SIRT1通過(guò)調(diào)節(jié)Noxa表達(dá)影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549對(duì)順鉑的敏感性

曹彬 何曉峰 王文公 史敏科

順鉑以及基于順鉑的聯(lián)合化療方案已經(jīng)成為了目前臨床上治療非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的成熟方案，其效果明確，不良反應(yīng)相對(duì)較小，同時(shí)費(fèi)用經(jīng)濟(jì)[1]。但是，一些患者因?yàn)閭€(gè)體差異，對(duì)順鉑治療不敏感或在治療中產(chǎn)生了耐藥性，導(dǎo)致了順鉑治療方案的失敗。因此，改善患者對(duì)順鉑的敏感性是臨床亟待解決的問(wèn)題，然而當(dāng)前NSCLC患者對(duì)順鉑敏感性的差異機(jī)制并不十分明確[2]。SIRT1是一種依賴(lài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙?；?，具有調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)，調(diào)控細(xì)胞周期及凋亡的作用[3]。一些研究已經(jīng)指出，在腫瘤細(xì)胞中SIRT1具有抗凋亡作用并與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性降低有關(guān)。已有研究[4]發(fā)現(xiàn)對(duì)化療耐受的肝癌患者SIRT1表達(dá)較高且預(yù)后較差。但是SIRT1對(duì)于NSCLC順鉑敏感性的影響和機(jī)制仍未得知。Noxa是Bcl-2家族的成員之一，具有凋亡誘導(dǎo)作用。在化療藥物的處理下，Noxa會(huì)出現(xiàn)過(guò)量表達(dá)，因此可能影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。如有研究指出過(guò)低的Noxa表達(dá)會(huì)降低Bcl-2抑制劑ABT-737對(duì)食管癌細(xì)胞的敏感性[5]。本研究探討了SIRT1對(duì)NSCLC細(xì)胞株A549順鉑敏感性的影響并分析了其對(duì)Noxa表達(dá)的調(diào)節(jié)以期揭示其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 A549細(xì)胞株（上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；順鉑（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；CellTiter-Blue分析試劑盒[普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司]；熒光分光光度計(jì)；Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；用ImProm-II?反轉(zhuǎn)錄試劑盒[普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司]；GO Taq?qPCR Master Mix試劑盒[普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司]；實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物[寶生物工程（大連）有限公司]；siRNA序列（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；小鼠抗人SIRT1多克隆抗體；小鼠抗人Noxa多克隆抗體；小鼠抗人β-actin多克隆抗體；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；ECL發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Lipofectamine?2000試劑盒美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Annexin V-FITC-PI雙染凋亡分析試劑盒（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；BrdU細(xì)胞周期分析試劑盒（美國(guó)BD公司）；BMG Ω熒光讀板機(jī)（德國(guó)BMG LABTECH公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司），培養(yǎng)環(huán)境為5%CO2、37 ℃。A549/DDP細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境同A549細(xì)胞，但培養(yǎng)基含2 μg/mL順鉑，以維持其耐藥性。0.25%胰酶常規(guī)消化，選擇生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 Cell Titer Blue試驗(yàn)分析A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性差異 將A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞以1×104/孔的密度種植于96孔板。常規(guī)培養(yǎng)24 h后經(jīng)行處理。以未經(jīng)順鉑處理的細(xì)胞為對(duì)照組，其余細(xì)胞分別接受0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、8.0 μg/mL、16.0 μg/mL梯度濃度的順鉑處理24 h，同時(shí)設(shè)立無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)孔作為空白調(diào)零組，每組設(shè)5個(gè)平行孔。24 h后，棄去孔中原有液體，加入72 μL Cell Titer Blue工作液（Cell Titer Blue試劑：DMEM=1:10）。繼續(xù)孵育1 h后使用熒光讀板機(jī)檢測(cè)各組熒光強(qiáng)度并以公式存活率=（處理組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度）×100%計(jì)算細(xì)胞存活率，通過(guò)曲線(xiàn)擬合計(jì)算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration,IC50）。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SIRT1和NOXA的mRNA表達(dá)Trozal試劑提取A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞的總RNA。使用ImProm-II?反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取出的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系參照試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)。使用GO Taq?qPCR Master Mix試劑盒對(duì)上述合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SIRT1的上游引物為：5’ GCC TCA TCT GCA TTT TGA TG’3，下游引物為：5’ TCT GGC ATG TCC CAC TAT CA’3；NOXA的上游引物為：5’TTC GTG TTC AGC TCG CGT CC’3，下游引物為：5’CTC GGT GTA GCC TTC TTG CC’3；內(nèi)參選擇β-actin，其上游引物為：5’CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT’3，下游引物為：5’GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC’3。反應(yīng)體系和方案參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。使用2-△△CT法分析兩種細(xì)胞的SIRT1和NOXA mRNA相對(duì)表達(dá)差異[6]。

