一株H1N1 亞型豬流感病毒血凝素HA 蛋白中和性單克隆抗體的制備及抗原表位鑒定

石建州，李青梅，劉 肖,2，王彥紅，李 鴿,2，郭軍慶，鄧瑞廣，張改平,2,4*

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002；3.南陽師范學(xué)院，河南 南陽 473061；4.揚(yáng)州大學(xué)江蘇高校動(dòng)物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009）

豬流感（Swine influenza，SI）是由SI病毒（SIV）引起的一種急性呼吸道人畜共患傳染病。近年來，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播的主要有H1N1、H1N2 和H3N2 亞型SIV，我國(guó)豬群流行的主要是H1N1 亞型SIV，其通過飛沫、氣溶膠、直接或間接接觸傳播，發(fā)病率高，臨床癥狀主要表現(xiàn)為咳嗽、流涕、食欲不振、嗜睡、疲倦，由其引起的繼發(fā)感染常導(dǎo)致豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失，潛在威脅生豬產(chǎn)業(yè)和公共衛(wèi)生安全[1-2]。

H1N1 亞型SIV 屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），A 型流感病毒屬，單股負(fù)鏈RNA 病毒，其由大小不等的8 個(gè)獨(dú)立節(jié)段構(gòu)成，編碼不同的病毒蛋白[3-4]。表面糖蛋白血凝素（Hemagglutinin，HA）是流感病毒最主要的表面抗原之一，其在侵染細(xì)胞、介導(dǎo)特異性受體結(jié)合、病毒外膜與細(xì)胞內(nèi)體融合、病毒粒子包裝、致病性以及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體等過程中發(fā)揮著重要的作用。HA 誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體是機(jī)體抗病毒免疫的首要因素，可有效阻止病毒對(duì)細(xì)胞的侵入，抑制病毒的感染[5]，HA 作為主要保護(hù)性抗原在流感治療以及免疫等方面均發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6-8]，開發(fā)針對(duì)流感病毒HA 蛋白的單克隆抗體（Monoclonal antibodies，MAbs）是有效監(jiān)測(cè)、預(yù)防和治療流感的重要工具[3]。本研究以純化的H1N1 SIV 為免疫原，利用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（Immunoperoxidase monolayer assay，IPMA）篩選和鑒定一株針對(duì)HA 蛋白的MAb，對(duì)其中和活性做了檢測(cè)，并鑒定其抗原表位，為H1N1 亞型SIV 診斷試劑和新型疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 H1N1亞型SIV A/swine/Zhucheng/90/2014（H1N1）株由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。H3N2亞型SIV 和H9N2 亞型禽流感病毒（AIV），以及MDCK 細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞SP2/0、抗H3N2 亞型SIV MAb 3A4 和抗H9N2 亞型AIV MAb 7E10 均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。BALB/c 小鼠購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SPF 雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

甲型H1N1 流感病毒血凝抑制試驗(yàn)抗原、陽性血清購自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司；Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents 試劑盒、完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑、不含IgG 的牛血清白蛋白BSA（IgG-free BSA）均購自Sigma 公司；A型H1N1 流感病毒（A/swine/Belgium/1/1998 株）HA 蛋白購自Sino Biological 公司；胎牛血清FBS 購自Gibco公司；AEC 酶底物試劑盒購自北京中杉金橋公司；HRP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG（HRP-IgG）購自Abbkine 公司；50% PEG 1500 購 自Roche 公 司；DMEM 培 養(yǎng)基、RPM1640、胰蛋白酶、HAT 培養(yǎng)基、彩虹180廣譜蛋白Marker 購自Solarbio 公司；側(cè)向流過濾膜包（截留分子量100 ku）、超濾管（截留分子量100 ku）和硝酸纖維素膜均購自Millipore 公司；Sepharose gel 4 Fast Flow（4FF）瓊脂糖凝膠購自GE 公司；Sulfo-SMCC 購自Thermo Fisher 公司。

1.2 免疫原的制備和動(dòng)物免疫 以側(cè)向流過濾膜包（截留分子量100 ku）濃縮H1N1 亞型SIV 尿囊液后經(jīng)4FF 瓊脂糖凝膠層析柱純化病毒，超濾管（截留分子量100 ku）濃縮目的蛋白峰后分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6 周齡～8 周齡的雌性BALB/c 小鼠，經(jīng)頸背部皮下多點(diǎn)免疫純化病毒（50 μg/只），首免為弗氏完全佐劑乳化病毒，第2～4 次加強(qiáng)免疫為弗氏不完全佐劑乳化病毒，免疫間隔為21 d。細(xì)胞融合前3 d，小鼠經(jīng)腹腔注射純化病毒進(jìn)行超免。

