苦瓜核糖體失活蛋白生物活性與功能研究進(jìn)展

楊谷良，李士明*，王書珍*（黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃岡 438000）

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苦瓜核糖體失活蛋白生物活性與功能研究進(jìn)展

楊谷良，李士明*，王書珍*
（黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃岡 438000）

摘 要：核糖體失活蛋白（ribosome-inactivating proteins，RIPs）是一類能夠脫去真核細(xì)胞28S rRNA內(nèi)SRL區(qū)域的A4342，從而破壞延伸因子與核糖體的結(jié)合，將蛋白質(zhì)的生物合成抑制在延伸階段的蛋白質(zhì)家族。RIPs有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，苦瓜中已發(fā)現(xiàn)的α-苦瓜素、β-苦瓜素、γ-苦瓜素、δ-苦瓜素、ε-苦瓜素、MAP30等，均屬于Ⅰ型RIPs。這些RIPs具有抗病毒、抗菌、抗蟲害、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等生物學(xué)活性，受到了人們的廣泛關(guān)注。本文從RIPs的分類、生物學(xué)活性、功能與應(yīng)用等方面，對(duì)苦瓜中的RIPs進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：苦瓜；核糖體失活蛋白；分類；生物活性；功能

引文格式：

楊谷良， 李士明， 王書珍.苦瓜核糖體失活蛋白生物活性與功能研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（13）: 226-231.

YANG Guliang， LI Shiming， WANG Shuzhen.Progress in research on biological activity and functions of ribosomeinactivating proteins in bitter mellon［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 226-231.（in Chinese with English abstract）

核糖體失活蛋白（ribosome-inactivating proteins，RIPs）是一類主要存在于植物中的具有RNA N-糖苷酶活性的毒蛋白，RIPs作用于真核細(xì)胞核糖體大亞基的28S rRNA，脫去28S rRNA GAGA序列結(jié)構(gòu)中的A4324，破壞核糖體結(jié)構(gòu)，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。在葫蘆科、大戟科、禾本科和石竹科等多種植物中，都含有豐富的RIPs［1］。

最初，人們提取RIPs含量比較豐富植物的組織提取物，應(yīng)用于病毒防治、抗蟲、墮胎等方面。19世紀(jì)末，發(fā)現(xiàn)蓖麻的（Ricinus communis L.）種子中含有RIPs：蓖麻毒蛋白，這是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的RIP。第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)的RIPs是相思子（Abrus precatorius L.）中的相思子毒蛋白。在20世紀(jì)60年代，確定了來源于相思子的abrin具有抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的功能，并于20世紀(jì)70年代，確定了RIPs對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生毒性，會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［2］。Stirpe等［3］于1980年進(jìn)一步確認(rèn)了RIPs的功能是抑制蛋白質(zhì)合成過程中的延伸作用，并將這一類蛋白質(zhì)命名為核糖體失活蛋白。在Stripe等［3］確認(rèn)了RIPs具有抑制蛋白質(zhì)合成的作用后，人們開始廣泛關(guān)注RIPs，從更多植物材料中分離鑒定了一些RIPs，并發(fā)現(xiàn)了它們抗病毒、抗腫瘤、抗菌抗蟲、凈化骨髓和墮胎等生物學(xué)活性［2］。

關(guān)于RIPs的生物活性，主要研究其與核糖體的相互作用和對(duì)核酸的作用等，目前，己發(fā)現(xiàn)RIPs可以作用于rRNAs、hsDNA、mRNA、poly（A）、多聚ADP核糖化蛋白等多種底物，具有RNA N-糖苷酶活性、RNase活性、DNA like活性、超氧化物歧化酶活性等，在墮胎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等方面具有廣泛的應(yīng)用潛力（表1）。在應(yīng)用研究方面，RIPs與抗體偶聯(lián)制成免疫毒素蛋白可用于靶向治療惡性腫瘤。同時(shí)，開始了關(guān)于天花粉毒蛋白等對(duì)艾滋病病毒的抑制研究。還有一部分研究，通過直接施用RIPs或轉(zhuǎn)基因的方法，將RIPs用于植物抗蟲抗病等方面，發(fā)現(xiàn)RIPs處理后，能夠顯著提高處理植物對(duì)特定病害和蟲害的抗性［4-5］。

