抗KDR單克隆抗體的制備＊

李麗英 譙時文 李東

（樂山職業(yè)技術學院人體解剖教研室，四川 樂山614000）

新生血管是指在已存在的血管基礎上，通過發(fā)芽或分支方式所形成的新血管。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管的生成［1］。在血管內(nèi)皮細胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）家族中，VEGF－A在腫瘤血管新生中發(fā)揮著重要作用，它能促使內(nèi)皮細胞有絲分裂，誘導血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移，促進新生血管形成，還能增加血管通透性［2］。VEGF－A的這些生物學效應主要是通過其血管內(nèi)皮細胞生長因子受體，又含激酶插入?yún)^(qū)的受體（Human kinase insert domain containing receptor，KDR）來實現(xiàn)的。KDR是1992年 Terman［3］等最早從人臍靜脈內(nèi)皮細胞cDNA文庫中，應用與已知受體酪氨酸激酶的同源產(chǎn)物擴增獲得。研究證明，靶向敲除KDR基因，將導致血島形成損傷，并缺乏成熟的內(nèi)皮細胞，從而使小鼠胚胎于第8.5～9.5d死亡［4］。在成年小鼠中，即使是通過藥物短期阻斷VEGF－A與KDR之間的相互作用，仍然會引起血管退化［5］。鑒于KDR在VEGF－A／KDR信號通路中的重要作用，我們采用雜交瘤技術制備能穩(wěn)定分泌抗KDR單克隆抗體（Monoclonal Antibody，mAb）的雜交瘤細胞，以期獲得能抑制VEGFA生物學效應的抗KDR mAb。

1 材料與方法

1.1 材料

8～10周齡、18～20g雌性清潔級BALB／c小鼠6只，購自四川大學實驗動物中心，合格證號：SYXK（川）2009－045。小鼠骨髓瘤細胞SP2／0－Ag14、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶蛋白（Glutathione S－transferases，GST）、GST－KDR融合蛋白，由四川大學免疫學教研室提供。次黃嘌呤H、氨基喋呤A、胸腺嘧啶T、聚乙二醇等購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 雜交瘤細胞株的建立

用純化的GST－KDR蛋白作為免疫原，常規(guī)皮下免疫BALB／c小鼠2只，50μg·只－1，共4次；末次加強免疫后3d，取小鼠脾臟通過機械分離法制成脾細胞懸液，與小鼠骨髓瘤細胞SP2／0－Ag14在聚乙二醇介導下融合，采用雜交瘤技術建立分泌抗KDR mAb的雜交瘤細胞株。

1.2.2 最佳抗原包被濃度的確定及抗KDR mAb的檢測

按照間接酶聯(lián)免疫法（Enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）進行，以GST－KDR融合蛋白進行包板，該蛋白濃度為1.6mg·mL－1。先用碳酸鹽緩沖液對GST－KDR融合蛋白進行10倍稀釋，再2倍倍比稀釋，即分別為1、1／2、1／4、1／8、1／16、1／32、1／64、1／128、1／256。再通過間接 ELISA 法檢測雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清液。

1.2.3 抗KDR mAb的大量制備及純化

取雌性BALB／c小鼠4只，每只BALB／c小鼠腹腔內(nèi)注射0.5mL液體石蠟，7d后將建株的雜交瘤細胞（5×106細胞·只－1）接種于小鼠腹腔。10～14d后收集腹水，按飽和硫酸銨法進行鹽析，G－Sephrose 4B親和層析純化，用紫外分光光度計測定其蛋白濃度。

1.2.4 抗KDR mAb效價的測定

采用間接ELISA法測定純化后抗KDR mAb的效價。以（測定孔A450值／陰性對照孔A450值）≥2.1為陽性，選擇陽性孔中的最高稀釋度即為抗KDR mAb的效價。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細胞株的建立

融合細胞接種于4塊96孔細胞培養(yǎng)板，融合后7～10d，觀察到雜交瘤細胞生長孔352孔，細胞融合率為91.7%；初選特異性陽性克隆細胞33孔，陽性率為8.7%。4～5d后，取單克隆培養(yǎng)孔上清液，利用間接ELISA法進行檢測，最終獲得4株只針對 KDR的雜交瘤細胞株，分別是1E8、1F1、2B8、3E9。經(jīng)有限稀釋法，對陽性克隆孔2B8、3E9進行反復亞克隆，最終獲得1株能穩(wěn)定分泌抗KDR mAb的雜交瘤細胞株，命名為3E9 B2G11。

2.2 包被抗原最佳濃度的確定

通過間接ELISA法測得GST－KDR包被抗原濃度在2倍倍比濃度稀釋下對應的A450值，以GST－KDR包被抗原濃度為橫坐標，對應的吸光度A450值為縱坐標，通過Excel軟件繪制出圖1，曲線接近水平狀態(tài)時的抗原最高稀釋濃度為抗原的最佳包被濃度。由圖1可看出GST－KDR抗原的最佳包被濃度是10μg· mL－1（見圖1）。

