細(xì)胞表面熒光免疫吸附法在豬流行性腹瀉病毒N 蛋白單克隆抗體雜交瘤篩選中的應(yīng)用

羅素賢，陳 君，郭楠楠，宋德平，吳 瓊，丁 珍，黃冬艷，甘 平，葉 昱*，唐玉新*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物與科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西省畜禽疫病診斷與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；3. 江西省動物疫病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330006）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）屬于冠狀病毒科，α冠狀病毒屬的成員，是一種單股正鏈RNA病毒，基因組全長約為28 kb，分別由5'非編碼區(qū)（Untranslated region，UTR）、開放閱讀框1a和1b（ORF1a/1b）、纖突（Spike，S）、ORF3、囊膜蛋白（Envelope，E）、膜蛋白（Membrane，M）、核衣殼（Nucleocapsid，N）和3'UTR 組成[1]，該病毒感染哺乳仔豬后可引起其大量死亡，尤其以7 日齡以下的新生仔豬最易感，造成水樣腹瀉和脫水，死亡率高達(dá)80%～100%[2]。PEDV N 蛋白在病毒RNA 合成中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)病毒轉(zhuǎn)錄和組裝。該蛋白相對保守，是病毒自身的優(yōu)勢抗原，常作為感染早期精準(zhǔn)診斷的最佳靶標(biāo)。因此，快速制備針對N 蛋白的單克隆抗體（Monoclonal antibody，MAb），對PEDV 感染的及早確診與疾病預(yù)警具有重大意義，有助于在疾病暴發(fā)前期開展干預(yù)和防控[3]。

雜交瘤細(xì)胞的篩選技術(shù)是制備良好MAb 的關(guān)鍵。因此，國內(nèi)外研究人員對MAb 的制備技術(shù)和工藝不斷地完善和發(fā)展[4-5]。任瑞敏等采用半固體培養(yǎng)基，高通量篩選分泌目的MAb 的雜交瘤細(xì)胞，極大縮短其篩選的時(shí)間，但該方法存在無差別性選擇，后續(xù)MAb 驗(yàn)證的工作量大[6]。Dippong 等通過流式細(xì)胞分選技術(shù)，挑取單個(gè)抗原特異性標(biāo)記的雜交瘤細(xì)胞，提高了陽性克隆的篩選效率，但最終MAb 效價(jià)的評估還需借助ELISA 等方法完成[7]。近日Li 等開發(fā)了細(xì)胞表面熒光免疫吸附技術(shù)（Cell surface-fluorescence immunosorbent assay，CSFIA），分泌的MAb特異性結(jié)合錨定于雜交瘤細(xì)胞表面的抗原，半固體培養(yǎng)基內(nèi)的熒光標(biāo)記二抗識別MAb 與抗原的復(fù)合物，直接通過觀察熒光信號，快速鑒定陽性雜交瘤細(xì)胞株[8]。為縮短制備MAb 時(shí)間，獲得高效價(jià)的針對PEDV N 蛋白的MAb，本研究構(gòu)建了PEDV N 蛋白原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后純化蛋白，以常規(guī)方式免疫BALB/c 小鼠，通過CSFIA 對融合的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行一次篩選，并且與傳統(tǒng)ELISA 方法比較，為將來應(yīng)對突發(fā)疾病，快速篩選高活性雜交瘤細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒及實(shí)驗(yàn)動物 Vero 81 細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 由本實(shí)驗(yàn)室保存；PEDV（CH/JX/01 株）由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；SPF級6周齡～8周齡BALB/c雌鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.2 主要試劑 大腸桿菌TOP10、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞和TMB 單組分顯色液購自北京天根生化科技有限公司；核酸提取試劑盒RNAiso Plus、MMLV Reverse Transcriptase 和pCold I 表達(dá)載體均購自大連寶生物工程有限公司；Gel Extraction Kit 購自O(shè)MEGA公司；IPTG 購自生工生物工程（上海）股份有限公司；鎳離子金屬鰲合層析介質(zhì)（Ni-NTA）重力預(yù)裝柱購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；極超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；HAT/HT 培養(yǎng)基、PEG1450（50%）、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均購自Sigma 公司；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Thermo Fisher 公司。偶聯(lián)劑Oleyl-PEG4000-NHS、FITC 標(biāo)記羊抗鼠IgG 和半固體培養(yǎng)基均為暨南大學(xué)唐勇教授惠贈。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 中PEDV CH/JX/01 株基因序列（KX058032.1）設(shè)計(jì)針對N 基因的特異性引物，N-F：5'-GGGGTACCATGGCTTCTGTCA GTTTTCAGG-3'（下劃線為KpnⅠ酶切位點(diǎn)）/N-R：5'-CGGGATCCTTAATTTCCTGTATCGAAGATCTCG-3'（下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），預(yù)期擴(kuò)增目的片段為1 326 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 PEDV N 蛋白的克隆、表達(dá)及純化 利用TRIzol 法提取PEDV 基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用設(shè)計(jì)的引物N-F/N-R，擴(kuò)增其N 基因，PCR 產(chǎn)物經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段。使用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BamHⅠ對純化的目的產(chǎn)物與載體pCold I 分別雙酶切，回收酶切產(chǎn)物后構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCold I-N，并由上海生工生物工程有限公司測序鑒定。測序正確的重組質(zhì)粒pCold I-N 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG 在16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)24 h，超聲破碎菌液后SDSPAGE 檢測重組蛋白的表達(dá)。參照鎳離子金屬鰲合層析介質(zhì)（Ni-NTA）重力預(yù)裝柱說明，將重組蛋白加入鎳柱，依次用20 mmol/L、50 mmol/L 和300 mmol/L咪唑緩沖液處理，分管收集洗脫液，通過SDSPAGE 檢測純化效果。

