單增李斯特菌單克隆抗體的研制及特性分析

齊穎穎，　吳　萌，　王怡雯，　劉　慧，　謝遠(yuǎn)紅，　張紅星*（.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京006；.河北省生物研究所，河北石家莊05008）

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單增李斯特菌單克隆抗體的研制及特性分析

齊穎穎1，吳萌2，王怡雯1，劉慧1，謝遠(yuǎn)紅1，張紅星*1
（1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京102206；2.河北省生物研究所，河北石家莊050081）

摘要：運(yùn)用輻照法和熱滅菌法自制單增李斯特菌的免疫原、檢測(cè)原，運(yùn)用尾靜脈免疫方法免疫BALB/c小鼠，運(yùn)用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，制備得到抗單增李斯特菌的單克隆抗體，并對(duì)其進(jìn)行免疫學(xué)特性分析。結(jié)果表明，成功篩選4株能穩(wěn)定分泌抗單增李斯特菌的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，腹水抗體效價(jià)為1∶102 400～1∶409 600，免疫球蛋白亞型為IgG1、Ig2a、Ig2b，親和力常數(shù)在1×107～1×1010L/mol；經(jīng)測(cè)定分析出最佳配對(duì)抗體；并與綿羊李斯特菌、英諾克李斯特菌及大腸桿菌、沙門氏菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等菌屬無(wú)明顯交叉反應(yīng)；進(jìn)行雙抗體夾心ELISA方法對(duì)模擬單增李斯特菌污染肉樣檢測(cè)其靈敏度達(dá)1×103CFU/mL。獲得高效價(jià)、特異性強(qiáng)、靈敏度高的單克隆抗體，為食品中致病菌單增李斯特菌殘留的免疫學(xué)檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)卧隼钏固鼐?；雜交瘤；單克隆抗體

民以食為天，食品安全關(guān)系到人類的生存和健康。隨著經(jīng)濟(jì)全球化和食品貿(mào)易的日益擴(kuò)大，危及人類健康、生命安全的重大食品安全事件屢屢發(fā)生，我國(guó)食品安全問(wèn)題成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。危害食品安全物質(zhì)[1]包括環(huán)境污染、化學(xué)性危害（抗生素、激素等）、微生物危害（生物毒素、致病菌等）。其中致病菌近幾年來(lái)給食品安全帶來(lái)很大的威脅，主要的致病菌包括沙門氏菌、志賀氏菌、單增李斯特菌等等。

單核細(xì)胞增生李斯特菌[2]（Listeria monocytogenes，LM）簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，為革蘭氏陽(yáng)性菌，需氧或兼性厭氧。LM是李斯特菌屬中最重要的人畜共患的食源性致病菌，被列為居沙門氏菌之后第二位主要的食源性致死病菌。單增李斯特菌中毒嚴(yán)重的可以引起血液和腦組織感染，被LM感染后死亡率可達(dá)30%，新生嬰幼兒和免疫力低下的人群中死亡率高達(dá)70%，常見病癥包括腦膜炎、腦脊髓炎以及孕婦流產(chǎn)等[3]。單增李斯特菌在2～42℃下生存，能在冰箱內(nèi)生存較長(zhǎng)時(shí)間，生存環(huán)境可塑性大，其在酸性、堿性條件下和高鹽濃度時(shí)也能存活并生長(zhǎng)，適應(yīng)范圍很大，帶菌較高的食品有乳制品、肉類等。單增李斯特菌不易被凍融，能耐受較高的滲透壓，在土壤、地表水、污水、廢水、植物中均有該菌存在，所以動(dòng)物很容易食入該菌，30%以上的肉制品均被該菌污染，約占85%-90%的病例是由于被該菌污染而引起[4]。

目前檢測(cè)單增李斯特菌有傳統(tǒng)分離鑒定方法、分子生物檢測(cè)法、免疫法[5]。其中傳統(tǒng)的分離鑒定方法操作過(guò)程耗費(fèi)大量的時(shí)間和勞動(dòng)力，分子檢測(cè)法的程序復(fù)雜、檢測(cè)儀器昂貴、檢測(cè)費(fèi)用高。而免疫法應(yīng)用抗原抗體的特異性識(shí)別作用，再通過(guò)酶催化底物的顯色反應(yīng)，將結(jié)果顯示出來(lái)，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適于大批量快速檢測(cè)的需要，成為目前致病菌檢測(cè)的主流技術(shù)，而基于該技術(shù)的快速檢測(cè)產(chǎn)品占有絕大部分市場(chǎng)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠：由北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要試劑和儀器

