奶牛乳房炎無乳鏈球菌Fc-Sip 和金黃色葡萄球菌Fc-FnBPB-ClfA 亞單位疫苗的免疫試驗研究

李松建，周雅坪，呂天星，杜 琳，郭 婷，郝永清

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

FcRn 首次在新生嚙齒動物的腸道中被發(fā)現(xiàn)，當嚙齒類動物斷奶后，F(xiàn)cRn 在腸道中的表達量明顯下降[1]。Israel 等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cRn 不僅僅在新生兒的體內(nèi)表達，而且在成年人和哺乳動物的一些組織當中同樣有所表達，如人的血管內(nèi)皮細胞、小腸上皮細胞和合胞體滋養(yǎng)層等等[2]。牛和豬的乳腺上皮細胞、小腸上皮細胞和肺組織等部位均有FcRn的表達[3]。張怡等發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cRn 介導(dǎo)單純皰疹病毒（HSV）特異性抗原可穿過極化的HEC-1-A 細胞發(fā)揮局部粘膜免疫保護作用，防止皰疹病毒入侵細胞[4]。FcRn 能夠與IgG 分子和白蛋白相互結(jié)合，防止IgG 分子和白蛋白被遞呈到溶酶體中降解[5]，延長了IgG 分子和白蛋白的半衰期[6]。Ye 等研究發(fā)現(xiàn)FcRn 的介導(dǎo)下通過了呼吸道粘膜屏障轉(zhuǎn)運HSV-2gD 至血液，有效促進了局部粘膜免疫和體液免疫的發(fā)生[7]。

近年來，關(guān)于無乳鏈球菌（S.agalactiae，Sgc）的莢膜、表面蛋白等有效靶點制備抗原的研究很多，但是目前還沒有高效、市場化的無乳鏈球菌疫苗問世，因此，無乳鏈球菌性奶牛乳房炎仍是一個奶牛養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的問題。同樣，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，Sau）的疫苗仍在研究階段，Shkreta 等串聯(lián)金黃色葡萄球菌ClfA 和FnBPs，制成二價核酸疫苗對奶牛進行首次免疫，第二次免疫使用相應(yīng)基因的亞單位疫苗加強免疫，結(jié)果表明，混合使用金黃色葡萄球菌核酸疫苗和亞單位疫苗能夠有效地刺激奶牛發(fā)生特異性免疫反應(yīng)[8]。但考慮到這種方法成本較高、操作繁雜，對于大型奶牛養(yǎng)殖場很難采用這種疫苗進行免疫。基因工程苗、亞單位疫苗不但可以有效避免利用全病原體生產(chǎn)疫苗而導(dǎo)致的生物安全風(fēng)險，而且有利于提高疫苗中有效成分的濃度、純度，是目前疫苗產(chǎn)業(yè)新的研究趨勢[9]。因此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上制備亞單位疫苗Fc-Sip，F(xiàn)c-FnBPB-ClfA，進行免疫試驗，以期達到良好免疫效果。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 含pET22b-Fc-Sip 質(zhì)粒的菌株、含pET32a-Fc-FnBPB-ClfA 質(zhì)粒的菌株均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實驗室保存；實驗用奶牛購自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市達拉特旗某牧場；IPTG（1 mol/L）、透析袋（8 000 ku～14 000 ku）購自北京索萊寶生物科技有限公司；TMB 底物溶液購自天根生化科技有限公司；鹽酸左旋咪唑（LH）購自吉林和元生物工程有限公司；兔抗牛HRP-IgG 購自海博生物技術(shù)有限公司；BCA 改良型蛋白定量試劑盒、30%丙烯酰胺、TEMED、His 鎳層析柱均購自生工（上海）生物工程股份有限公司；利拉伐CMT 檢測試劑購自蘭州偉國牧場用品商貿(mào)公司。

1.2 亞單位疫苗的制備 按常規(guī)方法將含pET-22b-Fc-Sip 質(zhì) 粒 和pET-32a-Fc-FnBPB-ClfA 質(zhì) 粒 的菌株分別進行原核表達，將表達出的上清蛋白經(jīng)純化、濃縮，使用BCA 改良型蛋白定量試劑盒測定Fc-Sip 和Fc-FnBPB-ClfA 蛋 白 濃 度，按 體 積1∶1 的比例將上述兩種蛋白分別與1%的鹽酸左旋咪唑（1%LH）充分混合，制備成Fc-Sip 亞單位疫苗和Fc-FnBPB-ClfA 亞單位疫苗。