1.5 抗PEDV N 蛋白MAb 的制備

1.5.1 動物免疫和細(xì)胞融合 取純化的PEDV N 重組蛋白與等量弗氏完全佐劑乳化后，分點(diǎn)注射于6周齡～8 周齡BALB/c 雌鼠背部皮內(nèi)，200 μg/只；間隔兩周后將PEDV N 重組蛋白與等量弗氏不完全佐劑乳化后注射于小鼠背部皮下，100 μg/只，兩周后加強(qiáng)免疫一次。用倍比稀釋（1∶100～1∶409 600）的小鼠血清作為一抗，1∶2 000 稀釋的羊抗鼠HRP-IgG作為二抗進(jìn)行間接ELISA，測定3 免第7 d 小鼠血清，選擇對應(yīng)血清效價(jià)最高的小鼠，融合前3 d 經(jīng)腹腔接種不加佐劑的重組N 蛋白（100 μg）。隨后分離其脾細(xì)胞與對數(shù)生長期SP2/0 細(xì)胞以1∶10 比例混合，加入PEG1450（50%）誘導(dǎo)融合。

1.5.2 CSFIA篩選分泌抗PEDV N蛋白MAb的雜交瘤細(xì)胞株 稀釋雜交瘤細(xì)胞至48 孔細(xì)胞板中培養(yǎng)4 d～6 d，即可開始篩選。將1 mg 偶聯(lián)劑Oleyl-PEG4000-NHS 與0.58 mg PEDV N 重組蛋白混合，冰浴攪拌3 h～6 h，確保偶聯(lián)劑與PEDV N 重組蛋白充分結(jié)合。使用10 k 規(guī)格超濾管超濾混合物，去除多余偶聯(lián)劑，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾除菌。取250 μL 濾過液和50 μL FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 加入不完全培養(yǎng)基中，完全混勻。將培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的48 孔細(xì)胞板的上清吸去，加入不完全培養(yǎng)基輕輕搖晃，吸凈上清，再重復(fù)上述步驟2 次，去除細(xì)胞板孔內(nèi)殘余的血清。將上述濾過液和FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 的混合液加入培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)板底部，置37 ℃5%CO2培養(yǎng)1 h。吸凈上清，加入150 μL 不完全培養(yǎng)基置于熒光顯微鏡下觀察，吸凈不完全培養(yǎng)基并加入200 μL 半固體培養(yǎng)基固定細(xì)胞，通過移液槍吸取陽性細(xì)胞團(tuán)塊加入至新細(xì)胞板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5.3 間接ELISA 法篩選分泌抗PEDV N 蛋白MAb的雜交瘤細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)10 d～12 d 即可開始檢測陽性孔。根據(jù)常規(guī)方法建立間接ELISA 法[9]：用5 μg/mL 純 化PEDV N 重 組 蛋 白 包 被ELISA 板，1∶400 稀釋陰、陽性血清作為陰、陽性對照，1∶2 000 稀釋的FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 為二抗，同時(shí)設(shè)不加血清的空白對照。利用該間接ELISA 法測定雜交瘤細(xì)胞上清液的OD450nm。采用有限稀釋法，挑選長勢較好、OD450nm值較高、細(xì)胞團(tuán)單一的雜交瘤細(xì)胞10 倍倍比稀釋（101～104），每個(gè)稀釋濃度的雜交瘤細(xì)胞鋪半塊96 孔板培養(yǎng)。按照上述步驟再連續(xù)進(jìn)行兩次亞克隆篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。

