MicroRNA與乳腺癌進(jìn)展及耐藥性的作用研究

劉振茹 周黎明

（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理教研室，四川 成都610041）

1 miRNA分子概述

miRNA作為一類(lèi)特殊的內(nèi)生性非編碼小RNA，長(zhǎng)度約為21－25個(gè)核苷酸，在多種生物中高度保守，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。由于miRNA常以基因簇的形式存在，可存在于基因間隔區(qū)，或位于較大的非編碼RNA分子內(nèi)部，并且能夠調(diào)節(jié)處于內(nèi)含子區(qū)域的基因轉(zhuǎn)錄，因此，其對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用也非常復(fù)雜［1］。miRNA的成熟，涉及到在胞核及胞質(zhì)中的加工過(guò)程。首先在細(xì)胞核內(nèi)，編碼miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下生成pri－miRNA，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后修飾，增加5＇－端帽結(jié)構(gòu)和3＇－端尾結(jié)構(gòu)，然后在核酸內(nèi)切酶Drosha和輔助因子DGCR8／Pasha的作用下，形成約70nt，具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體pre－miRNA［2］。在核膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exp5的協(xié)助下，從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中，在胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)Dicer酶進(jìn)一步加工后形成miRNA。

在細(xì)胞質(zhì)中，成熟的miRNA可與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）整合，從而形成miRNA－RISC復(fù)合體，該復(fù)合體通過(guò)與靶mRNA的3＇－UTR區(qū)結(jié)合，裂解或抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程，從而誘導(dǎo)基因沉默。盡管miRNA誘導(dǎo)的基因沉默通常發(fā)生在靶mRNA的3＇－UTR區(qū)，但新的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可通過(guò)位于蛋白編碼序列的種子序列及5＇－UTR區(qū)而調(diào)節(jié)翻譯過(guò)程［3］。除此之外，一些非常規(guī)少見(jiàn)的關(guān)于miRNA上調(diào)靶miRNA的翻譯也有報(bào)道。miRNA對(duì)mRNA翻譯調(diào)節(jié)作用的復(fù)雜性，這也充分說(shuō)明了其對(duì)基因組翻譯調(diào)節(jié)的作用具有多重機(jī)制。

2 乳腺癌中異常表達(dá)的miRNA

miRNA已被證實(shí)與腫瘤的多種生物學(xué)特性具有相關(guān)性，包括增殖、分化及凋亡等過(guò)程紊亂。關(guān)于腫瘤相關(guān)miRNA表達(dá)譜的研究證實(shí)，位于脆性位點(diǎn)或擴(kuò)增區(qū)的miRNA常異常表達(dá)，提示其可能參與腫瘤發(fā)生，從而作為腫瘤的生物標(biāo)記物。

2.1 促進(jìn)乳腺癌發(fā)生的miRNA

促癌基因miRNA在腫瘤中常上調(diào)表達(dá)，腫瘤抑制基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因及利于疾病發(fā)生的其它相關(guān)基因是其潛在的作用靶點(diǎn)［4］。通過(guò)對(duì)miRNA表達(dá)譜的研究發(fā)現(xiàn)，miR－155在乳腺癌中過(guò)表達(dá)，并且在乳腺癌細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)miR－155，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖及細(xì)胞集落形成，其功能的發(fā)揮通過(guò)抑制細(xì)胞信號(hào)因子1（SOCS1，而SOCS1作為腫瘤抑制因子可負(fù)向調(diào)控JAK／STAT信號(hào)通路［5］。Volinia等［6］發(fā)現(xiàn)，miR－21在多種實(shí)體腫瘤中過(guò)表達(dá)，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等，提示其對(duì)腫瘤的作用可能具有普遍性。隨后的研究證實(shí)，多種抑癌基因PTEN、PDCD4、TPM1是其作用靶點(diǎn)，可以介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［7］。細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子ZBTB10／RINZF是一種調(diào)控細(xì)胞周期的特殊轉(zhuǎn)錄因子蛋白（SPl）的抑制物，而miR－27作為一種腫瘤癌基因，通過(guò)調(diào)節(jié)ZBTB10表達(dá)，從而使SPl蛋白過(guò)度表達(dá)，引起細(xì)胞癌變，miR－27也可使SP2和SP3過(guò)度表達(dá)，同樣具有引起細(xì)胞癌變的作用［8］。

2.2 抑制乳腺癌發(fā)生的miRNA

抑癌基因miRNA在腫瘤中常下調(diào)表達(dá)或缺失，其作用的靶點(diǎn)為一些致癌基因。ErbB酪氨酸激酶受體家族對(duì)細(xì)胞的增殖及存活發(fā)揮重要作用，HER2／neu和HER3在乳腺癌中高表達(dá)，并且與乳腺癌預(yù)后不良相關(guān)，Scott等［9］研究發(fā)現(xiàn)，miR－125a和miR－125b可以抑制HER2和HER3的表達(dá)，并且在體外實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)miR－125a和miR－125b可以在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平降低HER2和HER3的表達(dá)，減少細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的能力，從而降低其惡性表型。研究還發(fā)現(xiàn)，miR－205在正常的乳腺上皮干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，并且在乳腺癌細(xì)胞系中以HER3為作用靶點(diǎn)，因此，在惡性程度較高的乳腺癌細(xì)胞中可發(fā)揮腫瘤抑制作用［10］。Cascio等［11］通過(guò)模擬 MCF－7乳腺癌細(xì)胞低氧環(huán)境，發(fā)現(xiàn)miR－20b能夠通過(guò)調(diào)節(jié) HIF－1（低氧誘導(dǎo)因子1）及STAT 3（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3）通路，下調(diào)VEGF的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，起到抑癌基因的作用。

