MAGE-C2在肺腺癌中的表達(dá)及臨床意義

郭康 劉夢實(shí) 徐萍 李紅梅

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的腫瘤之一，而且其發(fā)病死亡率居首位[1]，是威脅人類生命健康的主要惡性腫瘤。其中肺腺癌的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)躍居肺癌發(fā)病率首位[2]。研究[2]證實(shí)，早期診斷和治療是提高肺癌患者生存率的關(guān)鍵。腫瘤標(biāo)志物因其檢測方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)可廣泛用于肺癌的篩查，對肺癌早期診斷、組織學(xué)分型、預(yù)后判斷及療效評價等方面有重要價值[3]。腫瘤睪丸抗原（cancer-testis antigen, CTA）是一類新的腫瘤標(biāo)志物，在多種腫瘤中存在表達(dá)，而在正常組織中僅表達(dá)于睪丸和胎盤組織[4]。黑色素抗原C2（melanoma antigen-C2,MAGE-C2）是CTA的一種，最初發(fā)現(xiàn)于黑色素瘤細(xì)胞，后被證實(shí)在多種腫瘤中存在表達(dá)[5,6]，而其在肺腺癌中的研究卻很少。本實(shí)驗(yàn)通過熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR, RTFQ-PCR）及Western blot方法檢測MAGE-C2 mRNA及蛋白在肺腺癌中的表達(dá)情況，并分析其與肺腺癌臨床病理特征及總生存率之間的關(guān)系，以期望發(fā)現(xiàn)一種新的肺腺癌標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取青島大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科2010年3月-2011年3月肺腺癌患者87例，分別取肺腺癌組織及癌旁組織10 g剪碎后儲存于-80 ℃?zhèn)溆?。癌旁組織取自癌組織旁5 cm以外的組織。所有患者均為接受過放化療，并均已經(jīng)病理診斷證實(shí)，且無其他惡性疾病及自身免疫性疾病。臨床分期采用國際腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-nodemetastasis, TNM）分期方法。

1.2 總RNA提取和cDNA合成 取冰凍肺腺癌組織及癌旁組織各50 mg-100 mg，利用RNAsimple Total RNA Kit提取總RNA，利用超微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA純度。再利用FastQuant RT Kit（with gDNase）進(jìn)行cDNA合成。所有試劑盒均為天根科技有限公司提供，具體操作均按說明書進(jìn)行。

1.3 熒光定量PCR檢測 使用上述合成的cDNA為模板，利用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測。所使用MAGE-C2上游引物為：5’-AAAGTCA GCACAGCAGAGGAG-3’，下游引物為：5’-TCTTCAGGA GCAGCAGGTAAA-3’。先95 ℃預(yù)變性15 min，再與熒光定量PCR儀（Bio-Rad儀器）內(nèi)擴(kuò)增40個循環(huán)（95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s），然后進(jìn)行融解曲線分析。所有試劑盒均為天根科技有限公司提供，具體操作按說明書進(jìn)行[7]。

1.4 Western blot檢測 將凍存的組織標(biāo)本取出稱重，每100 mg加入500 μL蛋白裂解液，置于勻漿器中研磨，冰上裂解30 min，離心（12,000 r/min）收集上清液，使用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%BSA封閉1 h后，分別加入MAGE-C2兔抗人單克隆抗體（1:1,000）及GAPDH小鼠抗人單克隆抗體（1:1,000），4 ℃孵育過夜漂洗，加二抗（1:2,000）室溫孵育1 h后加發(fā)光試劑，暗室曝光顯示條帶[8]。

圖1 Western blot檢測MACE-C2蛋白在肺腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況Fig 1 Expression of MAGE-C2 protein was detected in lung adenocarcinoma and adjacent non-cancerous tissue by Western bolt.MAGE-C2: melanoma antigen-C2.

