利用改良電融合法制備雜交瘤細胞的試驗探索

吳　　夢，劉作華，3，羅　　林，丁玉春，葛良鵬*，3（.重慶市畜牧科學院，重慶 榮昌 402460；2.農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學重點實驗室，重慶 榮昌 402460；3.養(yǎng)豬科學重慶市市級重點實驗室，重慶 榮昌 402460）

利用改良電融合法制備雜交瘤細胞的試驗探索

吳夢1，2，劉作華1，2，3，羅林1，丁玉春1，2，葛良鵬*1，2，3
（1.重慶市畜牧科學院，重慶 榮昌 402460；2.農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學重點實驗室，重慶 榮昌 402460；3.養(yǎng)豬科學重慶市市級重點實驗室，重慶 榮昌 402460）

摘要：目的：運用改良電融合法提高雜交瘤的融合效率，以獲得更多的雜交瘤克隆。方法：將SP2/0細胞和脾細胞分別用NHS_d_PEG24_biotin孵育30min，再將脾細胞用avidin孵育30min，然后將SP2/0細胞和脾細胞按1：5混合孵育15min后進行電融合，融合后的細胞用半固體培養(yǎng)基篩選單克隆。結果顯示：用2×105個SP2/0細胞和1×106個脾細胞進行正常電融合，經(jīng)半固體培養(yǎng)基篩選共獲得6個單克隆，而用改良電融合法獲得了20個單克隆。結論：利用改良電融合法能夠增加異種細胞相互配對的幾率，從而提高雜交瘤的融合效率，最終獲得更多的雜交瘤細胞。

關鍵詞：電融合；半固體培養(yǎng)基；雜交瘤

細胞融合產(chǎn)生雜交瘤細胞在生物技術和生物醫(yī)藥中扮演著重要的角色，并且已經(jīng)廣泛用于各個領域，其中最成功的就是利用雜交瘤生產(chǎn)單克隆抗體。近年來，融合技術的最新應用是將樹突狀細胞（DCs）與腫瘤細胞融合用于癌癥的免疫治療［1_2］。目前細胞融合主要有三種方法：病毒誘導細胞融合、聚乙二醇（PEG）誘導細胞融合和電脈沖誘導細胞融合。雖然病毒誘導的細胞融合通常能夠得到較高的融合率，但由于病毒不穩(wěn)定，容易污染雜交瘤細胞，因而在治療應用中受到了很大限制。PEG誘導細胞融合由于操作過程簡單而被廣泛應用，但該方法通常生產(chǎn)雜交瘤細胞較少，甚至還有化學結合。近年來，細胞電融合也被廣泛使用，主要原因是電融合法克服了以上兩種方法的缺點，采用物理方法的電融合，避免了病毒和化學試劑的污染，但電融合法生產(chǎn)雜交瘤的效率仍然較低，其原因在于兩種細胞在融合前的排序是隨機結合，尤其是當兩種細胞大小有較大差異時，排序電壓更容易讓大細胞與大細胞接觸，而需要融合的兩種細胞接觸機會減少，導致融合效率降低［3_5］。因此，本試驗利用生物素_鏈霉親和素能特異性、高親和性結合的原理，將SP2/0細胞和脾細胞分別包裹NHS_dPEG24_biotin（biotin），再將脾細胞包裹avidin，然后將SP2/0細胞和脾細胞按比例混合孵育，使兩種細胞相互配對，增加接觸機會，經(jīng)電融合后用半固體培養(yǎng)基篩選克隆。希望通過改良后的電融合法能夠增加兩種細胞配對的幾率，提高融合效率，最終獲得更多的雜交瘤克隆。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑SP2/0細胞由重慶市畜牧科學院畜牧工程研究所提供，OVA（A7641，Sigma）、CpG（tlrl_1826，InvivoGen）、FBS（10091_148，Gibco）、RPMI1640基礎培養(yǎng)基（A10491_01，Gibco）、50×HT Media Supplement （H0137，Sigma）、Anti_Mouse IgG_Peroxidase antibody produced in goat（A4416，Sigma）、半固體培養(yǎng)基（03804，Stemcell）、NHS_dPEG24_biotin（10774，Quanta Bio Design）、Avidin（H0137，Sigma），常規(guī)試劑如無注明均購自Sigma公司。

1.1.2儀器多功能電融合儀（4308，Eppendorf），倒置顯微鏡（Eclipse_Ti，Nikon），CO2培養(yǎng)箱（371，Thermo），微孔板分光光度計（Epoch，BioTek），低速醫(yī)用離心機（400C，北京白洋）。