1.5 Western blot檢測(cè)SIRT1和NOXA的蛋白表達(dá) 常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞，RIPA裂解液提取總蛋白樣品，8%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳并電轉(zhuǎn)于PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別使用1:1,500的小鼠抗人SIRT1多克隆抗體、1:500小鼠抗人Noxa多克隆抗體以及1:5,000鼠抗人β-actin多克隆抗體，4 ℃孵育12 h。接著使用PBST洗滌3次，除去未結(jié)合的一抗。使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（1:1,000）室溫下孵育1 h-2 h，ECL發(fā)光試劑盒顯色并分析條帶[7]。

1.6 SiRNA轉(zhuǎn)染降低SIRT1表達(dá) 針對(duì)SIRT1的特異性siRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，正向序列為GCA AUA GGC CUC UUA AUU Att，反向序列為UAA UUA AGG CCU AUU GCtt。A549/DDP細(xì)胞以1×105/孔的密度種植于24孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine?2000試劑盒，同時(shí)設(shè)無(wú)關(guān)序列siRNA陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照（siRNA negative control,siRNA NC）。轉(zhuǎn)染48 h后實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)染效果的驗(yàn)證。

1.7 降低SIRT1對(duì)A549/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響 選擇成功轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA、無(wú)關(guān)序列siRNA及未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞以1×105/孔的密度種植于6孔板。細(xì)胞分為3組：以未經(jīng)轉(zhuǎn)染處理細(xì)胞為對(duì)照組（control）、轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA組（SIRT siRNA）以及轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列siRNA的陰性轉(zhuǎn)染組（siRNA NC）。各組設(shè)兩個(gè)亞組：4 μg/mL順鉑處理亞組（處理24 h）及未經(jīng)順鉑處理亞組，每個(gè)亞組設(shè)5個(gè)平行孔。使用1.3提及的Cell Titer Blue試驗(yàn)分析各組細(xì)胞的存活率。

1.8 細(xì)胞凋亡分析 細(xì)胞分組及處理同1.7所述。收集處理后的細(xì)胞，70%預(yù)冷酒精固定細(xì)胞過(guò)夜，加入Annexin V-FITC和碘化丙啶避光孵育30 min，使用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞凋亡情況。

1.9 細(xì)胞周期分析 細(xì)胞分組及處理同1.7所述。收集處理后的細(xì)胞，70%預(yù)冷酒精固定細(xì)胞過(guò)夜，加入BrdU和7-amino-actinomycin D（7-ADD）染液孵育20 min。使用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期情況

1.10 降低SIRT1表達(dá)對(duì)Noxa表達(dá)的影響 細(xì)胞分組及處理同1.7所述。使用1.4及1.5中提到的方法分析各組細(xì)胞Noxa的mRNA和蛋白表達(dá)水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性差異 Cell Titer Blue分析可見(jiàn)549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑具有一定的耐藥性（圖1）。順鉑處理A549細(xì)胞株的IC50為4.32 μg/mL，而處理A549/DDP的IC50為14.26 μg/mL。

2.2 A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞的SIRT1和Noxa表達(dá)存在差異 qRT-PCR分析顯示，與A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞的SIRT1 mRNA水平較高，相對(duì)A549細(xì)胞的表達(dá)倍數(shù)為（2.51±0.42）（P＜0.05），但Noxa mRNA水平較低，相對(duì)A549細(xì)胞的表達(dá)倍數(shù)為（0.49±0.09）（P＜0.05）。Western blot結(jié)果qRT-PCR結(jié)果類(lèi)似，提示A549/DDP細(xì)胞的SIRT1蛋白表達(dá)較高，但Noxa蛋白表達(dá)較低（圖2）。

