雜交-雜交瘤技術(shù)制備BsMAb的研究進展及其在食品安全檢測中的應(yīng)用

王 鋒，王 宇，王 弘，肖治理*（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642）

?

雜交-雜交瘤技術(shù)制備BsMAb的研究進展及其在食品安全檢測中的應(yīng)用

王 鋒，王 宇，王 弘，肖治理*
（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642）

摘 要：雙特異性單克隆抗體（bispecific monoclonal antibody，BsMAb）是指具有兩個不同特異性抗原結(jié)合位點的單克隆抗體分子。雜交-雜交瘤技術(shù)因其簡便易行、制備周期短，在制備BsMAb方面有較大優(yōu)勢?；陔s交-雜交瘤技術(shù)能制備出可以特異性識別兩種或者兩類小分子藥物的BsMAb，在食品安全多殘留免疫分析檢測中具有較好的應(yīng)用價值。本文綜述了雜交-雜交瘤技術(shù)制備BsMAb的進展，探討了基于該技術(shù)的BsMAb生成機制，討論分析了雜交-雜交瘤及BsMAb篩選制備的關(guān)鍵技術(shù)要點，并歸納了BsMAb在檢測食品中小分子污染物方面的應(yīng)用進展，旨在為食品安全多殘留免疫分析技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：雜交-雜交瘤技術(shù)；雙特異性單克隆抗體；多殘留；免疫分析

引文格式：

王鋒， 王宇， 王弘， 等.雜交-雜交瘤技術(shù)制備BsMAb的研究進展及其在食品安全檢測中的應(yīng)用［J］.食品科學(xué)， 2016，37（13）: 251-256.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613045. http://www.spkx.net.cn

WANG Feng， WANG Yu， WANG Hong， et al.Progress in hybrid-hybridoma technology to produce bispecific monoclonal antibody and its application in food safety detection［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 251-256.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613045. http://www.spkx.net.cn

雙特異性抗體（bispecific antibody，BsAb）是一類具有兩種不同抗原結(jié)合位點，功能上單價，結(jié)構(gòu)上雙價的具有雙重特異性的抗體分子的總稱。而雙特異性單克隆抗體（bispecific monoclonal antibody，BsMAb）是指基于雜交-雜交瘤技術(shù)制備的BsAb，其結(jié)構(gòu)與常規(guī)單克隆抗體類似（圖1）。1983年，Milstein等［1］首次采用雜交-雜交瘤的方法得到了抗生長抑素和抗過氧化物酶的BsMAb。目前，圍繞BsAb的研究主要集中于臨床醫(yī)學(xué)以及腫瘤等疾病的診斷和治療領(lǐng)域［2-4］。近年來，BsAb開始被應(yīng)用于多組分免疫分析，與基于單克隆抗體的單組分檢測方法和其他儀器方法相比表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢［5］。

制備BsAb的常規(guī)方法有化學(xué)重組法和基因重組法，前者產(chǎn)量較少、活性較低且易導(dǎo)致抗體變性，后者技術(shù)流程復(fù)雜且周期長［6-7］。雜交-雜交瘤技術(shù)是以傳統(tǒng)單克隆抗體技術(shù)為基礎(chǔ)，在常規(guī)雜交瘤的基礎(chǔ)上進行再次雜交，獲得雜交-雜交瘤，通過建立適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記方式［8-9］來制備BsAb的新技術(shù)。雜交-雜交瘤的產(chǎn)生可以是雜交瘤和脾細(xì)胞間的融合（三體雜交瘤/三體瘤），也可以是2 種雜交瘤細(xì)胞間的融合（四體雜交瘤/四體瘤）。通過該技術(shù)制備的BsMAb，其性質(zhì)類似于天然抗體，生物活性高，制備技術(shù)上與常規(guī)雜交瘤制備相似，容易實現(xiàn)。

1 雜交-雜交瘤技術(shù)制備BsMAb的研究進展

目前已有多位學(xué)者通過雜交-雜交瘤技術(shù)制備出了BsMAb，并將其應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、疾病診斷治療及生化標(biāo)記物替代物制備等領(lǐng)域（表1）。

Ferrini等［20］分別用8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine，8-AG）和5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，5-BrdU）誘變抗CD16雜交瘤細(xì)胞和抗卵巢癌相關(guān)抗原雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞融合篩選獲得了四體雜交瘤細(xì)胞株。