2.3 抗KDR mAb的蛋白濃度測定

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）作為標準蛋白質(zhì)，用雙蒸水倍比稀釋，752型紫外分光光度儀測定A280值，繪制吸光度值－標準蛋白BSA系列濃度梯度曲線（見圖2）。將濃縮純化腹水樣品稀釋10倍進行測定，其A280值為0.42，對應標準曲線，通過Excel軟件FORECAST線性回歸統(tǒng)計分析計算出抗KDR mAb的蛋白濃度為6.1mg·mL－1。

2.4 抗KDR mAb的效價測定

由間接ELISA法測定雜交瘤細胞株3E9B2G11所分泌的抗體效價為1∶16384。

圖1 吸光度－ （GST－KDR）包被抗原濃度梯度曲線

圖2 吸光度值－標準蛋白BSA系列濃度梯度曲線

3 討論

早在1971年，F(xiàn)olkman［6］就提出腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移離不開血管生成，無論何種抗腫瘤新生血管形成的技術都將是對現(xiàn)有腫瘤治療學的強有力的補充?？寡苌芍委熌[瘤的策略是：通過阻斷腫瘤組織中血管生長因子對血管內(nèi)皮細胞的作用來阻止新生血管形成，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。目前有許多觀點趨向于采用KDR作為阻斷腫瘤血管新生治療的最佳靶點，理由如下［7］：1）KDR主要表達于活化的內(nèi)皮細胞，如腫瘤位點；2）由于腫瘤內(nèi)皮細胞與血液直接接觸，使KDR受體抑制劑更容易達到靶細胞；3）VEGF家族中，除VEGF－A外，其它成員如VEGF－C、－D、－E也可作為KDR的配體；因此，采用KDR受體抑制劑可潛在阻斷它們的刺激作用。Michael［8］等對49例婦科惡性腫瘤患者、61例婦科良性腫瘤患者及12例對照組的血清進行分析發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌及卵巢癌等惡性腫瘤中，VEGF－A及磷酸化KDR的表達水平都顯著高于良性腫瘤及對照組。KDR高表達于被激活的血管內(nèi)皮細胞上，若能抑制其活性，阻斷VEGF－A／KDR信號轉(zhuǎn)導通路，VEGF－A就不能發(fā)揮作用，從而達到抗腫瘤新生血管形成的目的。

為了能最大限度地封閉VEGF－A與內(nèi)源性KDR受體結(jié)合，我們以GST－KDR蛋白免疫小鼠，通過雜交瘤技術制備能穩(wěn)定分泌抗KDR mAb的雜交瘤細胞。本實驗中，我們對GST抗原和GST－KDR抗原都進行包被，取單克隆細胞的上清液同時進行檢測，觀察上清液與GST抗原、GST－KDR抗原的結(jié)合情況。通過間接ELISA法對雜交瘤細胞進行篩選，每次只選擇與GST－KDR蛋白反應呈陽性的克隆細胞進行亞克隆，分離出針對KDR單一抗原決定簇的B細胞克隆。經(jīng)間接ELISA法檢測出只分泌抗GST－KDR蛋白抗體的細胞克隆后，利用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行克隆化。經(jīng)過3次反復間接ELISA法檢測特異性抗體及反復亞克隆，得到了一株基因型穩(wěn)定并能穩(wěn)定分泌抗KDR mAb的雜交瘤細胞株，命名為3E9B2G11。實驗結(jié)果證明，用GST－KDR蛋白免疫BALB／C小鼠，可獲得特異、穩(wěn)定分泌抗KDR mAb的雜交瘤細胞株。這為以后將該抗體改造成小分子酪氨酸激酶抑制劑，使其能進入細胞內(nèi)與受體KDR特異性結(jié)合并阻斷血管內(nèi)皮細胞生長因子的強大生物學功能奠定了重要的基礎。

1 Kumar R，F(xiàn)idler IJ.Angiogenic molecules and cancer metastasis［J］.In Vivo，1998，12（1）：27－34.

2 Jin HC，Nitin KG，Elisa L，et al.Corneal Neovascularization：An Anti－VEGF Therapy［J］.Surv Ophthalmol，2012，57（5）：415－429.

3 Terman B，Khandke L，Dougher VM，et al.VEGF receptor subtypes KDR and Flt－1show different sensitivities to heparin and placenta growth factor［J］.Gowth Factor，1994，11（3）：187－195.

4 Shalaby F，Gertsenstein M，Rossant J，et al.Failure of blood－island formation and vasculogenesis in Fik－l deficient mice［J］.Nature，1995，376（6）：62－66.

5 Kamba T.VEGF－dependent plasticity of fenestrated capillaries in the normal adult microvasculature［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290（2）：H560－H576.

6 Folkman J.Tumor angiogenesis：Theraputic implication［J］.N Engl J Med，197l，285（21）：1182－1186.

7 Miao H，Hu K，Jimenea X，et al.Potent neutralization of VEGF biological activities with a fully human antibosy Fab fragment directed against VEGF receptor 2［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，345（1）：438－445.

8 Michael I，Koukourakis，Vassilios L，et al.Serum VEGF levels and tissue activation of VEGFR2／KDR receptors in patients with breast and gynecologic cancer［J］.Cytokine，2011，53（3）：370－375.