化轉(zhuǎn)移酶有13個(gè)[4]。蛋白氧巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶1、2（protein O-fucosyltransferase, POFUT）定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，其余定位于高爾基體[4,16,17]。FUT根據(jù)功能不同可分為四組，F(xiàn)ut1、Fut2參與α1-2巖藻糖合成，F(xiàn)ut3-7、Fut9-11參與α1-3巖藻糖合成，F(xiàn)ut3、5參與α1-4巖藻糖合成，F(xiàn)ut8參與α1-6巖藻糖合成。Fut1-7、Fut9-11參與末端巖藻糖基化修飾，將巖藻糖基與N-糖或O-糖的末端糖基相連；Fut8參與核心巖藻糖基化修飾，將巖藻糖基與N-糖最內(nèi)端的N乙酰葡萄糖相連[18,19]（圖1）。

1.2 腫瘤中異常巖藻糖基化及其調(diào)節(jié) 肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌等多種腫瘤中均存在巖藻糖基化異常[20,21]。GDP巖藻糖合成酶、巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶參與其中，其與腫瘤的分期、預(yù)后等密切相關(guān)。各種酶在不同腫瘤中的表達(dá)情況存在差異；同一種酶在腫瘤的不同病理類型以及不同階段表達(dá)情況也不完全相同。

1.2.1 腫瘤中GDP巖藻糖合成、轉(zhuǎn)運(yùn)異常 結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系[22]、肝細(xì)胞肝癌組織[23]中存在FX高表達(dá)。與原位結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系sw480相比，轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞系sw620中高表達(dá)FX，其與細(xì)胞SLea的表達(dá)成正相關(guān)，并可增強(qiáng)腫瘤-內(nèi)皮細(xì)胞粘附[22]。Moriwaki等[24]在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中發(fā)現(xiàn)GMDS外顯子5、6、7缺失從而導(dǎo)致酶活性喪失，細(xì)胞巖藻糖基化缺失。同時(shí)該研究組在胃絨毛膜癌患者網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移組織中也發(fā)現(xiàn)了GMDS突變（外顯子2、3、4缺失）。在肝細(xì)胞癌[23]及結(jié)直腸腫瘤組織[25]中存在GDP-L-Fuc Tr高表達(dá)。Moriwaki[23]的結(jié)果表明，GDP-L-Fuc Tr在肝癌細(xì)胞巖藻糖基化中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

1.2.2 腫瘤中巖藻糖基化修飾異常

1.2.2.1 核心巖藻糖基化異常 Fut8參與核心巖藻糖基化修飾。肺癌[26]、乳腺癌[27]、肝癌[28]、結(jié)直腸癌[29]、卵巢癌[30]、甲狀腺癌[31]等腫瘤組織中存在Fut8高表達(dá)，在胃癌[32]組織中Fut8表達(dá)下降，這種組織差異性的具體原因目前還不清楚，可能在不同組織中蛋白核心巖藻糖基化的功能不同。

1.2.2.2 末端巖藻糖基化異常 Fut1-7、Fut9-11均參與末端巖藻糖基化修飾，形成特異的lewis血型抗原，如I型lewis抗原表位Lea、sLea、Leb和II型lewis抗原表位Lex、sLex、Ley。其中的α1-2巖藻糖基化由Fut1、Fut2催化，α1-3巖藻糖基化由Fut3-7、Fut9催化，α1-4巖藻糖化由Fut3催化[27]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中存在Ley、sLex、sLea，三者在不同病理類型中表達(dá)存在很大差異，在腺癌中的表達(dá)最高，鱗癌和大細(xì)胞癌次之，與不表達(dá)者相比，表達(dá)者具有相對(duì)短的生存期[33]，乳腺癌中表達(dá)Lex、sLex、Ley，高表達(dá)sLex、Ley與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后相關(guān)[34-36]。結(jié)直腸癌中Lea、sLea、Lex、sLex，表達(dá)Lex、sLex的患者具有較短的生存期[37]。卵巢癌中表達(dá)Lea、sLea、Ley，不同病理類型中存在較大差異，粘液性腫瘤中表達(dá)Lea、sLea，而漿液性腫瘤中主要表達(dá)Ley[38]。這些結(jié)果表明，末端巖藻糖基化與腫瘤患者預(yù)后密切相關(guān)；在不同腫瘤組織、同一腫瘤不同病理類型中，末端巖藻糖基化存在較大差異。

圖 1 生理?xiàng)l件下巖藻糖基化過程。GDP巖藻糖通過從頭合成途徑及補(bǔ)救合成途徑在胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行合成，然后通過GDP巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者高爾基體，最終在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（POFUT1、2）及高爾基體（FUT1-11）中將巖藻糖轉(zhuǎn)移到受體上。Fig 1 Fucosylation pathways.GDP-fucose is synthesized in the cytoplasm from GDP-mannose (de novo pathway) or L-fucose(salvage pathway).In case it is compounded,GDP-fucose is transported into the ER/Golgi through GDP-fucose transporters.Fucose is transferred from GDP-fucose to acceptors in ER (POFUT1, 2) or Golgi (FUT1-11).

