唾液乳桿菌的分離鑒定及生物特性研究

陳新亮，邵啟兵，王 超，何劍斌，張 燚，楊淑華，李 鵬，龍 淼*（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

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唾液乳桿菌的分離鑒定及生物特性研究

陳新亮，邵啟兵，王 超，何劍斌，張 燚，楊淑華，李 鵬，龍 淼*
（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

摘 要：從健康散養(yǎng)的溜達(dá)雞小腸黏膜中分離出一株乳桿菌，通過菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色、生理生化鑒定以及16S rRNA基因序列測定和同源性分析，確定所分離的菌株為唾液乳桿菌，并命名Lactobacillus salivarius C-1-3。對該菌進(jìn)行抑菌、纖維素降解、耐酸、耐膽鹽、耐高溫實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：其對常見的致病菌大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌都具有良好的抑制作用，且該菌株能夠降解纖維素。經(jīng)過多次馴化后，該菌株表現(xiàn)出較好的抑菌作用及耐酸、耐高溫特性。

關(guān)鍵詞：唾液乳桿菌；分離鑒定；生物學(xué)特性

引文格式：

陳新亮， 邵啟兵， 王超， 等.唾液乳桿菌的分離鑒定及生物特性研究［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（13）: 157-161.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613028. http://www.spkx.net.cn

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乳酸桿菌是人和動物體腸道內(nèi)正常菌群的一種，其抗病、防病及促生長的作用已有很多報(bào)道，并且有研究表明，理想的益生菌菌株來自本源動物。乳酸桿菌作為動物體內(nèi)一種重要的益生菌，能夠調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，對常見的腸道致病菌具有廣譜抗菌作用，并可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫力和抵抗力［1］、提高乳制品品質(zhì)，改善人類的乳糖不耐受癥狀［2］；同時(shí)還具有提高飼料利用率、促進(jìn)動物生長性能和肉品質(zhì)［3-4］等許多有益的生理功能。目前抗生素的濫用帶來了嚴(yán)重危害［5］，亟需發(fā)現(xiàn)新型物質(zhì)來代替抗生素，目前認(rèn)為乳酸桿菌是最佳的抗生素替代品。但不同來源的乳酸菌生物學(xué)特性不同，因此對乳酸桿菌菌種的分離純化、研究其生物學(xué)特性是將其進(jìn)行生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)。目前，國內(nèi)外對乳酸桿菌生物特性的研究多限于乳品、植物來源的乳桿菌，動物源性的乳酸桿菌雖然也有應(yīng)用，但對其生物特性的報(bào)道不夠系統(tǒng)全面，僅見武玉香等［6］對乳桿菌分離鑒定及生物特性的研究；徐恒毅［7］對具有益生菌特性的陰道乳酸桿菌進(jìn)行了篩選及生物學(xué)特性的研究；龍淼等［8］對犢牛瘤胃黏膜乳桿菌進(jìn)行了分離鑒定及生物學(xué)特性研究。唾液乳桿菌作為《可用于食品的菌種名單》［9］中可食用菌種之一，具有很多重要的生理功能，使得其有望成為優(yōu)良的食品添加劑及可替代抗生素添加劑的優(yōu)良益生菌之一。因此，本實(shí)驗(yàn)從雞小腸黏膜中分離鑒定出一株唾液乳桿菌，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為該菌應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物、菌株與試劑

本地健康散養(yǎng)溜達(dá)雞，購于沈陽周邊地區(qū)散養(yǎng)雞農(nóng)戶。

雞源大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，均由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院臨床實(shí)驗(yàn)室保存提供。根據(jù)文獻(xiàn)［10］方法選擇MRS培養(yǎng)基、SL乳桿菌選擇性培養(yǎng)基，根據(jù)文獻(xiàn)［11-12］方法選擇LB培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）固體培養(yǎng)基，根據(jù)文獻(xiàn)［13］方法選擇甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，進(jìn)行相應(yīng)的菌株培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)。

細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Power Pac Basic電泳儀、Gel Doc XR+凝膠成像儀、S1000TMThermal Cycler PCR擴(kuò)增儀 美國Bio-Rad公司；DHS離心機(jī) 北京鼎昊然生物科技有限公司；UVmini-1240紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離