表 1 核糖體失活蛋白的活性功能［27］Table 1 Bioactivity andfunctionsofRIPs［27］來源 RIP 分子質(zhì)量/kD pI 活性Ⅰ型RIPs Amaranthus viridis Amaranthin 30 9.8 RNA N-糖苷酶活性、抑制蛋白質(zhì)翻譯（體外）Momordica balsamina Balsamin 28 N/A RNA N-糖苷酶活性、抑制蛋白質(zhì)翻譯（體外）Bougainvillea spectabilis Bouganin 26 9.6 腺嘌呤核苷酸酶、抑制蛋白質(zhì)合成Lychnis chalcedonica Lychnin ≈30 N/A 多聚腺苷酸水解酶、抑制蛋白質(zhì)合成M.charantia MAP30 30 N/A RNA N-糖苷酶活性、抗HIV、抗腫瘤、非細(xì)胞體系的翻譯抑制α-Momorcharin 30 9 終止孕娠、抗腫瘤、抗HIV、免疫抑制β-Momorcharin 29 9 終止孕娠、抗腫瘤、抗HIV、免疫抑制Momordica cochinchinensis Cochinin 28 N/A RNA N-糖苷酶活性、抗腫瘤、抑制蛋白質(zhì)合成Gelonium multiflorum Gelonin 30 8.15 RNA N-糖苷酶活性、抗腫瘤、抑制蛋白質(zhì)合成、DNA水解酶Hypsizigus marmoreus Marmorin 10 N/A 非細(xì)胞體系的翻譯抑制、抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶、抗增殖Lyophyllum shimeji Lyophyllin 20 N/A 抑制有絲分裂、抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶、抗真菌Trichosanthes kirilowii Trichosanthrin ≈13 N/A RNA N-糖苷酶活性、非細(xì)胞體系的翻譯抑制Benin hispada Hispin 21 N/A 水解tRNA、RNA N-糖苷酶活性、抑制真菌Phytolacca heterotepala Heterotepalins 28～36 8.5～9.5 RNA水解酶活性、RNA N-糖苷酶活性Flammulina velutipes Velin 19 N/A RNA N-糖苷酶活性、非細(xì)胞體系中翻譯抑制Flammin 30 N/A RNA N-糖苷酶活性、非細(xì)胞體系中翻譯抑制Ⅱ型RIPs Adenia lanceolata Lanceolin 61 N/A 多聚腺苷酸水解酶活性、非細(xì)胞體系中翻譯抑制、凝血Adenia stenodactyla Stenodactylin 63 N/A 多聚腺苷酸水解酶活性、非細(xì)胞體系中翻譯抑制、凝血Cucurbita foetissima Foetidissimin II 61 N/A RNA N-糖苷酶活性、抗腫瘤、非細(xì)胞體系中翻譯抑制Sambucus ebulus Ebulin I 56 N/A RNA N-糖苷酶活性、非細(xì)胞體系中翻譯抑制Viscum album Mistletoe 65 N/A RNA N-糖苷酶活性、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)Viscum articulatum Articulatin D 66 5.4 RNA N-糖苷酶活性、凝血、非細(xì)胞體系中翻譯抑制Cinnamomum camphora Cinnamomin 61 N/A RNA N-糖苷酶活性、抗腫瘤