2 巖藻糖基化與腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移

腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程，包括原位腫瘤的增殖，向基底膜、血管侵襲移動(dòng)，穿入血管，與特定靶器官處血管內(nèi)皮粘附、穿出，最終在靶器官定植、增殖[39]。巖藻糖基化均參與了這一過程。

Ley存在于多種腫瘤組織中，與腫瘤增殖相關(guān)，其α1-3巖藻糖基化由Fut4催化[40-41]，人表皮鱗癌細(xì)胞系A(chǔ)431中過表達(dá)Fut4后，其增殖能力增加，S期細(xì)胞所占比例提高，進(jìn)一步研究表明，F(xiàn)ut4過表達(dá)通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）以及磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B, PKB/Akt）通路，增加周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinases, CDKs）及細(xì)胞周期蛋白（cyclins）表達(dá)，降低CDK抑制劑P21、P27表達(dá)[42]。

整合素家族與細(xì)胞生長、增殖、凋亡抵抗和惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，α3β1整合素參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[43,44]。Fut8敲除的鼠胚胎纖維母細(xì)胞α3β1整合素核心巖藻糖基化缺失，導(dǎo)致下游的FAK磷酸化水平降低，細(xì)胞侵襲、移動(dòng)能力下降[45]。

表皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要起始[39]，在此過程中，表皮細(xì)胞丟失細(xì)胞-細(xì)胞粘附特性，增加運(yùn)動(dòng)功能及侵襲能力。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β, TGF-β）是不同細(xì)胞表皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要誘導(dǎo)因子，介導(dǎo)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，結(jié)直腸癌細(xì)胞系中敲除Fut3和/或Fut6，抑制TGF-β誘導(dǎo)的表皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞侵襲能力[46]。乳腺癌細(xì)胞系中敲除Fut4，表皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)增加，間質(zhì)標(biāo)志物纖連蛋白、波形蛋白、N-cadherin、Snail、Twist、ZEB1表達(dá)下降，PI3K/Akt-糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinases-3β, GSK3β）信號(hào)通路及細(xì)胞核因子酉乙蛋白（nuclear factor kappa B, NF-κB）信號(hào)通路參與其中[47]。

選擇素與腫瘤細(xì)胞表面sLea、sLex相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞穿出血管[48,49]。過表達(dá)FX促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，而敲除FX降低其與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附[22]。表達(dá)Fut7肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)125能夠在血管內(nèi)皮細(xì)胞上滾動(dòng)，而缺乏Fut7轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)125卻不能[50]。造血系統(tǒng)細(xì)胞HL60，KG1a表達(dá)Fut4、7，結(jié)腸腫瘤細(xì)胞colo205表達(dá)Fut3、4、6，前列腺癌細(xì)胞MDA PCa2b表達(dá)Fut3，F(xiàn)ut3敲除抑制了循環(huán)腫瘤細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的滾動(dòng)，而不影響血液系統(tǒng)細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附[51]，可作為腫瘤治療的策略之一。

3 巖藻糖基化異常與腫瘤免疫逃逸

Moriwaki等[24]發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116細(xì)胞GMDS突變，導(dǎo)致細(xì)胞巖藻糖基化水平下降，與腫瘤形成、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，GMDS突變HCT-116細(xì)胞能夠逃避自然殺傷（natural killer, NK）細(xì)胞介導(dǎo)的免疫監(jiān)視，抵抗腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。同時(shí)，HCT-116細(xì)胞對(duì)CD95L的刺激也產(chǎn)生抵抗，其可能原因是GMDS突變抑制了Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（Fasaasociated death domain, FADD）依賴的復(fù)合物II中Caspase 8的激活[52]。人白血病細(xì)胞K562中轉(zhuǎn)染Fut7后，NK細(xì)胞對(duì)高表達(dá)sLex細(xì)胞的殺傷效能是野生型K562細(xì)胞的2.5倍，表明細(xì)胞表面sLex的存在促進(jìn)NK細(xì)胞的殺傷活性，而腫瘤細(xì)胞因低表達(dá)sLex從而逃避NK細(xì)胞的殺傷[53]。