Lindhofer等［21］采用特異性分泌抗Thyl.2、CD45R、CD3等抗體的雜交瘤細(xì)胞進行兩兩組合制備了四種雜交-雜交瘤，使用8-AG對其中一個雜交瘤細(xì)胞株誘變，而另外一個雜交瘤細(xì)胞株對次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脫氧核苷（hypoxanthine-aminopterin-thymidine，HAT）敏感，經(jīng)碘乙酰胺處理后進行融合，篩選得到四體雜交瘤細(xì)胞株。

蘇瑾等［22］采用細(xì)胞融合法，利用8-AG藥物的誘變作用和neo基因的遺傳篩選標(biāo)記，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）及流式細(xì)胞儀篩選獲得四體雜交瘤細(xì)胞，制備出了抗人CD3和抗人IgM μ鏈的雙特異性抗體，且分泌BsMAb的雜交-雜交瘤的穩(wěn)定性及特異性與親本雜交瘤相似。

注：DC DEC-205.樹突狀細(xì)胞DEC-205（dendritic cell DEC-205）；AAF.N-（2-芴基）乙酰胺（acetylaminofluoren）；NS1蛋白.非結(jié)構(gòu)蛋白 1（non-structural 1 protein）；CD3.白 細(xì) 胞 分 化 抗 原 3（cluster of differentiation 3）；EpCAM.上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule）；HFRS.腎 綜 合 征 出 血 熱（hemorrhagic fever with renal syndrome）；SARS-CoV.嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrom coronavirus）。

2 基于雜交-雜交瘤技術(shù)的BsMAb生成機制

天然免疫球蛋白的產(chǎn)生遵循蛋白質(zhì)生物合成的基本規(guī)律，其生成可分為合成、裝配及分泌3 個階段［23］：首先通過基因轉(zhuǎn)錄翻譯，在核糖體上合成抗體的重鏈及輕鏈，之后主要通過兩條通路對其進行裝配，形成抗體的半分子結(jié)構(gòu)，經(jīng)鉸鏈區(qū)二硫鍵的連接組裝成完整的抗體分子，最后經(jīng)體外分泌。而通過雜交-雜交瘤技術(shù)制備BsMAb的過程同樣遵循此生物合成途徑。 但現(xiàn)有研究尚未能完整闡述BsMAb在三體雜交瘤/四體雜交瘤細(xì)胞中以何種方式合成、裝配并形成完整抗體分子。

目前，普遍推測BsMAb以圖2所示機制進行抗體合成（以四體雜交瘤方式制備BsMAb為例）［1，4，24-25］。在二次雜交的過程中，親本抗體的兩套基因同時表達(dá)，分別形成兩種重鏈及兩種輕鏈，因此完整抗體的組裝共有10 種方式，可分為單特異性抗體、雙特異性抗體及無活性抗體三類。居漪等［26］的研究表明，經(jīng)三體雜交瘤制備的腹水中同時存在這三類抗體，且含量不一，BsMAb含量為反應(yīng)免疫球蛋白的36%。Massino等［27］采用親和層析技術(shù)和放射免疫分析技術(shù)對四體雜交瘤中抗體分泌水平進行了研究分析。結(jié)果表明，雙特異性抗體的含量為總蛋白量的30%，且兩種單特異性抗體呈不均等性合成分泌。由兩種不同重鏈亞類組合的抗體，因不同重鏈所帶電荷的微小差異，在抗體的分離純化方面有著獨特的優(yōu)勢［28-29］。另有研究表明［30-32］，不同特異性的兩條輕鏈競爭結(jié)合一條重鏈時，同源的輕鏈與重鏈更容易結(jié)合。

3 雜交-雜交瘤及BsMAb篩選制備的關(guān)鍵技術(shù)要點

目前，關(guān)于雜交-雜交瘤技術(shù)制備BsMAb尚缺乏系統(tǒng)研究和理論指導(dǎo)，尤其是針對食品中的小分子污染物。圍繞雜交-雜交瘤及BsMAb的篩選制備還存在一些值得深入探究的關(guān)鍵技術(shù)問題，包括親本雜交瘤的選擇、親本雜交瘤的選擇標(biāo)記［8-9，33］、采用三體或四體雜交瘤的制備方式、雜交-雜交瘤的篩選、BsMAb的分離純化等。這些技術(shù)問題在一定程度上限制了BsMAb在多殘留檢測中的應(yīng)用。