RIPs在植物中的表達(dá)具有差異性，具體表現(xiàn)在不同器官中RIPs的含量差別較大；在植物生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段，RIPs的含量甚至種類也有差異。在植物的種子、果實(shí)、根、莖、葉等不同部位都含有RIPs，但以種子和果實(shí)中RIPs的含量最多，根和莖中的含量相對(duì)較少，而在葉中的含量是最少的。例如，肥皂草種子中RIPs的含量占總蛋白含量的7%，但是在其葉片中，RIPs的含量卻很微少。除了不同部位在含量上存在差異外，不同器官中RIPs的種類也有差異，而且，同一器官中一般含有幾種不同的RIPs。比如，肥皂草的種子中，RIPs的種類為皂素-L1、L2，在根中的RIPs卻以皂素-R1、R2、R3為主。小麥葉片中RIPs主要為麥芽凝集素-1，種子中則以麥芽凝集素為主。以美洲商陸為例，春天的葉片中RIPs為商陸抗病毒蛋白（pokeweed antiviral protein，PAP），夏天葉片中的RIPs主要為PAP-II，在種子中主要以PAP-S為主［6］。除了在不同部位，不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，RIPs具有差異表達(dá)的特性外，當(dāng)植物受到環(huán)境壓力、機(jī)械損傷、病蟲害感染，或施加茉莉酸（jasmonic acid，JA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）等外源植物激素后，RIPs的表達(dá)量也會(huì)增加。Chaudhry等［7］研究了JA和ABA對(duì)大麥的影響，發(fā)現(xiàn)大麥葉片中RIPs的表達(dá)量明顯增加，并且，大麥葉片中的RIPs也會(huì)被干燥、損傷、衰老等極端條件誘導(dǎo)表達(dá)。

I型RIPs大多是糖基化修飾的堿性蛋白質(zhì)，pI值介于8～10。也有少量RIPs不含糖基，如Saporin、PAP等。在體外，RIPs比較穩(wěn)定，經(jīng)過反復(fù)凍融和干燥等處理仍能夠保持活性。但是，在體內(nèi)，RIPs半衰期則相當(dāng)短，如天花粉素（trichosanthin，TCS）的血漿半衰期只有8.4～12.7 min。然而，利用用毒性低、免疫原性低、水溶性的小分子對(duì)RIPs修飾，能夠增加其對(duì)蛋白酶的水解作用的抗性，提高其在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。如聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾后的TCS、α-苦瓜素等，在血漿中的半衰期均可達(dá)幾小時(shí)［8-9］。

苦瓜（Momordica charantia L.）是葫蘆科苦瓜屬的藤蔓性一年生草本植物，在中國、印度、巴基斯坦、孟加拉及東南亞等地區(qū)都有栽培，苦瓜的果實(shí)中含有豐富的維生素、礦物質(zhì)和氨基酸等活性物質(zhì)，是一種藥食兩用的蔬菜［10］?？喙瞎麑?shí)的RIPs具有降血糖、降血脂、抗菌、調(diào)節(jié)免疫能力、抗腫瘤和抗人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）病毒等多種功效，受到人們的廣泛關(guān)注［11-12］?？喙现屑喊l(fā)現(xiàn)RIPs主要有α-苦瓜素、β-苦瓜素、γ-苦瓜素、δ-苦瓜素、ε-苦瓜素、MAP30等，均屬于I型RIPs。本文將從苦瓜核糖體失活蛋白的類型、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、生物學(xué)活性等方面對(duì)其進(jìn)行綜述。

1 RIPs的分類

根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和所含肽鏈數(shù)量的差異，RIPs分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型［13］。

Ⅰ型RIPs是一種只有一條多肽鏈的堿性蛋白，分子質(zhì)量為26～30 kD，等電點(diǎn)一般在8～10。在體內(nèi)，Ⅰ型的RIPs先以無活性的前體原蛋白形式存在，前體原蛋白的N端含有一段定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的信號(hào)肽序列，該信號(hào)肽的存在，使得RIPs前體能夠在細(xì)胞內(nèi)定向轉(zhuǎn)運(yùn)，減少對(duì)自身細(xì)胞內(nèi)核糖體的毒害作用。由于缺少識(shí)別與結(jié)合細(xì)胞表面糖蛋白的B鏈，在進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，Ⅰ型RIPs很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，對(duì)細(xì)胞的毒性較?。?4］。Ⅰ型RIPs在自然界中分布最多［15］，在苦瓜中所發(fā)現(xiàn)的苦瓜抑制劑（M.charantia inhibitor，MCI）、苦瓜凝集素（M.charantia lectin，MCL）、α-苦瓜素、β-苦瓜素、δ-苦瓜素、γ-苦瓜素和苦瓜抗HIV蛋白30等均屬于Ⅰ型RIPs［16］。其中，α-苦瓜素的分子質(zhì)量為29 kD，中性糖含量為1.6%；β-苦瓜素的分子質(zhì)量為28 kD，中性糖含量為1.3%；γ-苦瓜素是從苦瓜中分離得到的一種小分子質(zhì)量RIPs，其分子質(zhì)量?jī)H為11.5 kD，不僅具有RNA N-糖苷酶活性，還具有類超氧化物歧化酶活性；MAP30最先是從苦瓜中分離鑒定的，具有抗HIV-1活性、抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和抗細(xì)菌等生理活性的一種RIPs（表1）［17］。