1.3 動物試驗設(shè)計 將臨近干奶期前15 d、1～3 胎次奶牛進行乳樣CMT 檢測，將CMT 檢測（++）以上的40 頭奶牛隨機分成A 組、B 組、C 組、對照組，每 組10 頭。A 組 免 疫Fc-Sip + Fc-FnBPB-ClfA 二 聯(lián)亞單位疫苗，B 組免疫無乳鏈球菌Fc-Sip 亞單位疫苗免疫，C 組免疫金黃色葡萄球菌Fc-FnBPB-ClfA亞單位疫苗，對照組注射鹽酸左旋咪唑（0.9%LH）。A、B、C 3 組均以蛋白含量為5 mg/頭（2mL）經(jīng)肌肉注射免疫，對照組注射2 mL 0.9%鹽酸左旋咪唑。14 d 后，A、B、C 3 組均以蛋白含量為10 mg/頭（4 mL）進行乳頭管灌注二次免疫，對照組灌注4 mL 1%鹽酸左旋咪唑，灌注免疫結(jié)束后使用干奶劑封閉乳頭管。具體實驗設(shè)計見表1。

表1 試驗動物免疫程序設(shè)計Table 1 Experimental animal immunization program

1.4 免疫前后奶牛乳樣中細菌的鑒定 免疫前和首免90 d 后分別采集各試驗組乳樣50 mL，劃線接種至高鹽甘露醇平板培養(yǎng)基、TSB 平板培養(yǎng)基和伊紅美藍平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。金黃色葡萄球菌的菌落在高鹽甘露醇平板培養(yǎng)基上呈金黃色；大腸桿菌在伊紅美藍平板培養(yǎng)基上呈黑色金屬光澤；葡萄球菌、鏈球菌、蠟樣芽胞桿菌等均可在TSB 平板培養(yǎng)基上生長，根據(jù)菌落大小形態(tài)特點，提取各平板培養(yǎng)基上單個菌落的基因組，按常規(guī)方法進行16S DNA PCR 鑒定細菌類別。

1.5 體細胞數(shù)的測定 利用利拉伐牛奶體細胞檢測儀檢測免疫前和首免90 d 后各組試驗?zāi)膛Ｈ闃又械捏w細胞數(shù)。根據(jù)CMT 檢測標準（表2），以CMT（++）以上，即乳中體細胞數(shù)大于4.0×105個/mL 的奶牛判定為隱性乳房炎奶牛；以CMT（+++）以上，即乳中體細胞數(shù)大于8.0×105個/mL 的奶牛判定為臨床型乳房炎奶牛。

表2 CMT 檢測標準Table 2 CMT test standard

1.6 試驗?zāi)膛Ｃ庖哐逯刑禺愋钥贵w的監(jiān)測 免疫后0、7 d、14 d、28 d、60 d、90 d 分別采集各實驗組奶牛尾靜脈血液10 mL，制備血清。將測定濃度后的Fc-Sip 蛋白和Fc-FnBPB-ClfA蛋白分別作為包被抗原，使用包被液將其分別稀釋至3 μg/mL 和5 μg/mL，4 ℃過夜包被酶標板；10%脫脂乳封閉酶標板；以免疫后0、7 d、14 d、28 d、60 d、90 d 的奶牛血清倍比稀釋后作為一抗，兔抗牛HRG-IgG（1∶6 000）作為二抗，以間接ELISA 的方法檢測各試驗組和對照組奶牛血清中的抗體水平，作3 個平行對照。

2 結(jié) 果

2.1 Fc-Sip 和Fc-FnBPB-ClfA 蛋白純化結(jié)果 將Fc-Sip 和Fc-FnBPB-ClfA 經(jīng)原核表達后，取其上清蛋白經(jīng)鎳層析柱純化，利用透析濃縮蛋白，取適量濃縮后的蛋白進行SDS-PAGE 檢測，蛋白純化結(jié)果見圖1。將Fc-Sip 和Fc-FnBPB-ClfA 純化后的蛋白濃縮后測定其蛋白濃度分別為2.5 mg/mL 和2.7 mg/mL。