親本雜交瘤的特性對于二次雜交結(jié)果具有重要影響，其中至少包含抗體類型、雜交瘤穩(wěn)定性兩方面因素。劉瑛等［34］研究顯示采用此方法制備的BsMAb抗體亞型與親本抗體相同，均為IgG1型。孟文霞等［35］將兩株分別分泌IgG2a型和IgG3型抗體的雜交瘤細(xì)胞融合后，成功獲得6 株雜交-雜交瘤細(xì)胞株。李剛［36］選取了2 株雜交瘤細(xì)胞株，分泌的單克隆抗體分別為IgG3型和IgG1型，抗體輕鏈均為κ鏈，采用雜交-雜交瘤技術(shù)獲得的三體雜交瘤和四體雜交瘤所產(chǎn)生的BsMAb分別為IgG2b-IgG1型和IgG3-IgG1型，抗體輕鏈均為κ鏈。至今尚未發(fā)現(xiàn)兩種分別分泌IgG類和IgM類抗體的雜交瘤細(xì)胞融合得到BsMAb的報道。有文獻(xiàn)表明，盡管不同類型的輕鏈與重鏈之間有可能發(fā)生隨機組合，但異源重鏈間的重組可能導(dǎo)致輕鏈與重鏈間的隨機組合被破壞，甚至導(dǎo)致喪失活性或僅有部分活性［37］。利用三體雜交瘤制備的抗體亞型不易推知。全昱東等［38］將分泌抗辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的IgG1型抗體的雜交瘤細(xì)胞與角蛋白免疫刺激的脾細(xì)胞融合，最終得到具有IgG1-IgG2a型的雙亞型BsMAb抗體分子。劉明旭等［39］將分泌IgG2a型抗體的雜交瘤細(xì)胞與經(jīng)抗原免疫刺激的脾細(xì)胞融合，最終也得到具有IgG1-IgG2a型的BsMAb抗體分子。而徐青等［40］將人丙種球蛋白免疫刺激的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與分泌抗HRP 的IgG1型抗體的雜交瘤細(xì)胞融合，獲得5 株能分泌雙特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其中1 株分泌的抗體亞型為IgG2a-IgG1，其余為IgG1-IgG1。推測產(chǎn)生差異的原因可能在于刺激脾細(xì)胞的抗原特性及刺激的過程有所不同。雜交瘤的穩(wěn)定性對二次雜交的成功率和穩(wěn)定性也存在較大影響，穩(wěn)定性較差的雜交瘤在誘導(dǎo)缺陷型過程中及二次雜交的過程中較容易導(dǎo)致失?。?1］。

親本雜交瘤的選擇標(biāo)記常采用基于藥物誘導(dǎo)酶缺陷型細(xì)胞株的方式，需要建立合適的細(xì)胞株篩選方案。不同的方案對于篩選得到的細(xì)胞株產(chǎn)生抗體的特異性、靈敏度有著重要的影響［42］。如果誘導(dǎo)藥物濃度過低，所需的誘導(dǎo)時間就長，長時間體外傳代可能會降低雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性；誘導(dǎo)藥物濃度過高，誘導(dǎo)時間短，但高濃度的藥物又可能會誘發(fā)突變，造成陽性丟失。因此，可以考慮聯(lián)合使用酶缺陷型篩選、耐細(xì)胞毒藥物型篩選或熒光標(biāo)記篩選等形式來提高篩選效率［43］。

理論上采用三體雜交瘤或四體雜交瘤的制備方法都可以得到BsMAb。從制備流程來講，在制備三體雜交瘤過程中由于增加了免疫動物的步驟，增加了篩選的難度，但與四體瘤相比，三體瘤的染色體數(shù)目明顯降低，這使得三體瘤細(xì)胞株更為穩(wěn)定。而四體雜交瘤制備過程較為簡單，只需建立合適的選擇標(biāo)記形式，但其染色體數(shù)目多，在傳代中更容易發(fā)生陽性丟失現(xiàn)象。據(jù)李剛［36］報道，四體雜交瘤分泌的BsMAb具有兩個親本單克隆抗體相似的靈敏度，三體雜交瘤分泌的BsMAb的靈敏度不及兩親本抗體。

雜交-雜交瘤細(xì)胞株的篩選目前主要通過兩種不同特異性目標(biāo)分析物的檢測結(jié)果來進行判定，操作較為繁瑣費時，也有報道采用橋聯(lián)ELISA和橋聯(lián)熒光激活細(xì)胞分選儀（fluorescence-activated cell sorter，F(xiàn)ACS）的方法來進行檢測［44］。此外，可以將兩親本雜交瘤細(xì)胞分別標(biāo)記不同的熒光素，融合后通過流式細(xì)胞儀進行篩選，這樣既可以省略藥物、毒物等對細(xì)胞株的誘導(dǎo)處理過程，又可以快速及時評估融合細(xì)胞的數(shù)量［45］。