Ⅱ型RIPs由具有RNA N-糖苷酶活性的A鏈和凝集素結(jié)合活性的B鏈組成，兩條肽鏈間通過二硫鍵連接在一起，Ⅱ型RIPs的分子質(zhì)量為60～65 kD，等電點(diǎn)為6～10［18］。由于B鏈具有2 個(gè)糖基化位點(diǎn)，能夠識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞表面以半乳糖為末端的糖蛋白或糖脂，協(xié)助A鏈進(jìn)入細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，剛合成的Ⅱ型RIPs以沒有活性的前原蛋白存在，前原蛋白N端具有信號(hào)肽序列，當(dāng)信號(hào)肽被切除，連接A-B鏈的二硫鍵被蛋白質(zhì)二硫鍵還原酶還原后，釋放出有酶活力的A鏈［19］。

剛合成的Ⅲ型RIPs也是以沒有活性的前體蛋白形式存在于細(xì)胞中，其N端和C端各有一段延伸區(qū)域，N端和C端之間通過一段連接序列連接在一起。當(dāng)N端和C端之間的連接序列被酶切除，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域連接形成多肽鏈后，才形成了有活性的RIPs。Ⅲ型RIPs種類較少，目前只在大麥和玉米中發(fā)現(xiàn)［19］。

2 苦瓜RIPs的酶活特性

2.1 RNA水解酶活性

1982年，Endo等［20］從巨曲霉菌（Aspergillus giganteus）中分離得到一種特殊形式的RIP：α-八疊球菌，α-八疊球菌能將28S rRNA的G4325和A4326之間的磷酸二酯鍵水解，將28S rRNA 3′-末端450核苷的核苷酸片斷切除，導(dǎo)致延伸因子I催化的氨基酰tRNA無法與核糖體結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。Mock等［21］研究了離體條件下苦瓜α-苦瓜素和β-苦瓜素對(duì)rRNA和tRNA的作用，發(fā)現(xiàn)α-苦瓜素和β-苦瓜素都具有RNA水解酶活性，作用于磷酸二酯鍵，使rRNA和tRNA發(fā)生水解。在體外實(shí)驗(yàn)中，來源于苦瓜的α-苦瓜素和β-苦瓜素還能夠水解poly（U）寡聚核苷酸，是苦瓜RIPs具有RNase活性的又一有力證明?？赡苡捎谠诜肿訕?gòu)型上存在差異，α-苦瓜素和β-苦瓜素的RNase酶活差別較大，β-苦瓜素的RNA酶活性是α-苦瓜素的15 倍［21］。

2.2 RNA N-糖苷酶活性

Endo等［20］發(fā)現(xiàn)蓖麻毒蛋白能夠識(shí)別和催化核糖體RNA GAGA序列結(jié)構(gòu)中的A4234糖苷鍵，使A4234從28S rRNA上脫落，導(dǎo)致核糖體失活。Ren Jingshan等［22］從晶體結(jié)構(gòu)的角度解釋了α-苦瓜素脫去28S rRNA的A4324殘基后，延伸因子2無法結(jié)合到核糖體大亞基上，蛋白質(zhì)合成受阻。以水稻rRNAs為材料，本課題組發(fā)現(xiàn)在30 μL的反應(yīng)體系中含有2 μg的苦瓜α-苦瓜素時(shí)，28S rRNA的超螺旋結(jié)構(gòu)部分被破壞，當(dāng)30 μL的反應(yīng)體系中的α-苦瓜素含量增加到4 μg時(shí)，苦瓜α-苦瓜素能夠從多個(gè)位點(diǎn)上脫去rRNAs的嘌呤堿基（包括腺嘌呤和鳥嘌呤）［23］。RIPs的RNA N-糖苷酶活性受到多種因素影響，當(dāng)pH值在6.5～9.0之間時(shí)，其RNA N-糖苷酶活性較穩(wěn)定，且該酶的活性隨K+濃度的提高而增加。Tyagi等［24］對(duì)苦瓜β-苦瓜素的活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)苦瓜β-苦瓜素的活性受NH濃度影響較大，Mn2+也影響其活性。

