Hsp90AB1在非小細胞肺癌中高表達并且與肺腺癌患者不良預后相關

王明慧 馮林 李萍 韓廼珺 高燕寧 肖汀

熱休克蛋白90（heat shock protein, Hsp90）是ATP依賴的高度保守的分子伴侶，其可利用ATP水解產(chǎn)生的能量參與蛋白質的正確折疊，穩(wěn)定蛋白質結構，參與細胞信號轉導激素應答及轉錄調控等反應以及腫瘤凋亡、增殖相關通路的調節(jié)[1,2]。Hsp90對因環(huán)境改變等各種應激狀態(tài)下蛋白質穩(wěn)定性的保持至關重要[1]。除了在正常細胞中發(fā)揮重要作用外，Hsp90與底物蛋白相結合參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如惡性腫瘤、自身免疫性疾病。他還是多種致癌蛋白的分子伴侶，包括表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、人類表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2, HER2）、間質表皮轉化因子（mesenchymal-epithelial transition, MET）、蛋白激酶B（protein kinase B, AKT）等[3]。目前認為，人類Hsp90主要包括4種亞型：Hsp90AA1和Hsp90AB1均位于胞質內，Grp94位于內質網(wǎng)中，而TRAP1亞型則定位于線粒體基質內。Hsp90AA1和Hsp90AB1有85%同源，但是兩者作用不同，Hsp90AA1是誘導性表達，參與應激狀態(tài)下細胞保護和細胞周期的調節(jié)，而Hsp90AB1是組成性表達，參與早期胚胎發(fā)育、信號轉導及細胞長期適應性[4]。

目前在世界范圍內，肺癌發(fā)生率和死亡率均居惡性腫瘤首位，其中約85%為非小細胞肺癌[5]。作為分子伴侶，Hsp90有助于多種促肺癌蛋白質的折疊和成熟，例如EGFR和ALK。阻斷這些伴侶蛋白發(fā)揮功能是癌癥治療中的一種全新策略。Ramalingam等[6]對Hsp90新型抑制劑ganetespib的一項臨床II期研究發(fā)現(xiàn)，在治療晚期肺腺癌患者過程中，ganetespib與多西他賽（docetaxel）聯(lián)合用藥治療與多西他賽單藥治療相比，可延長晚期肺腺癌患者的總生存期。本研究采用免疫組織化學染色方法檢測Hsp90AB1在213例非小細胞肺癌組織中的蛋白表達水平，分析其與非小細胞肺癌臨床病理參數(shù)及患者預后的關系，為Hsp90抑制劑在肺腺癌患者的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標本 肺癌組織微陣列：上海芯超生物科技有限公司，（HLug-Scc150Squ-01, HLug-Ade150Sur-01），手術時間2004年7月-2007年11月，隨訪時間截止至2012年7月；上海卓立生物科技有限公司（LUC1505），手術時間2005年7月-2011年12月，隨訪時間截止至2013年6月。三張組織芯片共包含213例肺癌組織和相應的癌旁肺組織（距離腫瘤組織3 cm以外的正常肺組織），其中肺鱗癌66例，肺腺癌147例。

1.2 免疫組化試劑 一抗為Hsp90AB1兔多克隆抗體（貨號：AP7867d，Abgent，美國），工作濃度是1:100；二抗為山羊抗兔IgG/HRP（中杉金橋，中國）；30%H2O2溶液（西隴化工，中國）；10×抗原修復液（檸檬酸鹽緩沖液，0.01 M，pH6.0）（中杉金橋，中國）；正常山羊血清（中杉金橋，中國）；20×DAB顯色試劑盒（中杉金橋，中國）；蘇木素染料（中杉金橋，中國）。

1.3 免疫組化實驗步驟（SP法） 組織芯片置于65 ℃烤箱中，烘烤3 h；經(jīng)脫蠟、水化后放置于3%的H2O2溶液中室溫避光孵育10 min，以除去細胞內源性過氧化物酶的活性；抗原修復液進行抗原修復；正常山羊血清封閉液室溫封閉10 min；棄封閉液，用一抗工作液（Hsp90AB1兔多克隆抗體，1:100）4 ℃孵育過夜；滴加生物素化的二抗工作液（山羊抗兔IgG），室溫孵育30 min；DAB顯色，顯微鏡下控制染色強度；蘇木素染色；樹脂封片，顯微鏡下觀察[7,8]。