采用動物體內(nèi)誘生法或體外培養(yǎng)法獲得的上清液中，常含有來自親本的雙價單克隆抗體，在一定程度上增加了BsMAb的分離純化難度［46］，建議可以采用親和層析、羥基磷灰石柱層析、離子交換層析等方法［40，47-48］進行純化。在前期篩選過程中，也可對雜交-雜交瘤細(xì)胞株進行多次的亞克隆，以提高其純度和穩(wěn)定性。

4 BsMAb在食品污染物多殘留檢測中的應(yīng)用

近年來，由于藥物的濫用，環(huán)境及食品中農(nóng)獸藥的殘留問題比較突出［49］。Zhou Qi［50］、Gao Baolong［51］、Dong Jiexian［52］等建立了基于單克隆抗體或小分子抗體的一種或一類農(nóng)獸藥殘留的免疫快速分析方法。但由于環(huán)境及食品中組分復(fù)雜，單一污染物殘留檢測已不能滿足實際檢測的需要［53］。發(fā)展多殘留免疫檢測技術(shù)成為現(xiàn)代農(nóng)獸藥殘留檢測技術(shù)發(fā)展的新趨勢?；贐sMAb的食品中小分子污染物多殘留檢測方法近幾年已有報道。

金仁耀等［54］采用藥物誘導(dǎo)方法，經(jīng)細(xì)胞融合得到抗克百威-抗三唑磷的四體雜交瘤細(xì)胞。以包被抗體、酶標(biāo)半抗原模式建立ELISA法，結(jié)果顯示BsMAb對克百威和三唑磷的IC50值分別為20 ng/mL和1.69 ng/mL，檢測限IC20值分別為4.46 ng/mL和0.36 ng/mL。克百威和三唑磷在水、土壤等環(huán)境樣品中的回收率為88.4%～117%。

李剛［36］采用雜交-雜交瘤技術(shù)制備得到了一株三體雜交瘤細(xì)胞LG-D6和一株四體雜交瘤細(xì)胞LG-A2。利用LG-D6細(xì)胞株分泌的BsMAb，建立了吡蟲啉-甲基對硫磷多殘留檢測方法。該BsMAb對吡蟲啉和甲基對硫磷的IC50值分別為121.6 ng/mL和8.3 ng/mL，檢測限分別為69.8 ng/mL和1.9 ng/mL，水質(zhì)樣品的添加回收率為87.4%～104.0%。隨后，Ouyang Hui等［55］將三體雜交瘤制備的BsMAb應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光動力學(xué)檢測，將辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶分別標(biāo)記吡蟲啉、甲基對硫磷兩種藥物半抗原，實現(xiàn)對兩種藥物的檢測，檢測限均為0.33 ng/mL，檢測范圍為1～500 ng/mL。

Hua Xiude等［56］采用三體雜交瘤技術(shù)制備了抗有機磷類和抗新煙堿類的BsMAb，建立的ELISA法結(jié)果表明，對于8 種有機磷農(nóng)藥和2 種新煙堿類殺蟲劑的平均IC50值分別為114.6 ng/mL和129.8 ng/mL。自來水、池塘水、葡萄、黃瓜和土壤的添加回收實驗結(jié)果表明，單一農(nóng)藥（甲基對硫磷或吡蟲啉）的添加回收率為86.8%～125.0%。該方法能實現(xiàn)同時檢測實際樣品中的兩類藥物。

余厚美等［57］制備出能穩(wěn)定分泌抗2 種β-激動劑（克倫特羅、萊克多巴胺）BsMAb的雜交-雜交瘤，并對抗體特異性、熱穩(wěn)定性等進行了研究，結(jié)果顯示BsMAb只對克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺有特異性反應(yīng)，與上述3 種藥物的交叉反應(yīng)率分別為100%、83%、67%。

Guo Yirong等［58］將膠體金顆粒標(biāo)記于呋喃丹、三唑磷2 種農(nóng)藥的單克隆抗體及能識別二者的BsMAb上，建立了同時檢測呋喃丹和三唑磷的膠體金免疫層析技術(shù)，水樣中兩者的檢測限分別為32 ng/mL和4 ng/mL。