2.3 DNase-like活性

Thomas等［25］發(fā)現(xiàn)，純化的α-苦瓜素和β-苦瓜素均能夠?qū)⒊菪碾p鏈SV-40 DNA切割形成開環(huán)形或線性DNA。延長(zhǎng)處理時(shí)間后，開環(huán)形或線形DNA沒有被進(jìn)一步酶解。同時(shí)，α-和β-苦瓜素對(duì)線性DNA，如λDNA、T7噬菌體DNA等，均沒有表現(xiàn)出DNase-like活性。說明RIPs的識(shí)別和切割作用依賴于超螺旋DNA的空間結(jié)構(gòu)。這與Ⅰ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的功能相似，而與DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別特定的堿基序列存在差異。目前，多種不同來源的RIPs均被證明具有超螺旋DNA的解旋酶活性。例如，來源于苦瓜種子的MAP30能催化雙鏈DNA的斷裂，使超螺旋的病毒DNA和質(zhì)粒DNA發(fā)生不可逆地解旋作用，進(jìn)而形成拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)上的無活性產(chǎn)物。和解旋酶相比，超螺旋DNA被RIPs解旋后，不能夠重新形成超螺旋結(jié)構(gòu)［26］。Wang Shuzhen等［23］分離了從大腸桿菌中重組表達(dá)的苦瓜α-苦瓜素，α-苦瓜素能夠解旋質(zhì)粒DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)，將超螺旋的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成開環(huán)形，甚至線狀結(jié)構(gòu)。并發(fā)現(xiàn)α-苦瓜素的這種類脫氧核糖核酸酶活性與溶液中離子的種類和濃度有關(guān)系，當(dāng)溶液中存在一定濃度的Mg2+、Zn2+、Ca2+或Pb2+等二價(jià)陽離子時(shí)，重組α-苦瓜素表現(xiàn)出類脫氧核糖核酸酶活性，并且這種活性隨著二價(jià)陽離子濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)溶液中含有Mn2+時(shí)，α-苦瓜素會(huì)導(dǎo)致DNA的結(jié)構(gòu)受損，電泳后幾乎檢測(cè)不到完整的DNA條帶。而當(dāng)溶液中沒有二價(jià)陽離子時(shí)，α-苦瓜素不能使超螺旋DNA發(fā)生解旋。

病毒DNA的拓?fù)鋵W(xué)活性是其整合到寄主細(xì)胞的基因組的前提，超螺旋結(jié)構(gòu)的解旋，將導(dǎo)致病毒DNA拓?fù)鋵W(xué)活性喪失。RIPs的類脫氧核糖核酸酶活性可以起到阻止病毒DNA整合到寄主基因組的效果。

3 苦瓜RIPs的功能與應(yīng)用

苦瓜RIPs具有抗病毒、抗菌、抗蟲害、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、墮胎等功效。已經(jīng)逐漸應(yīng)用于提高農(nóng)作物抗性、疾病治療和醫(yī)藥研究等方面［28-31］。