1.5.4 兩種方法篩選的MAb 的效價(jià)測定 選取10周齡左右的BALB/c 雌鼠將上述兩種方法篩選獲得的單克隆細(xì)胞株以相同的細(xì)胞數(shù)量通過常規(guī)方法制備腹水[10]。將雜交瘤細(xì)胞上清液與制備的小鼠腹水10倍倍比稀釋（102～109），同時(shí)以陰性血清作為陰性對照，采用1.5.3 建立的間接ELISA 法測定兩種方法篩選的MAb 上清液與小鼠腹水效價(jià)。

1.6 兩種方法篩選的MAb 的反應(yīng)原性檢測 將PEDV 感染Vero 81 細(xì)胞后，收集上清，超速離心后獲得純化的PEDV。將純化的PEDV N 重組蛋白與PEDV 全病毒進(jìn)行SDS-PAGE 檢測，同時(shí)以空載體pCold I 和Vero 81 細(xì)胞為陰性對照，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂乳封閉2 h 后，分別以兩種方法篩選的MAb（1∶200）為一抗，HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG（1∶2 500）為二抗，檢測兩種方法篩選的MAb 的反應(yīng)原性。

2 結(jié) 果

2.1 PEDV N 蛋白的克隆、表達(dá)和純化 RT-PCR擴(kuò)增獲得PEDV N 基因片段，克隆于pCold I 中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold I-N，轉(zhuǎn)化至BL21/DE3，原核表達(dá)PEDV N 重組蛋白，SDS-PAGE 檢測結(jié)果顯示pCold IN/DE3 在58 ku 處有目的條帶，與預(yù)期大小相符（圖1），表明PEDV N重組蛋白正確表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA純化后獲得較高純度的重組蛋白。

2.2 CSFIA 篩選分泌抗PEDV N 蛋白的雜交瘤細(xì)胞株 偶聯(lián)劑Oleyl-PEG4000-NHS 和純化的PEDV N 重組蛋白結(jié)合，形成新偶聯(lián)產(chǎn)物Oleyl-PEG4000-NHSPEDV N，加入FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 和不完全培養(yǎng)基，完全混合后鋪滿接種了雜交瘤細(xì)胞的48 孔板中，孵育1 h 后置于熒光顯微鏡下觀察?；贑SFIA篩選的雜交瘤細(xì)胞分泌特異性抗體效價(jià)與熒光發(fā)光強(qiáng)度呈正相關(guān)的特點(diǎn)[11]，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，選取熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，細(xì)胞克隆單一，生長趨勢最好的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。采用半固體培養(yǎng)基固定雜交瘤細(xì)胞，挑選標(biāo)記好的陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。結(jié)果顯示陽性雜交瘤細(xì)胞發(fā)出明顯的綠色熒光信號（圖2），通過該方法獲得一株雜交瘤細(xì)胞，其分泌的MAb 命名為1B1，完成篩選和擴(kuò)大培養(yǎng)所需時(shí)間為15 d，無需常規(guī)亞克隆步驟。