1.3 細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞篩選 超免3 d 后，將小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0 骨髓瘤細(xì)胞按1∶5 混合，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合和選擇性培養(yǎng)[9]。以H1N1 亞型SIV 感染MDCK 細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，以含3‰H2O2的甲醇室溫固定感染細(xì)胞；以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清原液作為一抗；山羊抗鼠IgG-HRP（1∶1 000）為二抗，AEC 酶底物試劑盒顯色，以IPMA 對(duì)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測(cè)，篩選陽性雜交瘤細(xì)胞[10]。采用有限稀釋法對(duì)陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)3 次亞克隆，篩選出穩(wěn)定分泌抗H1N1 亞型SIV MAb 的雜交瘤細(xì)胞株。將雜交瘤細(xì)胞腹腔注射經(jīng)石蠟預(yù)處理的經(jīng)產(chǎn)BALB/c 小鼠，約1.0×107個(gè)細(xì)胞/只，7 d～10 d 后采集腹水，-80 ℃保存。

1.4 MAb 生物學(xué)特性的鑒定

1.4.1 亞類鑒定 以鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒鑒定MAb Ig亞類，操作方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.2 MAb的IPMA和HI效價(jià)測(cè)定 采用1.3的IPMA方法測(cè)定雜交瘤細(xì)胞上清和MAb腹水的抗體效價(jià)；采用血凝抑制HI試驗(yàn)測(cè)定MAb腹水的抗體效價(jià)。

1.4.3 MAb 與HA 蛋白反應(yīng)性的檢測(cè) 以12%SDS-PAGE 電泳分離H1N1 亞型SIV HA 蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，以MAb 雜交瘤細(xì)胞上清原液為一抗，HRP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG（1∶1 000）為二抗，AEC 酶底物試劑盒顯色，western blot 檢測(cè)MAb 與HA 蛋白的反應(yīng)性。

1.4.4 MAb 的交叉反應(yīng)活性檢測(cè) 分別以H1N1 和H3N2 亞型SIV、H9N2 亞型AIV 感染MDCK 細(xì)胞，分別以抗H3N2 亞型SIV MAb 3A4 和抗H9N2 亞型AIV MAb 7E10 為陽性對(duì)照，未感染MDCK 細(xì)胞為陰性對(duì)照。經(jīng)1.3 的IPMA 檢測(cè)MAb 與不同亞型流感病毒交叉反應(yīng)活性的檢測(cè)，即檢測(cè)MAb 與不同亞型流感病毒的反應(yīng)特異性或廣譜性。

1.4.5 MAb 中和活性的測(cè)定 以Reed-Muench 法測(cè)定H1N1 亞型SIV 的TCID50[10]后采用微量中和試驗(yàn)檢測(cè)MAb 對(duì)H1N1 亞型SIV 的中和活性。分別取50 μL經(jīng)2 倍倍比稀釋的MAb 腹水（1∶10～1∶20 480）和MAb雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清（1∶1～1∶2 048），與等體積100 TCID50H1N1 亞型SIV 混勻，置5%CO237 ℃作用1 h后將MAb 與SIV 的混合物感染MDCK 細(xì)胞，以H1N1亞型SIV 感染的MDCK 細(xì)胞為陽性對(duì)照，正常MDCK細(xì)胞為陰性對(duì)照；病毒感染72 h 后，以IPMA 檢測(cè)病毒的感染情況，判定MAb 的中和活性。中和試驗(yàn)重復(fù)3 次統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

1.5 抗原表位的鑒定 根據(jù)H1N1 亞型SIV HA 蛋白氨基酸序列（ANJ61792.1），設(shè)計(jì)含16 個(gè)氨基酸序列的多肽，每條多肽重疊10 個(gè)氨基酸，在不含半胱氨酸Cys 多肽的N 端加入Cys，共計(jì)設(shè)計(jì)93 條多肽，多肽由吉爾生化（上海）有限公司合成。

以dot-blot 鑒定MAb 識(shí)別的抗原表位[11]。利用Sulfo-SMCC 將多肽偶聯(lián)于BSA 載體蛋白，將偶聯(lián)多肽點(diǎn)印于硝酸纖維素膜，以H1N1 亞型SIV 為陽性對(duì)照，BSA 為陰性對(duì)照；以MAb 10H8 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清原液為一抗，山羊抗鼠IgG-HRP（1∶1 000）為二抗，AEC 酶底物試劑盒顯色，檢測(cè)MAb 與各HA 多肽的反應(yīng)性，分析MAb 識(shí)別的抗原表位，并利用NCBI 的BLAST 對(duì)抗原表位序列進(jìn)行保守性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 雜交瘤細(xì)胞株的制備 免疫小鼠的脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞經(jīng)過融合，利用IPMA方法篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)3 次亞克隆后，獲得1 株穩(wěn)定分泌抗HA蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，將其分泌的MAb命名為10H8。