剪斷溜達(dá)雞頸部血管，快速放血致死，無菌條件下迅速取出小腸，置于無菌平皿中，移至超凈工作臺中剖開，去掉小腸內(nèi)容物［14］，無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3 次，用滅菌載破片刮取小腸黏膜黏液，然后用滅菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，依次稀釋至10-2、10-3、10-4梯度，各稀釋度均取0.1 mL，在無菌條件下用接種環(huán)劃線種于SL選擇性培養(yǎng)基，置于37 ℃搖床中培養(yǎng)36 h后，接種到MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2 菌種鑒定

進(jìn)行多次劃線培養(yǎng)后，挑取形態(tài)特征與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》［15］對乳桿菌描述（圓形、表面光滑、乳白色等）相一致的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，選取疑似菌株進(jìn)行生理生化鑒定，包括生化反應(yīng)管實(shí)驗(yàn)以及菌株16S rRNA鑒定：利用DNA快速提取試劑盒提取細(xì)菌的基因組，然后采用16S rRNA通用引物27f：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492r： 5′-GGTTACCTTGTTACTT-3′，以提取的基因組作為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，擴(kuò)增成功后進(jìn)行測序，測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）進(jìn)行BLAST比對，在GenBank中得到幾個(gè)與分離菌株序列同源性較高的菌株，將這些菌株作為參考菌株進(jìn)行同源性分析。使用Clustal X1.81將這些參考菌株的序列對齊后，使用DNA Star建立菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株的同源性［16-17］。

1.3.3 菌株生長曲線的繪制

將菌種以1%的接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床中培養(yǎng)，分別在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、18、22 h時(shí)取樣，測定培養(yǎng)基的pH值；采用比濁法，利用分光光度計(jì)測定菌液在600 nm波長處的光密度（OD600 nm）值，然后以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以pH值和OD600 nm值為縱坐標(biāo)，繪制菌株生長曲線［18］。

1.3.4 菌株體外抑菌實(shí)驗(yàn)

參考劉冬梅等［19］的方法，以牛津杯法測定益生菌的抑菌活力。將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行離心，收集上清液備用；在超凈工作臺內(nèi)將事先準(zhǔn)備好的雞源大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌依次稀釋至10-2、10-3、10-4梯度，并分別各吸取100 μL涂布到LB培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基及甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基中，然后用鑷子將無菌牛津杯輕放于涂完指示菌株的平皿中，再吸取160～180 μL上清液滴到牛津杯內(nèi)，注意不要讓上清液溢出牛津杯，最后將平皿放置4 ℃冰箱中24 h，進(jìn)行擴(kuò)散處理。然后放到37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察抑菌現(xiàn)象。

1.3.5 纖維素降解實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)24 h的菌株梯度稀釋后接種CMC-Na固體培養(yǎng)基上，每個(gè)接種點(diǎn)涂布20 μL菌液，于37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)4 d，取出平板后用1 mg/mL的剛果紅染色液染色20 min，倒掉多余的剛果紅，分別測定菌落直徑（d）和降解圈直徑（D），以降解圈直徑和菌落直徑的比值（D/d）為指標(biāo)，判定菌株降解纖維素的能力［19-20］。

1.3.6 耐酸實(shí)驗(yàn)

將配制好的MRS培養(yǎng)基用0.1 mol/L鹽酸溶液及0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值分別為6.0（對照組）、5.0、4.0、3.0、2.0組［21］，將菌種以5%的接種量分別接種到滅菌后的培養(yǎng)基中，37 ℃搖床中培養(yǎng)24 h，測定菌液的OD600 nm值，計(jì)算成活率。

1.3.7 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

在MRS培養(yǎng)基中分別加入0.05%、0.10%、0.15%、0.20%的豬膽鹽，以不加豬膽鹽作為對照組，每組分別做一個(gè)平行對照。將菌種按5%的接種量接種到不同膽鹽含量的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h ，平板計(jì)數(shù)，計(jì)算成活率。

1.3.8 耐高溫實(shí)驗(yàn)