5 結(jié) 語

隨著單克隆抗體制備技術(shù)日趨成熟，基于雜交-雜交瘤技術(shù)的小分子多殘留免疫檢測技術(shù)在食品安全檢測領(lǐng)域?qū)⒂休^大的研究應(yīng)用空間，建立一套適合小分子化合物的BsMAb制備及多殘留檢測技術(shù)的研究體系就顯得尤為重要。采用雜交-雜交瘤技術(shù)制備BsMAb時，在雜交瘤細(xì)胞的篩選、雜交方案的設(shè)計、BsMAb的純化、多殘留免疫分析方法的建立等方面均有待進一步系統(tǒng)深入研究。如何選擇合適的雜交-雜交瘤篩選方法和BsMAb純化方法成為雙特異性抗體在食品安全檢測應(yīng)用中的新突破。此外，建立新型免疫分析方法過程中，如何將人工抗原或雙特異性抗體進行多元標(biāo)記（酶、熒光素、量子點或功能化納米材料等），且如何保持標(biāo)記物的穩(wěn)定性成為目前限制其應(yīng)用的另外一個重要原因。雙特異性抗體的制備也可以為其在抗體基因方面的剪切修飾、BsMAb的三維空間結(jié)構(gòu)研究及其與不同特異性抗原分子的識別機制等諸多領(lǐng)域提供研究基礎(chǔ)材料。

因此，研究制備食品中不同污染物的BsMAb，建立基于BsMAb的多組分免疫分析技術(shù)是十分必要的，這也必將成為多殘留檢測領(lǐng)域新的研究熱點，對于多組分免疫分析研究具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

［1］ MILSTEIN C， CUELLO A C.Hybrid hybridomas and their use in immunohistochemistry［J］.Nature， 1983， 305: 537-540.DOI:10.1038/305537a0.

［2］ RADER C.Chemically programmed antibodies［J］.Trends in Biotechnology， 2014， 32（4）: 186-197.DOI:10.1016/ j.tibtech.2014.02.003.

［3］ SHEKHAR C.Double Whammy: bispecific antibodies help immune cells attack tumors［J］.Chemistry Biology， 2008， 15（9）: 877-878.DOI:10.1016/j.chembiol.2008.09.002.

［4］ BYRNE H， CONROY P J， WHISSTOCK J C， et al.A tale of two specificities: bispecific antibodies for therapeutic and diagnostic applications［J］.Trends in Biotechnology， 2013， 31（11）: 621-632.DOI:10.1016/j.tibtech.2013.08.007.

［5］ YAN X， LI H X， YAN Y， et al.Developments in pesticide analysis by multi-analyte immunoassays: a review［J］.Analtical Methods， 2014，6（11）: 3543-3554.DOI:10.1039/C3AY41946K.

［6］ 李菁， 林彤， 宋帥， 等.基因工程抗體研究進展［J］.生物技術(shù)通報，2009（10）: 40-44.

［7］ KONTERMANN R E.Bispecific antibodies［M］.Germany: Springer Press， 2011: 29-46.DOI:10.1007/978-3-642-20910-9.

［8］ KOOLWIJK P， ROZEMULLER E， STAD R K， et al.Enrichment and selection of hybrid hybridomas by percoll density gradient centrifugation and fluoreseent-aetivated［J］.Hybridoma， 1988， 7（2）: 217-224.DOI:10.1089/hyb.1988.7.217.

［9］ 劉靜， 殷竹君， 張耀娟， 等.次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型雜交瘤細(xì)胞的快速篩選方法［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2000， 20（3）: 179-180.DOI:10.3969/j.issn.1007-4368.2000.03.006.

［10］ WANG W W， DAS D， TANG X L， et al.Antigen targeting to dendritic cells with bispecific antibodies［J］.Journal of Immunological Methods， 2005， 306（1）: 80-92.DOI:10.1016/j.jim.2005.07.023.

［11］ LIU F， GUTTIKONDA S， SURESH M R.Bispecific monoclonal antibodies against a viral and an enzyme: utilities in ultrasensitive virus ELISA and phage display technology［J］.Journal of Immunological Methods， 2003， 274（1）: 115-127.DOI:10.1016/S0022-1759（02）00511-2.

［12］ SHINMOTO H， KOBORI M， TSUSHIDA T， et al.Competitive ELISA of bovine lactoferrin with bispecific monoclonal antibodies［J］.Bioscience Biotechnology Biochemistry， 1997， 61（6）: 1044-1046.DOI:10.1271/bbb.61.1044.