單增李斯特菌Listeria monocytogenes ATCC 54003、Listeria monocytogenes ATCC 54001，綿羊李斯特菌Listeria iuanuii ATCC 19119，英諾克李斯特菌Listeria innocua ATCC 33091，大腸桿菌E. coli O157 CMCC 44828，沙門氏菌Salmonella typhimurium ATCC13311，枯草桿菌Bacillus subtilis BD366，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus CMCC26003及鏈球菌Streptococcus thermophilus G1等標(biāo)準(zhǔn)株：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

小鼠SP2/0骨髓瘤細(xì)胞、單增李斯特菌免疫原和檢測(cè)原：北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院保存和制備。

李斯特菌培養(yǎng)基（國(guó)標(biāo)GB 4789. 30-2010）：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基、PEG4000、完全佐劑和不完全佐劑以及小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒：Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)板：GIBCO公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG：北京華美生科生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為分析純。

1.3動(dòng)物免疫

選取8只6周雌性BALB /c小鼠，初次基礎(chǔ)免疫采用尾靜脈注射[6]30 μg自制免疫原；二次基礎(chǔ)免疫采用尾靜脈20 μg自制免疫原。免疫間隔為2周。內(nèi)眥取血并分離血清，間接ELISA檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。選取最佳免疫小鼠，于融合前3天脾臟免疫注射免疫原20 μg加強(qiáng)免疫。

1.4雜交瘤細(xì)胞株的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞，按常規(guī)方法50% PEG進(jìn)行細(xì)胞融合。檢測(cè)培養(yǎng)上清液抗體效價(jià)，選擇強(qiáng)陽(yáng)性的細(xì)胞，從而進(jìn)行數(shù)次有限稀釋亞克隆篩選培養(yǎng)，直至100%陽(yáng)性。制備出穩(wěn)定的分泌高特異性、高效價(jià)、高親和力抗體的雜交瘤細(xì)胞株，置于液氮中[7]。

1.5單克隆抗體的制備及抗體的特性分析

將抗單增李斯特菌雜交瘤細(xì)胞克隆及擴(kuò)大培養(yǎng)接種于提前石蠟油致敏的雌性BALB/c小鼠腹腔[8]，誘生腹水產(chǎn)生抗單增李斯特菌單克隆抗體。7～10 d后收集3～9 mL腹水進(jìn)行抗體的ProteinG純化[9]，采用SDS-PAGE法檢測(cè)抗體純度[10]，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析[11]；采用紫外吸收法測(cè)定抗體濃度。

采用間接ELISA法進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定；采用sigma公司抗體亞型檢測(cè)試劑盒鑒定抗體亞型。采用非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫試驗(yàn)對(duì)單克隆抗體的親和力常數(shù)進(jìn)行測(cè)定，采用高碘酸鈉的方法進(jìn)行抗體標(biāo)酶。

1.6 ELISA相加試驗(yàn)及最佳配對(duì)

以單增李斯特菌自制檢測(cè)原包被酶標(biāo)板，分別加入一株McAb腹水溫育后，再加入另一株McAbs腹水，溫育后加入酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體，以四甲基聯(lián)苯胺（TMB）為底物顯色，終止反應(yīng)后測(cè)得OD值。McAbs最佳配對(duì)的選擇，按方陣交叉匹配法進(jìn)行。分別以各種McAbs包被酶標(biāo)板，以單增李斯特菌為中心抗原，和每種HRP標(biāo)記的McAb逐一進(jìn)行交叉匹配試驗(yàn)[12]。

1.7抗體特異性[13]與敏感性檢測(cè)

用0.01 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液將單克隆抗體稀釋至5 μg/mL包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜；用PBS/T20洗板3次，每次3 min；用含10 %小牛血清的PBS/T20封閉，37℃孵育1 h，洗板；模擬污染肉樣37℃孵育45 min，洗板；加入另一單克隆抗體HRP酶標(biāo)抗體37℃孵育30 min，洗板；加入TMB顯色液，37℃避光反應(yīng)15 min后加入終止液；讀取波長(zhǎng)450 nm的OD值[14]。