1.1.3試驗動物試驗用6～8周齡BALB/c小鼠由重慶市畜牧科學院實驗動物中心提供。

1.2方法

1.2.1溶液配制等滲融合液：280mM葡萄糖、0.1mM （CH3COO）2Ca·H2O、0.5mM（CH3COO）2Mg·4H2O、0.1% BSA；低滲融合液：90mM葡萄糖、0.1mM（CH3COO）2Ca· H2O、0.5mM（CH3COO）2Mg·4H2O、0.1%BSA；RPMI1640完全培養(yǎng)基：10%FBS、1%青_鏈霉素、1%丙酮酸鈉、1%L_谷氨酰胺、87%RPMI1640基礎培養(yǎng)基。

1.2.2小鼠免疫及抗體效價檢測按照常規(guī)免疫小鼠的方法［6］，對小鼠進行3次免疫，經(jīng)ELISA檢測效價合格后用于后續(xù)融合實驗，具體免疫方案如下：首免用DPBS稀釋OVA抗原，濃度為5 mg/mL；加入50μg CpG和等體積的2%氫氧化鋁，混合均勻后再加入等體積的弗氏完全佐劑（CFA），渦旋使之乳化，按200μL/只劑量進行皮下分點注射；首免第14d后進行二免，OVA抗原濃度為2.5 mg/mL，加入25 μg CpG和等體積的2%氫氧化鋁，混合均勻后再加入等體積的弗氏不完全佐劑（IFA），渦旋使之乳化，以200μL/只腹腔分點注射；二免第14d后進行三免，OVA抗原濃度為1.25mg/mL，加入12.5μg CpG和等體積的2%氫氧化鋁，混合均勻后以200μL/只腹腔分點注射。第三次免疫3d后眼眶采血，分離血清用間接ELISA法檢測血清效價，用OVA（10 μg/mL）包被，將抗血清進行10、100、1000倍稀釋，用間接法檢測抗體。可作為后續(xù)雜交瘤融合試驗小鼠的判定標準為：稀釋1000倍后的樣品OD450/（陰性對照OD450_空白OD450）≥2。

1.2.3正常電融合法篩選雜交瘤使用頸椎脫臼法處死小鼠，用75%酒精浸泡5 min，取出脾臟分離脾臟淋巴細胞，并用血球計數(shù)板計數(shù)。取適量脾細胞與SP2/0細胞按1：5混合均勻，用10mL RPMI1640基礎培養(yǎng)基洗滌細胞，1200r/min離心3min，棄上清；將等滲融合液與低滲融合液按1：1混合均勻，洗滌細胞2次，每次10mL，1200r/min離心3min，棄上清；將細胞用200μL融合液重懸，加入到融合槽內(nèi)，設定融合參數(shù)，按下Start鍵，進行細胞融合，融合后放置30 min；將融合細胞用RPMI1640完全培養(yǎng)基洗滌2次，1200r/min離心3min，加入3mL RPMI培養(yǎng)基重懸細胞并加入6孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。將融合細胞以1200r/min離心5min，棄上清，用RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸融合細胞，與半固體培養(yǎng)基按1：10混合均勻，加入6孔板中（2mL/孔），使培養(yǎng)基平鋪于平板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)10～14 d；用10 μL槍頭在顯微鏡下挑取單個克隆，加入到200μL含HT的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，每隔一天換液培養(yǎng)。待克隆長到80%左右吸出150μL上清，然后用間接ELISA法檢測抗體效價（參照1.2.2 ELISA檢測步驟）。

1.2.4改良電融合法篩選雜交瘤取適量SP2/0細胞和脾細胞，分別加入10mL DPBS，混勻，加入NHS_ dPEG24_biotin（以下簡稱 biotin）50 μg，4℃孵育30min，1200r/min離心3min，棄上清；細胞用10mL DPBS洗滌2次，再用2mL DPBS重懸細胞，備用。加入200 μg avidin于脾細胞重懸液里，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，混勻，4℃放置30min，1200r/min離心3min，棄上清；將SP2/0細胞與脾細胞按1：5輕輕混合均勻，室溫放置30min，按照1.2.3的電融合步驟進行融合及篩選。

2　結果

2.1脾細胞和SP2/0細胞相互配對用SP2/0細胞孵育biotin，脾細胞先后孵育biotin和avidin，然后將SP2/0細胞與脾細胞按1：5混合孵育。從圖1結果得知，脾細胞和SP2/0細胞配對情況良好，由于兩種細胞大小差異較大，還會出現(xiàn)一個SP2/0細胞配對多個脾細胞的情況。

2.2正常電融合法與改良電融合法的融合效率比較通過半固體培養(yǎng)基的篩選培養(yǎng)，用正常電融合法制備的雜交瘤細胞共獲得了6個克隆，經(jīng)ELISA鑒定能夠表達特異性抗體的克隆有2個；而用改良電融合法制備的雜交瘤細胞共獲得了20個克隆，經(jīng)ELISA鑒定能夠表達特異性抗體的克隆有12個。因此，改良電融合法比正常電融合法的融合效率高，獲得了更多表達特異性抗體的雜交瘤克隆。圖2表示電融合法的融合過程。