2.2 乳樣中細菌分離結(jié)果 免疫組（A、B、C）免疫前后乳樣劃線培養(yǎng)后，利用16S DNA 檢測其中病原菌，結(jié)果顯示，免疫前免疫組（A、B、C）奶牛的乳樣細菌分離率分別為80%、90%、80%，其中Sgc檢出率分別為20%、30%、10%，Sau 檢出率分別為30%、20%、10%；90 d 后3 個免疫組奶牛乳樣細菌分離率分別降至20%、20%、40%，其中Sgc 的檢出率分別降至0、0、10%，Sau 的檢出率分別降至10%、10%、0。對照組免疫前與首免90 d 后的細菌檢出率均為80%。免疫組（A、B、C）首免90 d后乳樣中無乳鏈球菌檢出率和金黃色葡萄球菌檢出率比免疫前顯著降低（p＜0.05）（表3）。表明試驗所用亞單位疫苗可治療無乳鏈球菌性和金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎。

圖1 Fc-Sip 和Fc-FnBPB-ClfA 蛋白的純化結(jié)果Fig.1 Purification results of Fc-Sip and Fc-FnBPB-ClfA protein

表3 分菌與體細胞測定結(jié)果Table 3 Results of bacterial isolation and somatic cell detection

續(xù)表

2.3 乳樣中體細胞數(shù)測定結(jié)果 牛奶中的體細胞通常由巨噬細胞、淋巴細胞、多形核嗜中性粒白細胞和少量的乳腺組織上皮細胞等組成。當奶牛泌乳系統(tǒng)受不同種類病原的侵襲而發(fā)生感染時，乳房組織分泌的乳汁中體細胞數(shù)隨即大幅度上升[10]。使用利拉伐體細胞檢測儀測定免疫前與首免90 d后各試驗組奶牛乳樣的體細胞數(shù)，結(jié)果顯示（表3），免疫前免疫組（A、B、C）奶牛體細胞數(shù)均值分別為6.19×105個/mL、5.16×105個/mL、5.49×105個/mL，首免90 d后3個免疫組奶牛乳樣中體細胞數(shù)均值分別為2.05×105個/mL、2.04×105個/mL、2.52×105個/mL，而對照組奶牛乳樣體細胞數(shù)免疫前后無明顯變化。對比表3 中2.2 結(jié)果可知，牛奶中體細胞數(shù)的變化在一定程度上取決于奶牛乳腺組織是否被病原微生物感染，因此該體細胞檢測結(jié)果表明試驗所用亞單位疫苗降低了乳腺感染程度。

2.4 免疫血清抗體水平檢測結(jié)果 采用間接ELISA方法檢測各試驗組和對照組奶牛血清中的抗體水平，結(jié)果顯示，對照組奶牛血清中Fc-Sip 和Fc-FnBPB-ClfA 抗體滴度分別保持在1∶256、1∶512 的水平。首免后7 d，A 組、B 組80%的奶牛血清中Fc-Sip 抗體滴度達到1∶512，A 組、C 組80%的奶牛血清中Fc-FnBPB-ClfA 抗體滴度達到1∶1 024；第14 d 后，血清抗體滴度均明顯升高，A 組、B 組90%奶牛血清中Fc-Sip 抗體滴度達到1∶1 024，A 組、C 組80%奶牛血清中Fc-FnBPB-ClfA 抗體滴度達到1∶2 048；第28 d 后，A 組、B 組70%奶牛血清Fc-Sip 抗體滴度在1∶2 048～1∶4 096，A 組、C 組80%奶牛血清Fc-Fn-BPB-ClfA 抗體滴度在1∶4 096～1∶8 192，第60 d 后，免疫各組的血清抗體滴度呈現(xiàn)下降趨勢（圖2）。

圖2 免疫牛血清抗體檢測結(jié)果Fig.2 Antibody titer in immunized bovine serum

綜合分析各組檢測結(jié)果可見A 組Fc-Sip+Fc-Fn-BPB-ClfA 二聯(lián)亞單位疫苗綜合免疫效果最佳。表明Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA 二聯(lián)亞單位疫苗不僅有效促進奶牛體液免疫反應(yīng)，還對無乳鏈球菌性和金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎具有一定的治療作用。