圖1 PEDV N 重組蛋白的SDS-PAGE 檢測結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant PEDV N proteins

圖2 CSFIA 對雜交瘤細(xì)胞的篩選結(jié)果（200×）Fig.2 Result of cell surface-fluorescence immunosorbent assay（200×magnification）

2.3 間接ELISA 法篩選分泌抗PEDV N 蛋白的雜交瘤細(xì)胞株 采用常規(guī)間接ELISA 法連續(xù)3 輪亞克隆篩選，獲得一株長勢最好、效價(jià)最高且穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的MAb 命名為3D3，亞克隆篩選耗費(fèi)的時(shí)間為45 d。表明3 輪亞克隆篩選雖然能夠得到雜交瘤細(xì)胞株，但篩選過程繁瑣，耗時(shí)較長。

2.4 兩種篩選方法獲得的MAb 效價(jià)測定結(jié)果 將分泌MAb 1B1 和3D3 的雜交瘤細(xì)胞株分別注射入小鼠腹腔誘生腹水，采用間接ELISA 法檢測雜交瘤細(xì)胞株制備的腹水以及細(xì)胞上清中的MAb 效價(jià)。結(jié)果顯示分泌1B1 的細(xì)胞株產(chǎn)生的腹水效價(jià)大于106，細(xì)胞上清效價(jià)大于104；分泌3D3 細(xì)胞株產(chǎn)生的腹水效價(jià)大于105，細(xì)胞上清效價(jià)大于103（圖3），表明經(jīng)CSFIA 法篩選獲得的MAb 1B1 的效價(jià)比常規(guī)間接ELISA 篩選獲得的MAb 3D3 效價(jià)高，且高出10 倍。

圖3 分泌1B1（A）和3D3（B）的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生腹水和細(xì)胞上清中MAb 效價(jià)測定結(jié)果Fig.3 Antibody titers of the ascitic fluid and supernatant of hybridoma clones secreting 1B1(A)and 3D3(B)

2.5 兩種方法獲得的MAb 反應(yīng)原性的檢測結(jié)果通過western blot 對制備的MAb 進(jìn)行反應(yīng)原性檢測，結(jié)果顯示MAb 1B1 和3D3 與PEDV 全病毒以及PEDV N 重組蛋白均能反應(yīng)，與Vero 81 細(xì)胞和載體蛋白均不反應(yīng)（圖4），表明本研究中CSFIA 法和間接ELISA法篩選的雜交瘤細(xì)胞株分泌的MAb 1B1 和3D3 均具有良好的反應(yīng)原性。

圖4 兩種方法篩選獲得的MAb 反應(yīng)原性的western blot 檢測結(jié)果Fig.4 Reactivity analysis of the screened MAbs using two methods by western blot

3 討 論

ELISA 方法與有限稀釋法是迄今應(yīng)用最廣泛的雜交瘤細(xì)胞篩選方法[12]。其中，間接ELISA 用于陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選，有限稀釋法對獲得的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，至少需要連續(xù)進(jìn)行3 次上述過程才能獲得穩(wěn)定分泌MAb 的雜交瘤細(xì)胞株，操作步驟繁瑣費(fèi)時(shí)[13]。研究顯示，利用流式細(xì)胞儀分選技術(shù)能夠快速獲得目的雜交瘤細(xì)胞，標(biāo)記抗原與分泌于細(xì)胞表面的特異性抗體結(jié)合后，流式細(xì)胞儀分選攜帶標(biāo)記抗原的陽性雜交瘤細(xì)胞，可在短時(shí)間內(nèi)獲取分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞[14]。此方法具有快速、通量高的特點(diǎn)，但前期需優(yōu)化雜交瘤細(xì)胞分選條件，且所得細(xì)胞量較低，后續(xù)還要進(jìn)行測序和表達(dá)等工作[15]。此外，半固體培養(yǎng)基方法替代有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，雖省去稀釋等步驟，但其無法準(zhǔn)確挑出陽性單克隆細(xì)胞團(tuán)，工作量仍然很大[6]。