2.3 降低SIRT1表達(dá)可以增強(qiáng)順鉑造成的細(xì)胞增殖抑制 如圖3所示，SIRT1轉(zhuǎn)染可有效降低A549/DDP細(xì)胞的SIRT1 mRNA表達(dá)。針對(duì)SIRT1的siRNA轉(zhuǎn)染可增加A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，4 μg/mL順鉑處理后，未經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的A549/DDP細(xì)胞的存活率為（84.2±9.8）%，而SIRT1 siRNA處理后的A549/DDP存活率較低，為（61.1±5.7）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)siRNA序列不會(huì)影響A549/DDP細(xì)胞接受順鉑處理后的存活率（P＞0.05）（圖4A）。

2.4 降低SIRT1表達(dá)可以增加順鉑造成的細(xì)胞凋亡 如圖4B所示，流式細(xì)胞儀分析可見(jiàn)，4 μg/mL順鉑處理后，未經(jīng)SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染處理的A549/DDP細(xì)胞凋亡率為（23.5±1.9）%，而SIRT1 siRNA處理后的A549/DDP細(xì)胞凋亡率增加，為（35.6±2.8）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)siRNA序列不會(huì)影響A549/DDP細(xì)胞接受順鉑處理后的凋亡率（P＞0.05）。

2.5 降低SIRT1表達(dá)可以增加順鉑造成的G2期/M期阻滯 如圖4C所示，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，未經(jīng)任何處理的A549/DDP細(xì)胞G0期/G1期和G2期/M期的百分比分別為（75.4±4.1）% 和（8.1±0.5）%。4 μg/mL順鉑處理后，未經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的A549/DDP細(xì)胞細(xì)胞G0期/G1期比例降至（60.4±6.3）%，G2期/M期比例升至（34.2±2.2）%，提示細(xì)胞發(fā)生了G2期/M期阻滯。SIRT1 siRNA處理后的A549/DDP細(xì)胞G2期/M期阻滯更為明顯，其G0期/G期比例為（40.3±5.4%）%，G2期/M期比例為（50.2±6.4）%，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)siRNA序列不會(huì)影響A549/DDP細(xì)胞接受順鉑處理后的周期分布（P＞0.05）。

圖1 不同濃度順鉑處理后A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞的存活率Fig 1 The cells viability of A549 and A549/DDP cells after treated with different concentration of cisplatin

圖3 SIRT siRNA轉(zhuǎn)染后，A549/DDP細(xì)胞的SIRT1 mRNA 表達(dá)變化。*：與對(duì)照相比，P＜0.05。Fig 3 The SIRT1 expression change caused by SIRT1 siRNA transfection.*: indicate P＜0.05 compared with the control group.

2.6 降低SIRT1表達(dá)可以增加Noxa表達(dá) 如圖5-圖6所示，SIRT1沉默后，A549/DDP細(xì)胞的Noxa表達(dá)顯著提高，相對(duì)與未轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞表達(dá)倍數(shù)為（1.65±0.12）（P＜0.05）。4 μg/mL順鉑處理可以輕微的增加A549/DDP細(xì)胞的Noxa表達(dá)，且SIRT1沉默后，順鉑引起的A549/DDP細(xì)胞的Noxa表達(dá)提高更為明顯。該結(jié)果提示抑制SIRT1可以改善A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，其機(jī)制可能為SIRT1抑制可以增加Noxa的表達(dá)。

3 討論

NSCLC是最常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，約占全部病例的80%。目前針對(duì)NSCLC的治療主要包括手術(shù)、放療及化療，其中最為有效的治療為外科手術(shù)[8]。然而由于診療水平的限制，特別是在發(fā)展中國(guó)家，不少患者在確診時(shí)已經(jīng)處于晚期，喪失了手術(shù)時(shí)機(jī)。這種情況下，非手術(shù)治療顯得尤為重要[9]。順鉑是廣泛應(yīng)用于NSCLC化療方案中的藥物，然而體內(nèi)及體外研究均報(bào)道了NSCLC對(duì)順鉑敏感性降低的現(xiàn)象。不得不承認(rèn)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性較低或產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制是復(fù)雜的。任何一個(gè)涉及細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、周期調(diào)控、凋亡、DNA損傷修復(fù)以及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)的異常均可能引起細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的降低[10-12]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)SIRT1在順鉑耐藥的A549/DDP細(xì)胞中存在高表達(dá)。使用siRNA降低A549/DDP細(xì)胞的SIRT1表達(dá)后，其對(duì)順鉑的敏感性提高。這些結(jié)果提示SIRT1可以影響A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。實(shí)際上，既往的一些研究已經(jīng)報(bào)道了SIRT1可以影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。如Chen等[13]的研究發(fā)現(xiàn)SIRT1的過(guò)表達(dá)可以增加腫瘤的生長(zhǎng)，降低腫瘤對(duì)索拉非尼的敏感性。Kojima等[14]發(fā)現(xiàn)在激素抵抗型前列腺癌PC3和DU145細(xì)胞株中，上調(diào)SIRT1表達(dá)可以導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥。本研究和這些既往研究的結(jié)果一致。