3.1 對(duì)細(xì)菌、真菌的抗性

Vivanco等［32］發(fā)現(xiàn)從茉莉花（Mirabilis expansa）根部提取的ME1和ME2對(duì)丁香假單胞菌、農(nóng)桿菌、放射性土壤桿菌等均顯示出較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制活性。從煙草中純化的煙草核糖體失活蛋白（tobacco RIP，TRIP）對(duì)馬鈴薯青枯病菌也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制活性［32］。Wang Shuzhen等［23］研究了在大腸桿菌重組表達(dá)的苦瓜α-苦瓜素對(duì)真菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)α-苦瓜素對(duì)真菌腐皮鐮孢菌和尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)抑制的IC50值分別為6.23 μmol/L和4.15 μmol/L，經(jīng)過α-苦瓜素處理后，腐皮鐮孢菌和尖孢鐮刀菌表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的特征：細(xì)胞內(nèi)形成大量凋亡小體和胞內(nèi)小泡、染色質(zhì)固縮并沿核膜分布、細(xì)胞膜內(nèi)陷、細(xì)胞核膨脹等，推測(cè)α-苦瓜素作用于菌體細(xì)胞內(nèi)如DNA、rRNA、tRNA等組分，對(duì)細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞器等細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了較大的壓力，從而誘導(dǎo)了細(xì)胞調(diào)亡的發(fā)生。

利用苦瓜RIPs對(duì)細(xì)菌和真菌的抑制作用，我們可以將其加工成生物農(nóng)藥，替代傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥，用于農(nóng)作物的病蟲害防治，RIPs也具有疾病治療、食品貯藏保鮮等應(yīng)用潛力。

3.2 提高植物的防御能力

Logemann等［33］發(fā)現(xiàn)在煙草中轉(zhuǎn)入RIPs基因后，顯著提高了煙草對(duì)立枯絲核菌的抗性。B-32基因轉(zhuǎn)入小麥后，提高了小麥對(duì)赤霉病的抗性［34］。Zhu Feng等［35］將多種病毒接種在涂布了苦瓜α-苦瓜素的煙草植株上，病毒接種3 d后，涂布了苦瓜α-苦瓜素的煙草，病癥輕于對(duì)照，活性氧含量也低于對(duì)照；接種病毒15 d后，植株內(nèi)病毒外殼蛋白的合成完全受到抑制，病毒DNA的復(fù)制水平較低。Wang Shuzhen等［23］從重組大腸桿菌中純化得到的苦瓜α-苦瓜素對(duì)銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌等細(xì)菌也表現(xiàn)出較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制效果。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦瓜RIPs能夠抑制植株內(nèi)細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，可以將RIPs基因轉(zhuǎn)入植物，提高植物的抗性，或者在發(fā)病初期，噴施一定濃度的RIPs液，預(yù)防植物疾病的發(fā)生，達(dá)到減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，生產(chǎn)綠色健康的食品。

3.3 對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

Manoharan等［36］研究了苦瓜α-苦瓜素、β-苦瓜素對(duì)培養(yǎng)的1321N1、Gos-3、U87-MG、Sk Mel、Corl-23 和Weri Rb-1等多種癌細(xì)胞的影響，經(jīng)過α-苦瓜素或β-苦瓜素處理后，所處理細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9基因的表達(dá)水平顯著增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度大幅提升，細(xì)胞色素c活性增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦瓜α-苦瓜素、β-苦瓜素能夠促進(jìn)多種癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞的比例逐漸增加。齊文波等［37］研究了苦瓜α-苦瓜素、β-苦瓜素的抗腫瘤活性，兩者對(duì)S180實(shí)體瘤生長(zhǎng)和人白血病細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成均具有較強(qiáng)的抑制作用，是良好的抗癌活性物質(zhì)。

Caspase-3、Caspase-9基因的表達(dá)水平上升，抗凋亡蛋白Bcl-2和前凋亡蛋白Bak的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致胞內(nèi)Bax/Bcl-2比例升高，Ca2+從Ca2+庫中釋放、細(xì)胞色素c釋放，下游執(zhí)行Caspase被激活，最終引起細(xì)胞凋亡［38-40］。

4 結(jié) 語

近年來，國內(nèi)外學(xué)者從植物中分離到了多種RIPs基因，建立了多種RIPs分離提純的方法。對(duì)于RIPs的活性研究逐漸深入，通過動(dòng)物模型、細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)，確定了RIPs抗病毒、抗菌、提高植物抗性、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等生物活性［41-42］。但是，對(duì)于RIPs導(dǎo)致核糖體失活的機(jī)理，如I型RIPs進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制、RIPs的RNA N-糖苷酶的活性與RIPs的結(jié)構(gòu)和活性中心關(guān)系等，目前還沒有得出一個(gè)公認(rèn)的結(jié)論。

