馬源人乳頭瘤病毒18 型的鑒定及遺傳進(jìn)化分析

謝金鑫，張敖云圖雅，閆永濤，張 磊，宋小珍，賈陳陽(yáng)，況 玲，佟盼盼

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

乳頭瘤病毒（Papillomavirus，PV）屬于乳多空病毒科（Papillomaviridae）家族，是一種小的無(wú)包膜的雙鏈DNA 病毒，主要感染人和動(dòng)物的皮膚和粘膜上皮細(xì)胞，誘發(fā)良性和惡性腫瘤[1]。已知有193 種HPV 類(lèi)型，其中15 種（HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73 和HPV82）被列為高風(fēng)險(xiǎn)型，HPV主要通過(guò)性接觸傳播，還可能經(jīng)手、圍產(chǎn)期、血液和空氣等方式傳播[2]。在其他動(dòng)物中也有乳頭瘤病毒的報(bào)道，目前已檢測(cè)到9 種馬乳頭瘤病毒（Equus caballus papillomavirus，EcPVs），24 種 牛 乳 頭 瘤 病 毒（Bovine papillomavirus，BPV），其 中BPV1、BPV2 和BPV13 可感染馬，BPV1 和BPV2 是引起馬肉瘤的主要致病病原[3-9]。

HPV18 是僅次于HPV16 的高風(fēng)險(xiǎn)型HPV，研究顯示HPV18 感染與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，E6、E7癌基因在細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起著重要作用[9]。目前尚未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物攜帶HPV18[1,10-11]。本研究首次鑒定了馬源HPV18 并對(duì)其E6 基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，為HPV18的流行病學(xué)研究提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣 品 本實(shí)驗(yàn)室于2018 年5 月，從新疆昌吉市和伊寧市馬場(chǎng)采集每匹馬的糞便、血清和鼻拭子共3 類(lèi)樣品，采集的純血馬共計(jì)30 匹，本土馬共計(jì)147 匹。

1.2 主要試劑 Viral Nucleic Acid Extraction Kit 購(gòu)自Geneaid 公司；膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA BIO-TEK公 司； DL2000 DNA Marker、 Reverse Transcriptase M-MLV、Klenow Fragment、Ribonuclease H、Ex Taq等購(gòu)自TaKaRa 公司。

1.3 病毒宏基因組學(xué)分析 參考文獻(xiàn)[12]對(duì)采集糞便樣品進(jìn)行病毒富集、核酸提取和反轉(zhuǎn)錄，采用隨機(jī)引物對(duì)cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得的DNA 通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、純化，合格后由上海派森諾生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序（Illumina HiSeq X-ten）和病毒宏基因組學(xué)分析。

1.4 引物設(shè)計(jì) 參照HPV18（JN416217、MF288702和KC470212 等）E6 基因，采用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物：5'-ATGGCGCGCTTTGAGGATCCAAC-3'/5'-TTATACTTGTGTTTCTCTGCGTCG-3'，由上海派森諾生物技術(shù)股份有限公司青島合成部合成。

1.5 樣品中HPV E6 基因的PCR 擴(kuò)增及序列測(cè)定根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]對(duì)采集的糞便、鼻拭子樣品進(jìn)行處理后，利用Geneaid 試劑盒提取樣品中的病毒DNA 為模板，采用1.4 的引物PCR 擴(kuò)增E6 基因，反應(yīng)條件：94 ℃3 min；94 ℃30 s、50 ℃30 s、72 ℃1 min，共34 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.6 E6 基因的同源性及其氨基酸序列遺傳進(jìn)化分析 根據(jù)GenBank 中登錄的相關(guān)PV 序列，采用DNAstar 軟件對(duì)獲得的馬源HPV18 E6 基因核苷酸和氨基酸序列與HPV18及EcPVs E6基因核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。利用MEGA7.0.26軟件采用最大似然法（Maximum Likelihood methods）構(gòu)建E6 氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，步展值重復(fù)1 000 次進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒宏基因組學(xué)分析 對(duì)采集的馬糞便樣品經(jīng)常歸處理、PCR 擴(kuò)增后經(jīng)病毒宏基因組學(xué)分析顯示，共獲得76 986 684 個(gè)測(cè)序讀長(zhǎng)，有197 056（0.26%）個(gè)測(cè)序讀長(zhǎng)注釋到哺乳動(dòng)物病毒，其中42個(gè)測(cè)序讀長(zhǎng)注釋到HPV18，進(jìn)一步拼接成7 條Contigs，Contigs 與HPV18 E6 基因編碼的氨基酸序列同源性為91.8%～100%，平均讀長(zhǎng)1 500 nt。表明馬糞便樣品攜帶HPV18。