1.5 隨訪 對87例患者進(jìn)行長期隨訪，隨訪時間從診斷日期開始至最終觀察日期或死亡日期。記錄患者的總生存時間。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料以Mean±SD表示，采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法及Cox風(fēng)險比例回歸模型，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MAGE-C2 mRNA在肺腺癌及癌旁組織中的表達(dá) 超微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA純度，選取A260/A280的比值在1.8到2.1之間的樣本用于合成cDNA。熒光定量PCR結(jié)果顯示MAGE-C2 mRNA在肺腺癌組織存在表達(dá)（53/87,60.9%），而在癌旁組織中無表達(dá)。

2.2 MAGE-C2蛋白在肺腺癌及癌旁組織中的表達(dá) Western blot結(jié)果與熒光定量PCR檢測結(jié)果一致，在肺腺癌組織中檢測到MAGE-C2蛋白的表達(dá)（53/87, 60.9%）（圖1），而在癌旁組織中無表達(dá)。

2.3 MAGE-C2 mRNA及蛋白表達(dá)與肺腺癌臨床病例特征之間的關(guān)系 將MAGE-C2 mRNA及蛋白表達(dá)情況與肺腺癌患者的臨床病理資料結(jié)合進(jìn)行分析。我們發(fā)現(xiàn)，MAGE-C2 mRNA及蛋白表達(dá)陽性組與表達(dá)陰性組之間在臨床分期、是否轉(zhuǎn)移、分化程度方面存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）（表1）；在MAGE-C2 mRNA表達(dá)陽性組中，晚期、低分化、轉(zhuǎn)移組的表達(dá)量明顯高于早期、高/中分化、無轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）（圖2）；但與患者的年齡、性別、吸煙史之間無明顯相關(guān)性（P＞0.05）（表1）。

2.4 MAGE-C2 mRNA與患者預(yù)后之間的關(guān)系 通過對87例隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier法生存分析，我們發(fā)現(xiàn)MAGE-C2 mRNA及蛋白表達(dá)陽性組與表達(dá)陰性組之間在總生存期上存在明顯差異（Log-rank=7.541,P＜0.05）（圖3）。利用Cox風(fēng)險比例回歸模型對87例患者的7個因素進(jìn)行分析，這7個因素分別為：年齡、性別、吸煙史、分化程度、臨床分期、是否轉(zhuǎn)移、MAGE-C2表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臨床分期、是否轉(zhuǎn)移、MAGE-C2表達(dá)分別為肺腺癌預(yù)后不良的獨(dú)立因素。MAGE-C2 mRNA及蛋白高表達(dá)對患者總生存期產(chǎn)生不利影響（RR=2.813, 95%CI 1.714-4.616,P=0.017）（表2），并可能與臨床分期、是否轉(zhuǎn)移間存在協(xié)同作用。

表1 MAGE-C2 mRNA及蛋白表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系Tab 1 Relationship between expression level of MAGE-C2 mRNA and protein and clinical characteristics of patients

3 討論

CTA抗原基因編碼的腫瘤抗原能在多種腫瘤組織中表達(dá)，但在正常組織中僅限于睪丸和胎盤組織，但是睪丸不表達(dá)人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen,HLA），因此不會在體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)抗體[9,10]。Jassim等[11]的研究發(fā)現(xiàn)CTA的異位表達(dá)能引發(fā)人體的免疫反應(yīng)，在血液中產(chǎn)生相應(yīng)抗體，這為CTA在早期腫瘤診斷方面的應(yīng)用提供了依據(jù)[12]。另外，由于CTA這種免疫原性及表達(dá)限制性，CTA在腫瘤的診斷及免疫治療方面存在巨大的潛在價值。