4 巖藻糖基化與表皮生長因子受體

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）是細(xì)胞膜表面的糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。EGFR具有潛在的12個(gè)N糖基化位點(diǎn)[54]，N糖基化抑制劑明顯降低EGF與EGFR的結(jié)合[55]，A431肺腺癌細(xì)胞系中10個(gè)位點(diǎn)存在糖基化，其中7個(gè)位點(diǎn)存在巖藻糖基化修飾[56]。卵巢癌RMG-I細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染α1-2巖藻糖轉(zhuǎn)移酶后，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，其通過EGFR發(fā)揮作用，Akt、ERK1/2參與其中[57]。FUT8敲除的小鼠胚胎纖維母細(xì)胞，EGFR巖藻糖基化及磷酸化水平明顯下降，其下游信號(hào)分子JNK、ERK1/2磷酸化水平也受到抑制，同時(shí)親合力測試發(fā)現(xiàn)，核心巖藻糖基化的EGFR與EGF的親和力更高[58]，因此，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶通過對(duì)EGFR的活性產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

5 巖藻糖基化與肺癌

復(fù)旦大學(xué)的研究[59]顯示，13例轉(zhuǎn)移性肺癌患者中12例存在E-cadherin核心巖藻糖基化，而5例原位組織中E-cadherin均無核心巖藻糖基化，說明E-cadherin核心巖藻糖基化參與腫瘤的轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步研究表明核心巖藻糖基化可能破壞了E-cadherin N糖的三維結(jié)構(gòu)，從而影響其功能。

臺(tái)灣大學(xué)的研究[60]表明，肺腺癌細(xì)胞系CL1-5與CL1-0相比具有高侵襲能力，同時(shí)CL1-5具有更高的巖藻糖基化，其Fut8表達(dá)是CL1-0的22.5倍，說明巖藻糖基化與腫瘤的侵襲力相關(guān)。同時(shí)，肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中過表達(dá)Fut4/6導(dǎo)致EGFR二聚化、磷酸化水平下降，而CL1-0及A549細(xì)胞系中過表達(dá)Fut8對(duì)EGFR活性卻無影響，CL1-5細(xì)胞系中敲除Fut8后EGFR二聚化、磷酸化下降，提示過表達(dá)Fut4/6抑制了肺癌細(xì)胞中EGFR二聚化、磷酸化，同時(shí)表明FUT8在維持肺癌細(xì)胞EGFR二聚化、磷酸化中起關(guān)鍵作用。其后的研究中，該課題組[26]發(fā)現(xiàn)，140例I期-IV期的NSCLC患者（86例肺腺癌，46例肺鱗癌及8例肺大細(xì)胞癌）中均存在Fut8表達(dá)，在肺腺癌中Fut8表達(dá)水平最高，F(xiàn)ut8表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)，并且Fut8高表達(dá)者具有更短的無病生存期和總生存期，同時(shí)體外研究表明，過表達(dá)Fut8增加肺癌細(xì)胞系的增殖侵襲和轉(zhuǎn)移能力。其后，日本北海道大學(xué)和大阪大學(xué)的研究人員[61]發(fā)現(xiàn)，在I期及可治愈的外科切除的129例NSCLC患者中，高表達(dá)Fut8與不良預(yù)后相關(guān)。這些結(jié)果表明，核心巖藻糖基化與肺癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及疾病預(yù)后密切相關(guān)。靶向腫瘤中Fut8可能成為治療肺癌的新策略。

另外，在含表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）的培養(yǎng)條件下，沉默A549細(xì)胞中Fut8后，EGFR及MAPK磷酸化水平下降，其對(duì)吉非替尼的敏感性明顯下降，表明Fut8下調(diào)可降低野生型EGFR對(duì)酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）的敏感性[62]。同時(shí)這也可能是野生型EGFR高表達(dá)患者對(duì)吉非替尼有效的原因，其是否可以作為野生型患者EGFR-TKI療效的預(yù)測因子有待進(jìn)一步研究。

然而，其他巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶及GDP巖藻糖合成酶（GMDS和FX）在肺癌中的表達(dá)及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用目前還未知。

6 總結(jié)

腫瘤細(xì)胞巖藻糖基化異常參與細(xì)胞表面受體EGFR、TGF-βR的激活，影響整合素、選擇素、凋亡信號(hào)通路的功能，并最終參與腫瘤增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及藥物敏感性。大多數(shù)腫瘤中都存在巖藻糖基化異常，因此針對(duì)巖藻糖基化異常治療腫瘤將成為可能。然而，在不同腫瘤類型、同一腫瘤不同病理類型以及同一腫瘤的不同發(fā)展階段，其巖藻糖基化都有可能不同。其次，在不同腫瘤類型中，巖藻糖基化過程中酶的作用也可能不同，結(jié)直腸細(xì)胞系sw620中高表達(dá)FX可能增加了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，HCT116細(xì)胞中GMDS功能缺失促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。這給腫瘤中巖藻糖基化的研究帶來了挑戰(zhàn)。目前，對(duì)巖藻糖基化的研究還處于基礎(chǔ)階段，我們的首要工作是弄清各種酶在不同腫瘤中的作用及其機(jī)制。相信，巖藻糖基化的研究會(huì)有一個(gè)美好的前景，針對(duì)腫瘤中異常巖藻糖基化的治療會(huì)給腫瘤患者帶來曙光。