圖1　SP2/0細胞和脾細胞配對（200×）

圖2　SP2/0細胞和脾細胞的電融合（200×）

3　討論

生物素_親合素系統(tǒng)（Biotin_Avidin_System，BAS）是20世紀70年代末發(fā)展起來的一種新型生物反應放大系統(tǒng)。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應用于醫(yī)學各領域。本試驗基于BAS系統(tǒng)的研究基礎，在電融合前采用biotin、avidin分別包裹脾細胞和SP2/0細胞，然后對兩種細胞進行相互配對。結果表明，脾細胞和SP2/0細胞經(jīng)過biotin、avidin處理后，增加了兩種細胞的接觸機會，減少了相同細胞融合的幾率。因此，用改良電融合法制備雜交瘤的數(shù)量明顯高于正常電融合法，大大提高了融合效率。

雖然biotin、avidin的使用能夠增加異種細胞的相互配對幾率，提高融合效率，但從試驗過程中得知，biotin、avidin對細胞仍然有一定毒性，造成細胞狀態(tài)較差，最終導致融合效率提高不明顯或者降低。因此，對于biotin、avidin的最佳使用濃度、結合時間等重要指標還有待進一步研究。總的來說，與正常電融合法相比，使用改良電融合法制備雜交瘤細胞能夠明顯提升融合效率，獲得更多有效的雜交瘤克隆?！?/p>

參考文獻：

［1］ Kanduser M，Usaj M.Cell electrofusion:past and future perspectives for antibody production and can_ cer cell vaccines［J］.Expert Opinion on Drug Deliv_ ery，2014，11（12）：1885_1898.

［2］Usaj M，F(xiàn)lisar K，Miklavcic D，et al.Electrofusion of B16_F1 and CHO cells：the comparison of the pulse first and contact firstprotocols［J］.Bioelectro_ chemistry，2013，89：34_41.

［3］TomitaM，Tsumoto K.Hybridoma technologies for antibodyproduction［J］.Immunotherapy，2011，3（3）：371_380.

［4］Yu X，Mcgraw P A，House F S，et al.An optimized electrofusion_based protocol for generating virus_spe_ cific human monoclonal antibodies［J］.Journal of Im_ munological Methods，2008，336（2）：142_151.

［5］Li J，Yu X，Wagner T E，et al.A biotin_streptavidin _biotin bridge dramatically enhances cell fusion［J］. Oncology Letters，2014，8（1）：198_202.

［6］ Lee E C，Liang Q，Ali H，et al.Complete hu_ manization of the mouse immunoglobulin loci enables efficient therapeutic antibodydiscovery［J］.Nature Biotechnology，2014，32（4）：356_363.

中圖分類號：S818.9

文獻標識碼：B

文章編號：1001_8964（2016）07_0026_03

收稿日期：2016_04_26

基金項目：重慶市基本科研業(yè)務費項目 （2015cstc_jbky_00120，2014cstc_jbky_00111）；國家國際科技合作專項（2013DFA31820）；863項目（2014AA021602）；重慶市國際合作項目（CSTC2013gjhz80002）；重慶市基礎與前沿研究重大項目（cstc2013jcyjC80001）；重慶市農(nóng)發(fā)資金項目（12402）。

作者簡介：吳夢（1987_），男，重慶人，碩士，主要從事抗體工程研究。

*通訊作者：葛良鵬，副研究員，E_mail:geliangpeng1982@163.com

The Study of Modified Electrofusion Method to Prepare Hybridoma Cell

WU Meng1，2，LIU Zuohua1，2，3，LUO Lin1，et al.
（1.Chongqing Academy of Animal Sciences，Chongqing Rongchang 402460；2.Key Laboratory of Pig Industry Sciences of Agriculture Ministry，Chongqing Rongchang 402460；3.Key Laboratory of Pig Industry Sciences of Chongqing City，Chongqing Rongchang 402460，China）

Abstract：By using the method of modified electrofusion to improve the hybridoma fusion efficiency and obtain more hybridoma clones.SP2/0 cells and spleen cells were incubated with NHS_d_PEG24_biotin for 30min，then spleen cells were incubated with avidin for 30min respectively，and the SP2/0 cells and spleen cells were incubatedby ration of 1：5 in 15 min，the fused cells used semi_solid medium for screening monoclonal.Using 2×105SP2/0 cells and 1×106spleen cells for normal electrofusion，the semi_solid medium screening obtained a total of 6 monoclonals，while modified electrofusion obtained 20 clones.The result showed that modified electrofusion could obviously increase the matching probability of heterogeneous cells，so as to improve the efficiency of hybridoma fusion and obtain more hybridoma cells.

Key words：Electrofusion；Semi_solid medium；Hybridoma