MAGE-C2是CTA家族中的一員，可在腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)被降解成九肽或十肽，然后作為抗原表位，與細(xì)胞內(nèi)的HLA分子結(jié)合后呈遞到細(xì)胞膜[13]，從而誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)抗體。在本研究中，我們檢測了87例肺腺癌患者癌組織及癌旁組織中MAGE-C2 mRNA及蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MAGE-C2 mRNA及蛋白表達(dá)于多數(shù)肺腺癌組織中（53/87, 60.9%），而在癌旁組織中未檢測到MAGE-C2 mRNA及蛋白的表達(dá)。因此，MAGE-C2有潛力作為一種新型的肺腺癌標(biāo)志物，其在血清中產(chǎn)生的特異性抗體可廣泛用于肺癌的篩查。另外，通過分析MAGE-C2 mRNA及蛋白的表達(dá)情況與肺腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)，MAGE-C2 mRNA及蛋白的表達(dá)陽性組與表達(dá)陰性組在肺腺癌的臨床分期、是否轉(zhuǎn)移及分化程度方面存在明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），并且在晚期、低分化、轉(zhuǎn)移組的表達(dá)量明顯高于早期、高/中分化、無轉(zhuǎn)移組。這一結(jié)果提示，MAGE-C2的高表達(dá)可能對腫瘤細(xì)胞的分化、轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利用Cox風(fēng)險比例回歸模型及Kaplan-Meier法對隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析后，我們發(fā)現(xiàn)，MAGE-C2的高表達(dá)同臨床分期、是否轉(zhuǎn)移一樣，為肺腺癌不良預(yù)后的獨(dú)立因素。MAGE-C2表達(dá)越高，預(yù)后相對越差。因此，我們認(rèn)為，MAGE-C2不僅可以用于肺腺癌的診斷，而且可

以作為肺腺癌不良預(yù)后的指標(biāo)。另外，由于其特殊的免疫原性及表達(dá)限制性，MAGE-C2可能作為肺腺癌免疫治療的靶點(diǎn)。體外培養(yǎng)能結(jié)合MAGE-C2的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，進(jìn)而特異性殺傷體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，而不對正常組織造成損害，減少了腫瘤治療的副反應(yīng)[14]。同時，阻斷MAGE-C2相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[15]，可能達(dá)到延緩腫瘤轉(zhuǎn)移、改善患者的預(yù)后目的。相信此方面的研究將會對腫瘤的臨床治療產(chǎn)生重大影響。

表2 肺腺癌預(yù)后因素的Cox風(fēng)險回歸模型分析Tab 2 Cox multivariate analysis of prognostic factors of lung adenocarcinoma

圖3 MAGE-C2 mRNA及蛋白的表達(dá)情況與肺腺癌患者總生存率之間的關(guān)系（Kaplan-Meier法）Fig 3 Relationship between expression of MAGE-C2 mRNA and protein and overall survival rate of lung adenocarcinoma patients (Kaplan-Meier method)

圖2 熒光定量PCR檢測MAGE-C2 mRNA在肺腺癌中的表達(dá)情況。A：MAGE-C2 mRNA在高/中分化組和低分化組的表達(dá)情況（以高/中分化組為標(biāo)準(zhǔn)，低分組的熒光表達(dá)量）；B：MAGE-C2 mRNA在（I期+II期）組和（III期+IV期）組的表達(dá)情況（以I期+II期組為標(biāo)準(zhǔn)，III期+IV期組的熒光表達(dá)量）；C：MAGE-C2 mRNA在轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組的表達(dá)情況（以無轉(zhuǎn)移組為標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)移組的熒光表達(dá)量）。Fig 2 Expression of MAGE-C2 mRNA was detected in lung adenocarcinoma by realtime fluorescent quantitative PCR. A:MAGE-C2 mRNA expression in well/mod differentiation group and poor differentiation group (Compared to well/mod differentiation group, expression of MAGE-C2 mRNA in poor differentiation group); B: MAGE-C2 mRNA expression in stage I+II group and stage III+IV group (Compared to stage I+II group, expression of MAGE-C2 mRNA in stage III+IV group); C: MAGE-C2 mRNA expression in metastasis group and non-metastasis group (Compared to metastasis group, expression of MAGE-C2 mRNA in non-metastasis group).

總體來看，本研究成功證實(shí)了MAGE-C2在肺腺癌組織中存在高表達(dá)，并與肺腺癌的臨床分期、是否轉(zhuǎn)移及分化程度相關(guān)，對患者的總生存期有不良影響。這表明，MAGE-C2可作為一種肺腺癌診斷及預(yù)后標(biāo)志物，并可作為免疫治療靶點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中存在巨大潛力。