2　結(jié)果與分析

2.1抗單增李斯特菌雜交瘤細(xì)胞株的建立

進(jìn)行細(xì)胞融合，每次用6塊96孔板，平均每孔有1～2株融合細(xì)胞生長(zhǎng)，融合率為100 %。經(jīng)過(guò)對(duì)陽(yáng)性孔數(shù)次亞克隆，共獲得4株穩(wěn)定分泌抗單增李斯特菌的雜交瘤細(xì)胞株。分別命名為：1B10、3A12、4G11、5F6。

2.2抗體的制備及純化

將得到的4株雜交瘤細(xì)胞分別注射到成年BALB/c小鼠腹腔內(nèi)誘發(fā)腹水，每只獲取3～9 mL腹水。經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，4株腹水效價(jià)均在100 000以上。經(jīng)蛋白質(zhì)純化，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為18.8～35.4 mg/mL，凝膠成像分析純度達(dá)88%～95%見表1。用Sigma公司的抗體亞型試劑盒鑒定，結(jié)果1B10為IgG2a，4G11為IgG2b，3A12和5F6為IgG1，見圖1。

表1　LM mAb的效價(jià)及純化后純度和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度Table 1　 Ascites titer and purity and purified protein content of anti-LM mAB

圖1　單克隆抗體亞型鑒定Fig. 1 Assay of monoclonal antibody subtype

2.3單克隆抗體識(shí)別抗原表位特性分析

為了測(cè)定單抗識(shí)別抗原表位的特性，先以棋盤法測(cè)定酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG的飽和度，并測(cè)定抗原與McAbs的飽和濃度。在本試驗(yàn)系統(tǒng)中，酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為1∶5 000倍稀釋，各株單抗腹水根據(jù)所測(cè)飽和濃度分別作1∶500～1∶2 000倍稀釋。結(jié)果以相加指數(shù)AI（addictivity index）大小來(lái)判定。

其中A1、A2分別是單獨(dú)使用一株McAb所測(cè)定的OD值，A1+2為兩株McAb所測(cè)定的OD值。若兩株McAbs識(shí)別抗原的同一表位，A1+2應(yīng)等于A1和A2的均值，AI應(yīng)為零；若兩株McAb識(shí)別不同的表位，A1+2應(yīng)等于A1和A2的總和，AI則等于100%。在實(shí)際測(cè)定中，一般以AI值小于50%判定為識(shí)別相同的表位，以AI值大于50%判定為識(shí)別不同的表位。表2表明，只有1B10與4G11和3A12與5F6這兩對(duì)McAb互交相加后，AI值均小于50%（最高AI值只有15.29%），則兩對(duì)抗體所結(jié)合的表位是相同或距離很近，沒(méi)有互補(bǔ)或相加的特性。而其余兩對(duì)McAb互交相加后，計(jì)算得出的AI值大于50%（最高AI值為95.12%），具有相加性，它們識(shí)別抗原上不同的表位且表位的距離很遠(yuǎn)，即認(rèn)為是識(shí)別抗原上不同構(gòu)象表位的。

2.4最佳配對(duì)的選擇及抗體靈敏度檢測(cè)

據(jù)相加試驗(yàn)的結(jié)果，判定1B10與3A12，1B10 與5F6，4G11與3A12，4G11與5F5互為配對(duì)抗體。并將4株抗體分別標(biāo)HRP酶為1B10-HRP，3A12-HRP，4G11-HRP和5F5-HRP。進(jìn)行棋盤篩選試驗(yàn)，取每一株抗體分別包被酶標(biāo)板，與不同濃度模擬污染LM肉樣（107，106，105，104，103，100，50，10 CFU/ mg）反應(yīng)后，加入各自其配對(duì)細(xì)胞株的標(biāo)酶（HRP）抗體，其標(biāo)酶抗體的初始質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL，按2n（n=0，1，2…）倍比稀釋加入，運(yùn)用雙抗體夾心ELISA進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。經(jīng)試驗(yàn)證明1B10與3A12為最佳配對(duì)抗體，檢測(cè)LM的靈敏度是最高的，當(dāng)1B10作為包被抗體，3A12作為酶標(biāo)抗體其質(zhì)量濃度為0.625 μg/mL時(shí)檢測(cè)LM的靈敏度可達(dá)100 CFU/mg，見圖2。

表2　4株McAb腹水相加試驗(yàn)的OD值及AI值Table 2 Titer of the combined test value and AI by indirect ELISA