2004 年Kato 等發(fā)明了哺乳動物細(xì)胞膜錨定方法，可以將大分子蛋白質(zhì)非特異性錨定在細(xì)胞膜表面，即利用油烯基衍生物與聚乙二醇90（PEG90）制備Oleyl-PEG90 錨定子，油烯基對細(xì)胞膜表面脂質(zhì)具有親和性，PEG則能夠增加錨定子的親水性及偶合目的蛋白，從而將目的蛋白錨定于細(xì)胞膜表面[16]。在上述研究的基礎(chǔ)上，暨南大學(xué)唐勇團(tuán)隊(duì)研發(fā)了CSFIA技術(shù)，利用Oleyl-PEG4000 錨定子與抗原蛋白偶合后形成Oleyl-PEG4000-抗原，Oleyl 端非特異性親和于細(xì)胞表面，當(dāng)雜交瘤細(xì)胞分泌抗體時(shí)能夠被細(xì)胞表面抗原捕獲，而加入的熒光標(biāo)記二抗則結(jié)合被捕獲的抗體，最后通過半固體培養(yǎng)基固定并在熒光顯微鏡下挑取分泌特異性MAb 的雜交瘤細(xì)胞[8]。CSFIA法可以實(shí)現(xiàn)一步挑取目的細(xì)胞，基于熒光選擇分泌MAb 的雜交瘤單細(xì)胞株，具有直觀、簡單、快速、高效的優(yōu)點(diǎn)，無需流式細(xì)胞儀等昂貴的儀器輔助。

常規(guī)ELISA 檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清OD 值能夠反映抗體效價(jià)，但操作步驟較為繁瑣；并且強(qiáng)陽性雜交瘤可能在亞克隆過程中因細(xì)胞株間的相互競爭或有限稀釋而導(dǎo)致丟失[8]。而采用CSFIA 法時(shí)，Oleyl-PEG4000-抗原與細(xì)胞膜之間距離僅38 nm，雜交瘤細(xì)胞新分泌的MAb 能夠迅速被捕獲，而置于雜交瘤細(xì)胞表面；靈敏度高，單個(gè)細(xì)胞分泌抗體的檢測極限可達(dá)11.7 fg，可以在早期對雜交瘤株進(jìn)行鑒定，極大縮短培養(yǎng)時(shí)間[11]。而且，陽性細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度與抗體效價(jià)及特異性相關(guān)[11]，因此，在熒光顯微鏡下直接觀察并挑選出長勢最好、效價(jià)最高的雜交瘤細(xì)胞能夠作為制備MAb 雜交瘤細(xì)胞的候選株。但目前，CSFIA 法只能通過移液管獲得標(biāo)記目的細(xì)胞，尚未實(shí)現(xiàn)自動化操作，不利于MAb 高通量篩選[8]。

現(xiàn)階段，應(yīng)用CSFIA 法開展靶向動物病原MAb雜交瘤細(xì)胞株篩選的報(bào)道較少，本研究嘗試將該新方法用于PEDV N 蛋白MAb 制備，快速篩選陽性雜交瘤單細(xì)胞株。從結(jié)果來看，間接ELISA 方法連續(xù)3 輪篩選單個(gè)雜交瘤細(xì)胞株需要45 d，而使用CSFIA篩選過程僅需15 d；將CSFIA 篩選的分泌1B1 的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，與間接ELISA 法篩選的分泌3D3 細(xì)胞株同時(shí)以相同細(xì)胞數(shù)量接種于小鼠腹腔，比較腹水中抗體效價(jià)發(fā)現(xiàn)，1B1 的效價(jià)明顯高于3D3。因此，上述研究表明CSFIA 技術(shù)可以用于快速制備高效價(jià)MAb，尤其在高活性雜交瘤細(xì)胞篩選中的實(shí)用性優(yōu)勢更明顯，未來對于動物疾病檢測試劑甚至治療藥物研發(fā)等方面均具有較高的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場前景。