圖4 SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)A549/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響。A：4 μg/mL順鉑處理后各組細(xì)胞存活率；B：4 μg/mL順鉑處理后各組細(xì)胞凋亡率；C：4 μg/mL順鉑處理后各組細(xì)胞周期分布；*：與SIRT1 siRNA處理后的細(xì)胞相比比，P＜0.05；#：與未經(jīng)順鉑處理的細(xì)胞相比，P＜0.05。Fig 4 The effect of SIRT1 siRNA transfection on sensitivity of A549/DDP cells to cisplatin treatment. A: cell viability in each group after 4 μg/mL cisplantin treatment; B: cell apoptosis rate in each group after 4 μg/mL cisplantin treatment; C: cell cycle in each group after 4 μg/mL cisplantin treatment; *: indicates P＜0.05 compared with SIRT1 siRNA treated cells; #: indicates P＜0.05 compared with cells without cisplatin treatment.

圖5 SIRT siRNA轉(zhuǎn)染后，A549/DDP細(xì)胞的Noxa mRNA 表達(dá)變化。*：與SIRT1 siRNA處理后的細(xì)胞相比，P＜0.05；#：與未經(jīng)順鉑處理的細(xì)胞相比，P＜0.05。Fig 5 The Noxa mRNA expression change caused by SIRT1 siRNA transfection. *: indicates P＜0.05 compared with control; #: indicates P＜0.05 compared with cells without cisplatin treatment.

圖6 SIRT siRNA轉(zhuǎn)染后，A549/DDP細(xì)胞的Noxa 蛋白表達(dá)變化。A：各組Noxa蛋白條帶；B：各組Noxa蛋白條帶的灰度值；*：與SIRT1 siRNA處理后的細(xì)胞相比，P＜0.05；#：與未經(jīng)順鉑處理的細(xì)胞相比，P＜0.05。Fig 6 The Noxa protein expression change caused by SIRT1 siRNA transfection. A: Noxa protein bands images in each group; B: intensity of Noxa protein bands in each group; *: indicates P＜0.05 compared with control; #: indicates P＜0.05 compared with cells without cisplatin treatment.

至于SIRT1影響細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的機(jī)制也有研究做出了報(bào)道。已有研究[15]發(fā)現(xiàn)使用RNA干擾技術(shù)降低SIRT1的表達(dá)后，P-糖蛋白和多藥耐藥蛋白表達(dá)降低，這兩種蛋白均是公認(rèn)的引起細(xì)胞化療耐藥的蛋白。還有研究[16]發(fā)現(xiàn)，向人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染攜帶SIRT1序列的質(zhì)粒后，細(xì)胞內(nèi)與耐藥相關(guān)的MDR1基因表達(dá)增高。這些研究提示SIRT1可能通過(guò)調(diào)節(jié)與耐藥有關(guān)的一些基因或蛋白來(lái)影響腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC中SIRT1可能通過(guò)調(diào)節(jié)Noxa來(lái)影響細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。Noxa具有明確的促凋亡作用，正如Baou等[17]的報(bào)道，硼替佐米可以提高Noxa的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的凋亡。Noxa促進(jìn)凋亡的機(jī)制之一與線(xiàn)粒體-細(xì)胞色素C途徑有關(guān)，具體來(lái)說(shuō)Noxa可以增加線(xiàn)粒體膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放[18]。Noxa同時(shí)也是P53的下游基因，當(dāng)細(xì)胞受到損傷刺激后，P53結(jié)合Noxa的上游啟動(dòng)序列后，可以增加Noxa的表達(dá)[19]。一定程度上講，Noxa的促凋亡作用是依賴(lài)P53的，而P53是受SIRT1調(diào)控的，因此我們推測(cè)SIRT1可能以P53為橋梁，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)Noxa表達(dá)的調(diào)控。當(dāng)然，在一些情況系下，如低氧時(shí)，Noxa可不通過(guò)P53而得到激活，另外轉(zhuǎn)錄因子E2F1也可以直接激活Noxa，至于SIRT1是如何調(diào)控Noxa表達(dá)的還待于在未來(lái)研究中加以證實(shí)。