1.4 結果判定 免疫組化染色結果由兩位獨立臨床病理醫(yī)師閱片判斷。根據(jù)細胞染色強度評分和陽性細胞比例評分的乘積進行半定量分析。按細胞染色強度評分：0分（無棕黃色顆粒），1分（淡黃色顆粒），2分（棕黃色顆粒），3分（褐色顆粒）；按陽性細胞比例評分：0分（陽性細胞比例≤5%），1分（5%＜陽性細胞比例≤25%），2分（25%＜陽性細胞比例≤50%），3分（50%＜陽性細胞比例≤75%），4分（75%＜陽性細胞比例≤100%）。結果取兩者之積，分為4級：0記為（-），1-4記為（+），5-8記為（++），9-12記為（+++）。將（-）和（+）定為蛋白表達陰性，將（++）和（+++）定為蛋白表達陽性。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0（SPSS INC，美國）和SigmaPlot 12.3（Systat Software，San Jose，美國）軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。生存期計算從手術日期開始到隨訪日期終止，或由于復發(fā)、轉移而死亡的日期或失訪日期終止。采用卡方檢驗分析肺癌中Hsp90AB1的表達與各臨床參數(shù)之間的關系，采用Kaplan-Meier計算肺腺癌患者的生存曲線，并進行對數(shù)秩檢驗，用Cox多因素回歸分析各種因素對肺腺癌患者總生存期的影響。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Hsp90AB1在非小細胞肺癌組織中高表達 免疫組化結果顯示Hsp90AB1陽性表達部位主要是肺癌細胞的胞漿，呈棕黃色顆粒狀彌漫分布在肺癌細胞胞漿中（圖1，圖2B、圖2C）。免疫組化檢測213例非小細胞肺癌，其中115例肺癌組織中Hsp90AB1呈陽性表達，陽性率為54.0%。Hsp90AB1在正常癌旁肺組織中幾乎不表達（圖2A）。

2.2 Hsp90AB1表達與肺癌病理類型相關 213例肺癌組織中，有147例肺腺癌，66肺鱗癌，其中Hsp90AB1在肺鱗癌中的陽性表達率為37.9%，在肺腺癌中的陽性表達率為61.2%（表1，圖2B、圖2C），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002）。Hsp90AB1在非小細胞肺癌組織中的表達與腫瘤的臨床分期、淋巴結轉移、病理分級等因素無相關性（P＞0.05）。Hsp90AB1的表達水平與各臨床參數(shù)之間的關系總結見表1。

圖1 運用Hsp90AB1兔多克隆抗體在組織芯片中用免疫組織化學染色方法檢測Hsp90AB1在肺腺癌組織中的表達（×400）。A-D分別表示Hsp90AB1在肺腺癌組織中的染色強度為（+++）、（++）、（+）、（-）。Fig 1 Hsp90AB1 protein expression in lung adenocarcinoma tissues, as observed by immunohistochemical staining with a rabbit polyclonal antibody against Hsp90AB1, applied to formalin-fixed and paraffin-embedded tissues in the manner of tissue microarrays (Original magnification:×400). A-D: The expression intensities of Hsp90AB1 immunostaining in lung adenocarcinoma tissues were (+++), (++), (+), (-), respectively.Hsp90AB1: heat shock protein 90 kDa alpha, class B member 1.

圖2 運用Hsp90AB1兔多克隆抗體在組織芯片中用免疫組織化學染色方法檢測Hsp90AB1在正常肺組織和肺癌組織中的表達。A：Hsp90AB1在癌旁正常肺組織中不表達（×100）；B：Hsp90AB1在肺鱗癌組織中低表達（×200）；C：Hsp90AB1在肺腺癌組織中高表達（×400）。Fig 2 Hsp90AB1 protein expression in normal lung tissues and lung cancer tissues, as obser ve d by immunohistochemical staining with a rabbit polyclonal antibody against Hsp90AB1, applied to formalin-fixed and paraffin-embedded tissues in manner of tissue microarrays. A: Hsp90AB1 was not expressed in normal lung tissues (×100);B: Low expression of Hsp90AB1 in lung squamous cell carcinoma tissues (×200);C: High expression of Hsp90AB1 in lung adenocarcinoma tissues (×400).

2.3 Hsp90AB1表達與肺腺癌預后相關 本研究中上海芯超和上海卓立科技有限公司的兩張組織芯片共包含147例肺腺癌組織，兩個公司的組織芯片構成病例在男女性別，臨床分期、分化程度等臨床參數(shù)的組成比例無明顯差別。隨訪時間0.06年至8.0年，中位隨訪時間3.4年。Hsp90AB1陽性表達的肺腺癌患者總生存率低于Hsp90AB1陰性表達的患者（P=0.032，圖3）。Cox多因素回歸分析結果顯示，Hsp90AB1可以作為預后的獨立因素（表2，P=0.002）。