［13］ CAO Y， CHRISTIAN S， SURESH M R.Development of a bispecific monoclonal antibody as a universal immunoprobe for detecting biotinylated macromolecules［J］.Journal of Immunological Methods，1998， 220（1）: 85-91.DOI:10.1016/S0022-1759（98）00154-9.

［14］ AURIOL J， GUESDON J， MAZIE J C， et al.Development of a bispecific monoclonal antibody for use in molecular hybridisation［J］.Journal of Immunological Methods， 1994， 169（1）: 123-133.DOI:10.1016/0022-1759（94）90131-7.

［15］ GANGULY A， MALABADI R B， LOBENBERG R， et al.Development of an ultrasensitive hetero-sandwich ELISA assay based on bispecific monoclonal antibody for the detection of dengue NS1 protein［J］.Journal of Pharmacy Research， 2013， 7（5）: 374-380.DOI:10.1016/j.jopr.2013.05.013.

［16］ MORECKI S， LINDHOFER H， YACOVLEV E， et al.Induction of long-lasting antitumor immunity by concomitant cell therapy with allogeneic lymphocytes and trifunctional bispecific antibody［J］.Experimental Hematology， 2008， 36（8）: 997-1003.DOI:10.1016/ j.exphem.2008.03.005.

［17］ 李荔， 陳伯權(quán).抗腎綜合征出血熱病毒和抗辣根過氧化物酶的雙特異性單克隆抗體的建立［J］.病毒學(xué)報， 1989， 5（4）: 334-339.

［18］ 袁洪衛(wèi)， 林漢， 朱錫霞， 等.抗纖維蛋白-抗尿激酶雙特異性單克隆抗體的體內(nèi)外溶栓效果的研究［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報， 1998， 20（5）: 357-360.

［19］ SUNWOO H H， PALANIYAPPAN A， GANGULY A， et al.Quantitative and sensitive detection of the SARS-CoV spike protein using bispecific monoclonal antibody-based enzyme-linked immunoassay［J］.Journal of Virological Methods， 2013， 187（1）: 72-78.DOI:10.1016/j.jviromet.2012.09.006.

［20］ FERRINI S， PRIGIONE I， MIOTTI S， et al.Bispecific monoclonal antibodies directed to CD16 and to a tumor-associated antigen induce target-cell lysis by resting NK cells and by a subset of NK clones［J］.International Journal of Cancer， 1991， 48（2）: 227-233.DOI:10.1002/ ijc.2910480213.

［21］ LINDHOFER H， MOCIKAT R， STEIPE B， et al.Preferential species-restricted heavy/light chain pairing in rat/mouse quadromas: implications for a single-step purification of bispecific antibodies［J］.Journal of Immunology， 1995， 155（1）: 219-225.

［22］ 蘇瑾， 張亞莉， 郭志兵， 等.細(xì)胞融合法制備抗人CD3-抗人IgM μ鏈雙特異性抗體［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報， 2001， 21（12）: 902-905.

［23］ 王廷華， 李官成.抗體理論與技術(shù)［M］.北京: 科學(xué)出版社， 2013: 31-33.

［24］ MOLDENHAUER G.Bispecific antibodies from hybrid hybridoma［M］.Berlin: Springer， 2011: 29-46.

［25］ KUFER P， LUTTERBüSE R， BAEUERLE P A.A revival of bispecific antibodies［J］.Trends in Biotechnology， 2004， 22（5）: 238-244.DOI:10.1016/j.tibtech.2004.03.006.

［26］ 居漪， 徐肇華， 胡暢中.親和層析法提純雙特異性單克隆抗體［J］.上海免疫學(xué)雜志， 1998， 18（5）: 302-305.

［27］ MASSINO Y S， DERGUNOVA N N， KIZIM E A， et al.Quantitative analysis of the products of IgG chain recombination in hybrid hybridomas based on affinity chromatography and radioimmunoassay［J］.Journal of Immunological Methods， 1997，201（1）: 57-66.DOI:10.1016/S0022-1759（96）00212-8.

［28］ TAKAHASHI M， FULL S A.Production of murine hybrid-hybridomas secreting bispecific monoclonal antibodies for use in urease-based immunoassays［J］.Clinical Chemistry， 1988， 34（9）: 1693-1696.

［29］ STAERZ U D， BEVAN M J.Hybrid hybridoma producing a bispecific monoclonal antibody that can focus effector T-cell activity［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stases of America， 1986， 83（5）: 1453-1457.DOI:10.1073/pnas.83.5.1453.