取培養(yǎng)24 h的菌株分別于40、45、50、55 ℃水浴中處理20 min，以不作高溫處理的菌株作為對照組。然后以10的倍數(shù)進(jìn)行依次遞減稀釋處理，最后取20 μL處理后的菌液進(jìn)行涂板，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，平板計(jì)數(shù)，計(jì)算成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

編號為C-1-3的菌株在MRS培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)后，生長良好，菌落大小為0.6～1.5 mm，呈乳白色、邊緣整齊、較光澤并凸起于培養(yǎng)基表面（圖1）。培養(yǎng)24 h的菌株革蘭氏染色結(jié)果如圖2所示，菌株呈藍(lán)色直桿狀，單個(gè)、成雙或聚集排列一起，兩端鈍圓，可以判斷所分離的菌株為革蘭氏陽性桿菌。

2.2 生化鑒定結(jié)果

對所分離的菌株進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果見表1，將鑒定結(jié)果與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》［15］對乳桿菌的生理生化鑒定描述相比較，可以初步鑒定所分離的菌株為乳桿菌屬。

注：+.陽性結(jié)果；－.陰性結(jié)果。

2.3 16S rRNA測定及同源性分析結(jié)果

PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3，可以看出PCR擴(kuò)增后的基因大小為1 500 bp左右，分離菌株的16S rRNA基因片段測序結(jié)果為1 468 bp，與電泳結(jié)果相一致，并初步確定C-1-3菌株為唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）?；驕y序結(jié)果已遞送至GenBank數(shù)據(jù)庫中并被收錄，登錄號為：KP979479，進(jìn)行BLAST基因序列比對，比對結(jié)果表明所分離的菌株與GenBank中收錄的Lactobacillus sp.KLDS 1.0719（登錄號EU600923.1）和Lactobacillus salivarius strain ZJ601（登錄號JN981843.1）等數(shù)個(gè)菌株同源性達(dá)到99%，將這幾個(gè)相似度較高的菌株作為參考菌株（表2），使用Clastal X1.81將C-1-3菌株堿基序列及參考菌株序列對齊后，利用MEGA軟件對分離菌株進(jìn)行同源分析，生成系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），進(jìn)一步確定所分離的菌株與參考菌株中的Lactobacillus salivarius strain ZJ601屬同一分支。

表 2 參考菌株信息Table 2 Reference strains菌株 登錄號Lactobacillus sp.KLDS 1.0719 EU600923.1 Lactobacillus salivarius strain ZJ601 JN981843.1 Lactobacillus salivarius strain Probio-37 GU357500.1 Lactobacillus salivarius subsp.salicinius strain JCM 1046 AY137587.1 Lactobacillus salivarius strain CH-9 FJ378897.1 Lactobacillus salivarius isolate 3-1-30 AB932525.1 Uncultured bacterium clone p-4323-4Wa3 AF371497.1 Lactobacillus salivarius subsp.salicinius strain JCM 1042 AY137584.1

2.4 菌株的生長曲線

由圖5可知，C-1-3菌株大約在2 h后進(jìn)入對數(shù)期，5 h后穩(wěn)定增長，在14 h后活菌數(shù)達(dá)到最大。在菌體進(jìn)入對數(shù)期時(shí)菌液的酸度迅速降低，穩(wěn)定期時(shí)pH值維持在3.0左右。

2.5 體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖6、7所示，C-1-3菌株對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌都具有良好的抑制效果，尤其是對大腸桿菌和沙門氏菌的抑制效果最佳，抑菌圈的直徑為20～22 mm，原因可能是乳桿菌在生長的過程中產(chǎn)生了乳酸、H2O2或細(xì)菌素，從而抑制了以上3 種細(xì)菌的生長［22］。

2.6 纖維素降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖8所示，所分離的乳桿菌對纖維素有一定降解能力，菌落直徑（d）約為1 mm，降解圈直徑（D）為3.5 mm，菌株降解纖維素指標(biāo)為D/d=3.5。

2.7 耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

乳酸菌要應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，必須具有耐受胃腸道的酸性環(huán)境的能力，菌株在不同pH值溶液中培養(yǎng)24 h后的成活率見表3。C-1-3菌株在pH 2.0的溶液中成活率為18.2%，在pH 4.0的溶液中成活率為126.4%，即pH 4.0為C-1-3菌株的最適pH值生長環(huán)境。