2.2 MAb 的亞類鑒定及效價(jià)測(cè)定結(jié)果 利用抗體亞類鑒定試劑盒鑒定MAb 10H8，結(jié)果顯示MAb 10H8的重鏈為IgG2a。IPMA 試驗(yàn)測(cè)定MAb 10H8 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和小鼠腹水的抗體效價(jià)分別為1∶1 024和1∶51 200。HI 試驗(yàn)測(cè)定MAb 10H8 的腹水HI 效價(jià)為13log2。

2.3 MAb 與HA 蛋白反應(yīng)性檢測(cè)結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示，在59 ku 處出現(xiàn)特異性條帶（圖1），表明MAb 10H8 能夠特異性識(shí)別H1N1 亞型SIV 的HA 蛋白，反應(yīng)性較好，并提示其識(shí)別HA 蛋白的線性抗原表位。

圖1 MAb 與HA 蛋白反應(yīng)性的western blot 檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The reactivity of MAb to HA protein identified by western blot

2.4 MAb 與不同亞型流感病毒的交叉反應(yīng)性檢測(cè)結(jié)果 不同亞型的流感病毒與MAb 10H8 交叉反應(yīng)性的IPMA 試驗(yàn)結(jié)果顯示，H1N1 亞型SIV 感染的MDCK 細(xì)胞呈紅色，而H3N2 亞型SIV 和H9N2 亞型AIV 感染的MDCK 細(xì)胞未見染色（圖2），表明MAb 10H8 特異性識(shí)別H1N1 亞型SIV，而不與H3N2 亞型SIV 和H9N2 亞型AIV 反應(yīng)，提示該MAb 是針對(duì)H1亞型流感病毒的特異性MAb。

2.5 MAb 的中和活性檢測(cè)結(jié)果 采用病毒微量中和試驗(yàn)檢測(cè)MAb 的中和活性。結(jié)果顯示：MAb 10H8 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清原液和1∶640 稀釋的腹水均能夠抑制SIV 感染細(xì)胞，具有較強(qiáng)的中和活性。

2.6 抗原表位的鑒定結(jié)果 根據(jù)H1N1亞型SIV HA蛋白氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成93 條HA 截短多肽作為抗原，以dot-blot檢測(cè)MAb 10H8雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清與HA 多肽的反應(yīng)性。結(jié)果顯示：MAb 10H8 與第50 條HA截短多肽的反應(yīng)呈陽性，即MAb 10H8識(shí)別的抗原表位區(qū)為295KCQTPHGALKGNLPFQ310（圖3）。鑒定流感病毒抗原表位是流感病原檢測(cè)和疫苗研制的關(guān)鍵[12]，合成HA蛋白的截短多肽是一種篩選抗原線性表位的經(jīng)典方法，本研究采用該方法鑒定的MAb抗原表位可用于臨床檢測(cè)和中和抗體效價(jià)評(píng)價(jià)，也為研究H1N1亞型SIV HA蛋白結(jié)構(gòu)和功能提供了基礎(chǔ)工具。

圖2 MAb 10H8 與不同亞型流感病毒的交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The cross-reactivity of MAb 10H8 to different subtypes of influenza virus

圖3 MAb 10H8 抗原中和表位的鑒定結(jié)果Fig.3 The identification result of the neutralizing epitopes on HA protein antigen

2.7 抗原中和表位的保守性分析 利用NCBI 的BLAST 對(duì)抗原表位序列（295KCQTPHGALKGNLPFQ310）進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，所鑒定的H1N1 亞型SIV HA 蛋白的抗原表位序列與不同地域來源和不同年份的H1N1 亞型SIV HA 蛋白相應(yīng)序列的同源性為100%，保守性高。

近年來，H1N1 流感病毒已經(jīng)蔓延到豬群，人畜共患的H1N1 亞型SIV 持續(xù)對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成潛在的威脅[13-14]。為了消除潛在的隱患，準(zhǔn)確的早期診斷和有效的后期治療是正確防控流感暴發(fā)與流行的必要手段。MAb 具有作為免疫診斷試劑和治療藥物的巨大潛力，并且流感抗體的被動(dòng)免疫已顯示出對(duì)人和動(dòng)物的抗感染保護(hù)作用的優(yōu)越性，所以，制備更多高質(zhì)量的流感病毒抗HA 蛋白的中和性MAb是防制流感的重要手段?；谥苽渲泻托訫Ab 有助于研發(fā)基于抗體的診斷試劑和治療藥物，鑒定抗原表位是了解蛋白結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)，本研究制備的抗H1N1 亞型SIV HA 蛋白MAb 具有較強(qiáng)中和活性，其識(shí)別的抗原表位序列在H1N1 亞型SIV 病毒株中高度保守，是較理想的疫苗設(shè)計(jì)和監(jiān)測(cè)靶標(biāo)，為H1N1 亞型SIV 新型疫苗和檢測(cè)試劑的研發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。