［30］ de PREVAL C， FOUGEREAU M.Specific interaction between VH and VL regions of human monoclonal immunoglobulins［J］.Journal of Molecular Biology， 1976， 102（3）: 657-678.DOI:10.1016/0022-2836（76）90340-5.

［31］ KRANZ D M， VOSS E W.Restricted reassociation of heavy and light chains from hapten-specific monoclonal antibodies［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stases of America，1981， 78（9）: 5807-5811.DOI:10.1073/pnas.78.9.5807.

［32］ STEVENSON G T， MOLE L E.The specificity of chain interactions among immunoglobulins.combinations of gamma chains with kappa chains of the same subgroup as in the parent immunoglobulin G［J］.Biochemical Journal， 1974， 139（2）: 369-374.DOI:10.1042/bj1390369.

［33］ 裘雪梅， 劉仁榮， 徐玲， 等.次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型產(chǎn)抗蘇丹紅I單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的篩選［J］.時珍國醫(yī)國藥，2013， 23（11）: 2669-2670.

［34］ 劉瑛， 陶玉珍， 陳受霓.分泌抗HBsAg-抗HRP雙特異單克隆抗體雜交-雜交瘤的建株［J］.中國生物制品學(xué)雜志， 1992， 5（3）: 111-113.

［35］ 孟文霞， 王潤田， 張玉芬， 等.抗HIV p24和人A型紅細(xì)胞雙特異性單克隆抗體的研制［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志， 2004， 20（5）: 582-584.

［36］ 李剛.抗吡蟲啉-甲基對硫磷雙特異性單克隆抗體的研究［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011: 1-85.

［37］ de LAU W B， HEIJE K， NEEFJES J J， et al.Absence of preferential homologous H/L chain association in hybrid hybridomas［J］.Journal Immunology， 1991， 146（3）: 906-914.

［38］ 全昱東， 趙莉， 程明， 等.角蛋白和過氧化物酶雙特異性雜交雜交瘤的建立［J］.單克隆抗體通訊， 1990， 6（1）: 20-23.

［39］ 劉明旭， 張瑛勛， 王建安， 等.抗TNF和抗CALLA三體瘤的研制及其分泌抗體的初步純化［J］.單克隆抗體通訊， 1993， 9（2）: 1-4.

［40］ 徐青， 汪厚平， 巫山， 等.抗人IgG-抗HRP雙特異性單克隆抗體細(xì)胞株的建立與鑒定［J］.免疫學(xué)雜志， 2000， 16（3）: 225-227； 238.

［41］ LANZAVECCHIA A， SCHEIDEGGER D.The use of hybrid hybridomas to target human cytotoxic T lymphocytes［J］.European Journal of Immunology， 1987， 17（1）: 105-111.DOI:10.1002/ eji.1830170118.

［42］ 王宇.孔雀石綠及其代謝物免疫分析技術(shù)研究［D］.廣州: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2010: 112-123.

［43］ BRANSCOMB E E， RUNGE M S， SAVARD C E， et al.Bispecific monoclonal antibodies produced by somatic cell fusion increase the potency of tissue plasminogen activator［J］.Thrombosis and Haemostasis， 1990， 64（2）: 260-266.

［44］ SARKAR S， TANG X L， DAS D， et al.A bispecific antibody based assay shows potential for detecting tuberculosis in resource constrained laboratory settings［J］.PLoS ONE， 2012， 7（2）: e32340.DOI:10.1371/ journal.pone.0032340.

［45］ KARAWAJEW L， MICHEEL B， BEHRSING O， et al.Bispecific antibody-producing hybrid hybridomas selected by a fluorescence activated cell sorter［J］.Journal of Immunological Methods， 1987，96（2）: 265-270.DOI:10.1016/0022-1759（87）90323-1.

［46］ ARAGAY G， PINO F， MERKOCI A.Nanomaterials for sensing and destroying pesticides［J］.Chemical Reviews， 2012， 112（10）: 5317-5338.DOI:10.1021/cr300020c.

［47］ 陳曉釬， 沈德誠， 孫同哲.CD3/CD19雙特異性單克隆抗體的制備、鑒定及其再導(dǎo)向的研究［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報， 1998，20（5）: 351-356.

［48］ 崔運昌.單克隆抗體研究新進展（雙特異性單克隆抗體和雜交-雜交瘤技術(shù)）［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報， 1986， 7（2）: 175-176.