表 3 耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of acid tolerance test培養(yǎng)基pH 2.0 3.0 4.0 5.0成活率/% 18.2 98.5 126.4 109.5

2.8 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

動物體小腸內(nèi)的膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%～0.3%［14］，對膽鹽的耐受能力在此范圍內(nèi)的乳桿菌才有機(jī)會在腸道內(nèi)附殖生長。由表4可知，C-1-3菌株的耐膽鹽能力較差，當(dāng)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20%時(shí)，其存活率為2.52%，在膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%時(shí)其存活率升高至74.6%。

表 4 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of bile salt tolerance test膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 0.05 0.10 0.15 0.20成活率/% 84.3 74.6 30.2 2.52

2.9 耐高溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果

初次進(jìn)行耐高溫篩選時(shí)，C-1-3菌株表現(xiàn)出較差的耐高溫特性，50 ℃水浴20 min后的成活率幾乎為0，經(jīng)過多次馴化后，C-1-3菌株對高溫具有了一定的耐受性。如圖9所示，經(jīng)過馴化后的C-1-3菌株在40 ℃時(shí)成活率為94.3%，但當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，成活率降低至23.8%。

3 討 論

影響益生菌在腸道內(nèi)附殖、生長主要由兩大因素決定：低酸度環(huán)境及膽汁酸鹽的濃度［23-24］。本研究分離的菌株對酸度有較好的耐受性，但膽鹽耐受性較差，如何提高菌株的耐膽鹽能力很關(guān)鍵，曾東等［25］在考察玉米、豆粕、麥麩提取物對4 株乳桿菌膽鹽耐受力影響的研究中提到葡萄糖可以顯著提高乳酸菌的耐受能力，這可以作為日后提高乳桿菌對膽鹽耐受力的一個(gè)重要方法，對普通的MRS培養(yǎng)基進(jìn)行改良，添加適量的葡萄糖以提高菌株的耐膽鹽能力。另外，本研究分離的唾液乳桿菌對纖維素具有一定的降解能力，很少有文獻(xiàn)報(bào)道乳桿菌能夠降解纖維素，這是本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)。菌株的纖維素降解能力對其在畜禽飼養(yǎng)中的應(yīng)用具有重要實(shí)踐意義［26］。如何進(jìn)一步提高該菌株的益生性能及在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用效果，還有待進(jìn)一步的研究及生產(chǎn)檢驗(yàn)。

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遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2014561）

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613028 10.7506/spkx1002-6630-201613028. http://www.spkx.net.cn

中圖分類號：S831；Q939

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0157-05

收稿日期：2015-09-11

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201961；31302152）；中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2014M551125）；

作者簡介：陳新亮（1989—），男，碩士研究生，主要從事動物微生態(tài)研究。E-mail：303467045@qq.com

*通信作者：龍淼（1978—），男，講師，博士，主要從事動物營養(yǎng)代謝病與中毒病研究。E-mail：longmiao@syau.edu.cn

Isolation and Identification of Lactobacillus salivarius from Chicken Intestine and Its Biological Characteristics

CHEN Xinliang， SHAO Qibing， WANG Chao， HE Jianbin， ZHANG Yi， YANG Shuhua， LI Peng， LONG Miao*
（College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）

Abstract:An isolate of the anaerobic bacterium Lactobacillus salivarius was obtained from the intestine of chicken and identified by colony morphology， Gram staining， physio-biochemical reactions， and 16S rRNA sequencing analysis.Results showed that the strain was Lactobacillus salivarius and named as Lactobacillus salivarius C-1-3.Then the strain was subjected to antibacterial， cellulose degradation， and acid， bile salt and high temperature tolerance tests.It turned out that the strain C-1-3 had a powerful antibacterial effect against E.coli， Salmonella and Staphylococcus aureus.And it also had cellulose degradation ability.After several generations of domestication， this strain possessed good antibacterial performance and significant tolerance to acid and high temperature.

Key words:Lactobacillus salivarius； isolation and identification； biological characteristics