抗原分子上的表位是由線性的氨基酸殘基或者非連續(xù)序列折疊形成的緊密的三維結(jié)構(gòu)，它們?cè)诳乖谋砻媸蔷植勘砻娼Y(jié)構(gòu)，1B10能與3A12-HRP配對(duì)檢測(cè)到LM，表明該抗原分子表面這兩個(gè)表位之間的距離較遠(yuǎn)。采用兩株單抗夾心ELISA完成對(duì)LM的檢測(cè)，這樣既提高檢測(cè)靈敏度又能增強(qiáng)特異性，這是因?yàn)閱慰故怯蓡蝹€(gè)雜交瘤克隆分泌的抗體組成的，具有均質(zhì)性和很高的親和力，并且在抗原檢測(cè)上具有高度一致的特性。

圖2　1B10和3A12配對(duì)結(jié)果Fig. 2 Result of antibody pairs for ELISA

2.5雙抗夾心ELISA檢測(cè)特異性

以最佳配對(duì)的抗體以及最佳濃度來(lái)進(jìn)行雙抗體夾心ELISA檢測(cè)特異性，其分別與兩株單增李斯特菌和綿羊李斯特菌、英諾克李斯特菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌等菌株進(jìn)行特異性檢測(cè)，見圖3。結(jié)果表明，兩個(gè)單克隆抗體夾心檢測(cè)的特異性很好，與兩株單增李斯特菌有明顯反應(yīng)，但與綿羊李斯特菌、英諾克李斯特菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌和空白對(duì)照沒(méi)有明顯交叉反應(yīng)。

圖3　雙抗體夾心ELISA特異性測(cè)定Fig. 3 Assay of specificity by sandwich ELISA

2.6親和力測(cè)定

對(duì)4株單克隆抗體進(jìn)行了親和力測(cè)定，結(jié)果見圖4。4株抗體的親和力為1×107～1×1010L/mol，其中，1B10的親和力是1×1010L/mol，3A12的親和力是1×1010L/mol。

圖4　親和力測(cè)定Fig. 4 Association constant（Kaffi）curve of LM mAb

3　結(jié)語(yǔ)

作者制備和選定的1B10和3A12兩株單克隆抗體效價(jià)高，抗單增李斯特菌特異性強(qiáng)，通過(guò)雙抗體夾心ELISA法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單增李斯特菌的免疫學(xué)檢測(cè)。這種檢測(cè)方法具有過(guò)程簡(jiǎn)單、靈敏度高和分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，可作為對(duì)大量樣品的快速初篩選分析，再將疑似陽(yáng)性樣品使用確證分析法進(jìn)行確證，這樣可以降低大批量樣品的成本并提高分析效率。

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Preparation and Characterization of Monoclonal Antibodies Against Listeria monocytogenes

QI Yingying1，WU Meng2，WANG Yiwen1，LIU Hui1，XIE Yuanhong1，ZHANG Hongxing*1
（1. Faculty of Food Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；2. Biology Institute of Hebei Academy of Sciences，Shijiazhuang 050081，China）

Abstract：In order to explore the specific monoclonal antibodies against Listeria monocytogenes for the immunological detection，irradiation life-style and thermal extinguishing method were used to produce Listeria nonocytogenes antibodies as the antigen，four hybridomas stably secreting McAbs to Listeria monocytogenes were developed. The results showed that fourhybridomas were successfully established，and the indirect ELISA titers of the ascites were 1：104～1：4×104. Their immune globulin subtypes were IgG1，Ig2a，Ig2b.Therefore，Listeria monocytogenes could be detected by a two-antibody-sandwich enzyme-linked immunosorbent assay（das-ELISA）formed by McAbs. The affinity constants（Kaffi）were from 1×107L/mol to 1×1010L/mol，which had no cross-reaction between the other compounds. The sensitivity of LM McAbs in the detection of antigen was as low as 1×103CFU/mL. The high-titer，sensitive and specific anti-LM monoclonal antibodies were produced in thisstudy，whichmakesitpossibletodevelopimmunoassayfordetectionofLMresidues．

Keywords：Listeria monocytogenes，hybridomas，monoclonal antibody

*通信作者：張紅星（1970—），男，黑龍江哈爾濱人，工學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事食品安全檢測(cè)方面的研究。E-mail：hxzhang511@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家863科技計(jì)劃項(xiàng)目（SS2012AA101606-5；2012BAD28B02-01）；北京市長(zhǎng)城學(xué)者培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（CIT&TCD20140315）。

收稿日期：2014-07-04

中圖分類號(hào)：F 407.82

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）02—0151—05