［49］ MOROZOVA V S， LEVASHOVA A I， EREMIN S A.Determination of pesticides by pesticide by enzyme immunoassay［J］.Journal of Analytical Chemistry， 2005， 60（3）: 202-217.DOI:10.1007/s10809-005-0075-0.

［50］ ZHOU Q， PENG D P， WANG Y L， et al.A novel hapten and monoclonal-based enzyme-linked immunosorbent assay for sulfonamides in edible animal tissues［J］.Food Chemistry， 2014， 154: 52-62.DOI:10.1016/j.foodchem.2014.01.016.

［51］ GAO B L， LIU J， DONG L X， et al.Broad specific enzyme-linked immunosorbent assay for determination of residual phenothiazine drugs in swine tissues［J］.Analtical Biochemistry， 2014， 454（1）: 7-13.DOI:10.1016/j.ab.2014.02.032.

［52］ DONG J X， LI Z F， LEI H T， et al.Development of a single-chain variable fragment-alkaline phosphatase fusion protein and a sensitive direct competitive chemiluminescent enzyme immunoassay for detection of ractopamine in pork［J］.Analtical Chimica Acta， 2012，736: 85-91.DOI:10.1016/j.aca.2012.05.033.

［53］ JIANG H， FAN M T.Multi-analyte immunoassay for pesticides: a review［J］.Analtical Letters， 2012， 45（11）: 1347-1364.DOI:10.1080/0 0032719.2012.675493.

［54］ 金仁耀， 朱國念.基于雙特異性單克隆抗體的克百威和三唑磷多殘留ELISA分析方法研究及在環(huán)境樣品中應(yīng)用［J］.核農(nóng)學(xué)報， 2013，27（4）: 515-522； 531.

［55］ OUYANG H， WANG L M， YANG S J， et al.Chemiluminescence reaction kinetics-resolved multianalyte immunoassay strategy using a bispecific monoclonal antibody as the unique recognition reagent［J］.Analtical Chemistry， 2015， 87（5）: 2952-2958.DOI:10.1021/ ac5045093.

［56］ HUA X D， WANG L M， LI G， et al.Multi-analyte enzymelinked immunosorbent assay for organophosphorus pesticides and neonicotinoid insecticides using a bispecific monoclonal antibody［J］.Analtical Methods， 2013， 5（6）: 1556-1563.DOI:10.1039/c3ay26398c.

［57］ 余厚美， 崔廷婷， 馮才偉， 等.抗3種β-激動劑雙特異性單克隆抗體的建立與鑒定［J］.化學(xué)試劑， 2012， 34（7）: 607-611.

［58］ GUO Y R， LIU S Y， GUI W J， et al.Gold immunochromatographic assay for simultaneous detection of carbofuran and triazophos in water samples［J］.Analtical Biochemistry， 2009， 389（1）: 32-39.DOI:10.1016/j.ab.2009.03.020.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613045

中圖分類號：TS207.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0251-06

收稿日期：2015-09-24

基金項目：廣東省自然科學(xué)基金項目（S2012010010323）；廣東省科技計劃項目（2014B070706001）

作者簡介：王鋒（1991—），男，碩士研究生，研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail：wangfg024@163.com

*通信作者：肖治理（1978—），女，副教授，博士，研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail：scauxzl@scau.edu.cn

Progress in Hybrid-Hybridoma Technology to Produce Bispecific Monoclonal Antibody and Its Application in Food Safety Detection

WANG Feng， WANG Yu， WANG Hong， XIAO Zhili*
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety， College of Food Science， South China Agricultural University，Guangzhou 510642， China）

Abstract:Bispecific monoclonal antibodies （BsMAb） are monoclonal antibody molecules with two different specific antigen-binding sites.Hybrid-hybridoma technology has a great advantage in the preparation of BsMAb because of its easy operation and less time consumption.BsMAbs with 2 distinct antigen-binding sites produced by the hybrid-hybridoma technology could specifically recognize antigens of 2 drugs or 2 classes of drugs， and are applicable in the multi-residue determination of foods.In this paper， we elaborate recent progress in the development of hybrid-hybridoma technology and explore the mechanism of BsMAb generation by the hybrid-hybridoma method.Several important factors influencing the hybrid-hybridoma technology are discussed， and the application of BsMAb in food safety detection is also reviewed.This paper will provide some references for the development and application of BsMAb in multi-residue immunoassay of foods.

Key words:hybrid-hybridoma technology； bispecific monoclonal antibody （BsMAb）； multi-residue； immunoassay