在體內(nèi)，苦瓜RIPs合成后，需要經(jīng)過糖基化等加工修飾，但是我們利用大腸桿菌對(duì)α-苦瓜素進(jìn)行異源重組表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沒有經(jīng)過糖基化等修飾的α-苦瓜素同樣能夠抑制腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌等的生長(zhǎng)［23］。這為本課題組利用RIPs提供了一種的新思路，將重組的RIPs在大腸桿菌、酵母細(xì)胞中異源表達(dá)，可以經(jīng)濟(jì)快速地獲取RIPs，應(yīng)用于真菌或細(xì)菌的防治。

RIPs是一種細(xì)胞毒性物質(zhì)，萬莉等［43］的研究結(jié)果顯示，苦瓜RIPs對(duì)于小鼠的半致死量為25.196 mg/kg，大鼠被動(dòng)皮膚過敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果揭示了苦瓜籽RIPs可產(chǎn)生明顯的免疫毒性。所以，如果直接將RIPs用于疾病治療，將對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性，甚至引起正常細(xì)胞的死亡［44-45］。所以，加大RIPs的分離鑒定，篩選出一些生物活性高、免疫毒性低的RIPs；因此，仍需要加大RIPs的作用機(jī)理、三維結(jié)構(gòu)和活性中心等的研究，以便從分子水平對(duì)RIPs進(jìn)行改造，達(dá)到提高RIPs的生物活性，降低其免疫毒性的目的。Porro等［46］將mAb（一種抗CD5的單克隆抗體）連接到苦瓜RIPs上以后，對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞的IC50值為10 pmol/L，經(jīng)過10 μg/mouse的劑量處理后，80%小鼠的腫瘤生長(zhǎng)受到抑制，37 ℃條件下處理2 h后，血漿中仍保留有80%的抗體-RIPs。所以，將抗體與RIPs偶聯(lián)制備的靶細(xì)胞藥物，能夠減少其對(duì)正常細(xì)胞的損傷，延長(zhǎng)其血漿半衰期限，增加其治療效果，是RIPs作為藥物開發(fā)的一個(gè)方向。

基于以上問題，開展RIPs基因克隆、三維結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理和免疫抗原等方面的研究，將為確定RIPs的作用機(jī)理打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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王書珍（1984—），女，講師，博士，研究方向?yàn)橹参锓肿蛹?xì)胞遺傳學(xué)。E-mail：wangshuzhen710@whu.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613041 10.7506/spkx1002-6630-201613041. http://www.spkx.net.cn 10.7506/spkx1002-6630-201613041. http://www.spkx.net.cn

中圖分類號(hào)：S482.8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）13-0226-06

收稿日期：2015-10-03

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31500995）；黃岡師范學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目（2014022203）

作者簡(jiǎn)介：楊谷良（1974—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)橹参镞z傳育種。E-mail：469436773@qq.com

*通信作者：李士明（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：shiming@rutgers.edu

Progress in Research on Biological Activity and Functions of Ribosome-Inactivating Proteins in Bitter Mellon

YANG Guliang， LI Shiming*， WANG Shuzhen*
（College of Life Science， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， China）

Abstract:Ribosome-inactivating proteins （RIPs） are a family of protein than can remove A4324from the highly conserved and surface-exposed sarcin/ricin loop （SRL） in the 28S rRNA of eukaryotic ribosomes.The depurination destroys the interaction between elongation factors and ribosome， thereby resulting in the inactivation of ribosome and the inhibition of protein synthesis.RIPs can be classified into type I， type II and type III.The RIPs identified in Momordica charantia L.，such as α-momorcharin， β-momorcharin， γ-momorcharin， δ-momorcharin， ε-momorcharin and MAP30， all belong to the type I RIPs.Antiviral， antibacterial， pesticidal and anti-tumor， hypolipidemia， hypoglycemia and other biologically activities have been reported for these RIPs.In this article， the classification， biologically activity， function and application of RIPs have been reviewed in the hope of providing a theoretical basis for further development and utilization of bitter mellon RIPs.

Key words:Momordica charantia L.； ribosome-inactivating proteins （RIPs）； classification； biological activity； function