3 討 論

已有研究證實了包括無乳鏈球菌在內(nèi)的鏈球菌屬全菌體滅活苗對奶牛的保護力較弱，而研究較多的莢膜多糖疫苗等也缺乏廣泛的保護力，免疫保護效果均不理想[11]。這可能是該菌本身抗原結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，已鑒定的不同種血清型無乳鏈球菌之間缺乏交叉保護力。通常情況下，無乳鏈球菌的毒力因子和抗原因子在同一標靶組分上，而標靶蛋白只有在細菌細胞保持完整活狀態(tài)下才能發(fā)揮其毒力作用，而其抗原性在亞單位狀態(tài)下仍會存在[12]。因此，將亞單位有效標靶蛋白作為重點研究對象，已成為該領(lǐng)域的研究熱點。

本實驗室前期對奶牛乳房炎亞單位疫苗的研究中，分別篩選了鋁膠鹽佐劑、蜂膠佐劑、大腸肝菌熱不穩(wěn)定腸毒素佐劑（LTB）等，但均不理想。近年來FnRn 在介導(dǎo)免疫方面研究較多，但FcRn 與IgG 分子結(jié)合依賴于pH 環(huán)境，當pH 小于7.0 即酸性條件下，F(xiàn)cRn 可以與IgG 分子結(jié)合，當pH 大于7.0 即堿性條件下，F(xiàn)cRn 與IgG 分子不結(jié)合，另外鹽酸左旋咪唑佐劑（LH）具有免疫調(diào)節(jié)和免疫興奮的功能[13]。因此，由IgG FcRn介導(dǎo)保護性抗原的亞單位疫苗使用偏酸性佐劑最為合適。所以，本研究采用1%LH作為佐劑。

病原菌引起的奶牛乳房炎涉及十多個屬的細菌，其中葡萄球菌屬、鏈球菌屬和大腸埃希菌屬在乳房炎牛乳中分離率約占90%[14]。本研究通過免疫后細菌分離率、無乳鏈球菌檢出率、金黃色葡萄球菌檢出率及其它乳房炎致病菌均有減少，說明Fc-Sip 亞單位疫苗和Fc-FnBPB-ClfA 亞單位疫苗免疫可提高牛體免疫力，不但降低了無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌，而且還抑制了其它奶牛乳房炎致病菌的侵入；牛乳中體細胞數(shù)不僅是評價牛奶質(zhì)量的重要指標[15]，而且是乳腺受病原侵襲后導(dǎo)致的感染程度的指標[10]。本實驗免疫后牛乳中的體細胞數(shù)比免疫前明顯下降，免疫A、B、C 組牛乳中體細胞數(shù)均值小于3×105個/mL，而免疫前后對照組牛乳中體細胞數(shù)無明顯變化，證明本實驗所用亞單位疫苗具有降低感染牛乳腺感染程度的作用?？贵w滴度變化情況是疫苗免疫效果評價的重要指標，本研究利用間接ELISA 檢測各組免疫前后抗體水平變化，結(jié)果顯示，免疫A 組抗體滴度比對照組平均上升3 至4個抗體滴度；免疫B 組抗體滴度比對照組平均上升2 至3 個抗體滴度；免疫C 組抗體滴度比對照組平均上升3 個抗體滴度，A 組抗體滴度升高最為明顯。有研究顯示，F(xiàn)cRn 參與乳腺對IgG 的胞吞轉(zhuǎn)運和保護IgG 分子免受降解，提高牛乳中IgG 的含量[16]，本研究利用FcRn 串聯(lián)表達的重組亞單位疫苗免疫后抗體檢測結(jié)果進一步印證了該結(jié)論。

無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎均具有高度傳染性，常引起奶牛隱性乳房炎，影響泌乳量，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來經(jīng)濟損失。目前，還沒有研制出市場化的無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗。本實驗室致力于研究奶牛乳房炎疫苗多年，對于如何誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效、快速的乳房局部免疫反應(yīng)有了新的突破，在楊嵐、杜琳、趙紅梅等的研究中已經(jīng)從疫苗的研制階段到本動物的免疫試驗及最后免疫效果的評價，免疫佐劑選擇等方面建立了一套完整的模型[17-18]。本研究通過免疫試驗，探究了Fc-Sip 和Fc-FnBPB-ClfA 亞單位疫苗的免疫效果，為無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的開發(fā)提供了技術(shù)支持。