3 討論

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過200種蛋白與Hsp90相互作用成為其底物蛋白，大多數(shù)的這些底物蛋白參與必要的細胞增殖，細胞周期進程和細胞凋亡調控，包括類固醇激素受體、激酶、轉錄因子、HER2、Akt、突變型P53等[9,10]。Hsp90在調節(jié)底物蛋白構象的正確折疊、穩(wěn)定性及功能方面具有核心作用[11]。Hsp90底物蛋白有多種是致癌蛋白，其對致癌蛋白的穩(wěn)定性和功能的發(fā)揮具有關鍵作用。腫瘤的一些特征性變化都與這些致癌蛋白相關，如持續(xù)的抗凋亡、血管生成及組織浸潤和轉移[12]。

目前在世界范圍內肺癌是死亡率最高的惡性腫瘤，占癌癥死亡總數(shù)的三分之一，非小細胞肺癌占85%的肺癌病例，其中肺腺癌是非小細胞肺癌的主要組織學類型[13]。目前關于Hsp90在肺癌組織中蛋白表達情況的研究較少。我們研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90AB1在肺腺癌組織中的陽性表達率為61.2%，高于在肺鱗癌中的表達。Hsp90AB1在肺腺癌組織中表達高的原因之一是EGFR在肺腺癌中的突變率高，而EGFR是Hsp90AB1的一種底物蛋白，據(jù)相關研究[14]顯示EGFR在白種人群肺腺癌中的突變率約為15%-20%，在亞洲人群肺腺癌中的突變率高達50%。此外我們的研究結果還顯示Hsp90AB1的高表達與肺腺癌的不良預后相關，Cox多因素回歸分析表明Hsp90AB1可作為影響肺腺癌預后的獨立危險因素。此結果與文獻報道的Hsp90在其他腫瘤的表達情況一致，Wang等[15]通過免疫組化法在322例胃癌樣本中研究結果顯示Hsp90與胃癌的侵襲、轉移及預后相關。Shirota等[16]研究發(fā)現(xiàn)Hsp90在膽管癌中的表達與膽管癌的5年生存率明顯相關。此外，也有研究[17,18]發(fā)現(xiàn)Hsp90與乳腺癌的預后相關。這些研究結果提示高表達Hsp90可以作為判斷某些癌癥患者預后的標志物，為腫瘤患者手術后的治療提供參考。

表1 肺癌中Hsp90AB1的表達與臨床病理參數(shù)之間的關系Tab 1 Correlation between clinicopathological features and Hsp90AB1 expression in lung cancer

表2 肺腺癌患者總生存期的Cox多因素回歸分析Tab 2 Multivariate Cox regression analysis for overall survival in lung adenocarcinoma patients

圖3 Kaplan-Meier生存分析顯示Hsp90AB1陽性組（n=90）肺腺癌患者比陰性組（n=57）預后差，橫坐標表示患者的生存時間，縱坐標表示累計生存率。Fig 3 The Kaplan-Meier survival analysis revealed that the lung adenocarcinoma patients with Hsp90AB1 positive expression (n=90)had a significantly poorer outcome than those with Hsp90AB1 negative expression (n=57)(P=0.032). The abscissa represents the patient's survival time and the vertical axis indicates survival probability.

Hsp90能夠幫助癌細胞克服各種不良應激刺激，如缺氧、蛋白質毒性壓力以及營養(yǎng)物質缺乏等，并且他還能保護癌細胞逃避免疫系統(tǒng)的攻擊[19,20]。正是因為Hsp90的這一特點使得其成為癌癥治療的一個極具價值的靶點。目前針對Hsp90抑制劑的研究較多，Ueno等[21]在研究AUY922對幾種已發(fā)生遺傳改變，包括EGFR突變的非小細胞肺癌細胞系的抗腫瘤實驗結果表明，AUY922不僅在EGFR突變的腫瘤，而且在非EGFR突變但含有K-ras突變或EML-ALK基因融合等分子改變的腫瘤細胞中抗腫瘤作用明顯增強。并且其在膽管癌細胞中也發(fā)揮著抗生長和抗血管生成的作用[15]。所以，AUY922有望成為新型抗腫瘤藥物。Gomez-Casal等[22]研究Hsp90另一種抑制劑Ganetespib發(fā)現(xiàn)其可以抑制肺腺癌細胞增殖、遷移，誘導肺腺癌細胞凋亡，并且可以增加肺腺癌細胞體外放射敏感性。本研究的結果表明Hsp90AB1在肺腺癌組織中表達陽性率為61.2%，且這部分Hsp90AB1高表達的患者預后較差。如果針對Hsp90陽性表達的患者使用Hsp90抑制劑將更有針對性，提高用藥的有效率。

綜上所述，肺癌組織中Hsp90AB1高表達，尤其在肺腺癌組織中陽性表達是患者預后的獨立因素，為臨床上使用Hsp90抑制劑作為肺腺癌靶向藥物提供理論基礎，更能針對性用藥。