2.2 樣品中馬源HPV18 E6 基因的PCR 擴(kuò)增及分析結(jié)果 通過(guò)特異性PCR 檢測(cè)，在30 份純血馬糞便樣品中有6 份呈HPV18 陽(yáng)性，陽(yáng)性率為20%，部分純血馬糞便樣品HPV18 E6 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1；與純血馬同場(chǎng)飼養(yǎng)的本土馬糞便樣品中HPV18 陽(yáng)性率為12.7%（7/55）；而非同場(chǎng)飼養(yǎng)的本土馬糞便樣品呈HPV18 陰性，表明馬源HPV18 可能是由純血馬攜帶的病毒。此外，在純血公、母馬糞便樣品中均檢測(cè)到HPV18，表明純血馬攜帶HPV18跟其性別沒(méi)有關(guān)系。在177 匹馬鼻拭子和血清樣品中均未檢測(cè)到HPV18，表明該病毒可能僅存在于馬腸道中，但HPV18 陽(yáng)性馬并未觀察到明顯的臨床癥狀。HPV18 可引起人的消化道腫瘤[13]，尚未見(jiàn)其經(jīng)消化道傳播的報(bào)道。本研究首次在動(dòng)物腸道中檢測(cè)到HPV18。13 份HPV 陽(yáng)性馬糞便樣品中HPV18 E6基因核苷酸序列同源性為100%，將樣品編號(hào)為S1的純血馬源HPV18 E6 基因序列提交至GenBank，獲得登錄號(hào)為MN164461，并命名為XJ-CJS1。

圖1 部分純血馬糞便樣品HPV18 E6 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR detection of E6 gene in samples of thoroughbred feces

2.3 HPV E6 基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析利用MegAlign 軟件將XJ-CJS1 株E6 基因核苷酸和氨基酸序列與GenBank 登錄的21 條HPV18、9 條馬乳頭瘤病毒（EcPVs）E6 基因核苷酸和氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，XJ-CJS1株E6基因核苷酸和氨基酸序列與西班牙（LSM7 株）、荷蘭（C644657、1445230、1193039、1447457、C506270 和C627893 株）、美國(guó)（Qv26861、Qv15957 等3 株）、德國(guó)（X04773 株）、泰國(guó)（CU10 株）、巴西（pam9 株）及日本（M20325 株）的HPV18 E6 基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.6%～100%、100%，而與我國(guó)HPV18（P1-10、P2-20、P1-20、P1-30、P2-30、P1-40 和P1-50 株）E6 基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為94.6%～97.3%、91.8%～96.8%，與EcPVs E6 基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為35.8%～40.1%、14.6%～24.6%。表明馬源HPV18 可能是由純血馬攜帶的外來(lái)病毒。

2.4 HPV E6氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹(shù)分析 以上述21株HPV18和9株EcPVs為參考株，利用MEGA7.0.26軟件構(gòu)建E6 氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示XJ-CJS1 株與21 株HPV18 均屬同一進(jìn)化分支，并與西班牙、荷蘭、美國(guó)、德國(guó)、日本、巴西、泰國(guó)人源HPV18 參考株親緣關(guān)系較近，但與9 株EcPVs 屬于不同分支（圖2），進(jìn)一步表明馬源HPV18 是由純血馬攜帶的外來(lái)病毒，并與國(guó)外HPV18 親緣關(guān)系較近，推測(cè)該病毒可能由人傳至純血馬，要引起足夠的重視。

圖2 HPV E6 氨基酸序列的遺傳進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of E6 amino acid sequence in HPV

HPV18 是能夠通過(guò)直接接觸傳播的一類(lèi)病毒，E6 癌基因在細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起著重要作用，在很多腫瘤及癌癥中均可以檢測(cè)到HPV[10]。99%以上的宮頸癌均與HPV 感染有關(guān)[14]，盡管未觀察到馬攜帶HPV18 表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，但馬攜帶HPV18具有潛在感染人的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)公共衛(wèi)生安全會(huì)產(chǎn)生威脅。本研究首次鑒定了馬源HPV18 并對(duì)其E6 氨基酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，為HPV18的流行病學(xué)研究提供了參考依據(jù)。