2.3 雌激素受體（ER）與 miRNA

雌激素受體（ER）的狀態(tài)常作為乳腺癌重要的預(yù)后標(biāo)志之一，通過(guò)對(duì)miRNA的表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)，在ER陰性乳腺癌細(xì)胞中miR－206高表達(dá)，而在ER陽(yáng)性細(xì)胞中則成相反狀況。隨后的研究證實(shí) miR－206通過(guò)3＇－UTR區(qū)調(diào)節(jié)ERα的表達(dá)。將miR－206轉(zhuǎn)染至雌激素依賴性細(xì)胞系，對(duì)細(xì)胞的增長(zhǎng)抑制作用呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性［12］。同樣，miR－221／222也可直接調(diào)節(jié)ERα的表達(dá)，研究還發(fā)現(xiàn)ERα和 miR－221／222構(gòu)成負(fù)反饋環(huán)路，ERα可通過(guò)捕獲轉(zhuǎn)錄共阻遏物結(jié)合到miR－221／222位點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行負(fù)向調(diào)控［13］。與之相似的，miR－22可負(fù)向調(diào)控ERα，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)使用miR－22處理ERα陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞可抑制細(xì)胞的增殖［14］。 而 Pedro de Souza Rocha Simonini等［14］提 出miR－375在ERα陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞存在高表達(dá)，與以往的研究不同，作者首次提出miR－375與ERα構(gòu)成正反饋環(huán)路，并下調(diào)RASD1mRNA表達(dá)水平，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。基于以上研究，有假設(shè)提出，一些miRNA可能促使ER陽(yáng)性細(xì)胞向ER陰性細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。

3 乳腺癌生物學(xué)行為相關(guān)的miRNA

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移所致的并發(fā)癥是惡性腫瘤死亡的重要原因，而腫瘤的轉(zhuǎn)移是多步驟、復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可調(diào)節(jié)乳腺癌轉(zhuǎn)移的多個(gè)關(guān)鍵步驟，如上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT）、凋亡及血管生成等過(guò)程。EMT是上皮細(xì)胞獲得遷移能力的重要方式，miR－200家族及miR－205可通過(guò)作用于Zeb1及Zeb2而調(diào)節(jié)EMT過(guò)程，miR－205可抑制 MCF－7增殖，并可抑制 MDA－MB－231細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［15］。多數(shù)研究也證實(shí)miR－200家族可抑制體外培養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力［16］。miR－9的作用靶點(diǎn)為E－鈣粘蛋白，E－鈣粘蛋白表達(dá)缺失常伴隨有EMT的發(fā)生，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MYC及MYCN可直接調(diào)節(jié)miR－9，過(guò)表達(dá)miR－9，促進(jìn)細(xì)胞增殖，侵襲，并誘導(dǎo)移植瘤的血管生成。Valastyan等［17］研究證實(shí)，miR－31在正常乳腺細(xì)胞中表達(dá)，而在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)缺失，過(guò)表達(dá)miR－31可以抑制轉(zhuǎn)移發(fā)生的多個(gè)步驟，與之相反，在非轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中使miR－31表達(dá)缺失，則可增加細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，miR－31可作用其靶點(diǎn)ITGA5、RDX及RhoA，當(dāng)靶基因表達(dá)水平下降時(shí)，患者的生存期延長(zhǎng)。Zhu等［18］通過(guò)對(duì)2種乳腺癌模型（MCF－7及 MDA－MB－231）的對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)與MCF－7乳腺癌模型不同的是，miR－21并不影響 MDA－MB－231乳腺癌模型中原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)，但能夠促進(jìn)細(xì)胞的侵襲以及肺轉(zhuǎn)移，這可能是通過(guò)下調(diào)其它的腫瘤抑制因子而發(fā)揮作用。MUC1是由muc1基因表達(dá)的一種高糖基化蛋白。它參與上皮更新及分化，在維持上皮完整性和腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移等方面都起到重要的作用。Sachdeva等［19］研究表明miR－145直接調(diào)節(jié)muc1基因的表達(dá)，從而下調(diào)β連環(huán)蛋白、細(xì)胞周期素D和粘鈣蛋白，對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移起到抑制作用，因此，上調(diào)miR－145的表達(dá)可以減少乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。最近，Baffa等［20］通過(guò)miRNA微陣列分析43對(duì)原發(fā)腫瘤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤中異常表達(dá)的miRNA，分析顯示32個(gè)miRNA差異表達(dá)，其中包括在轉(zhuǎn)移瘤中明顯上調(diào)的miR－10b和miR－21以及下調(diào)的miR－141、miR－200b、miR－200c和 miR－205等。

綜上，miRNA可通過(guò)上調(diào)或下調(diào)基因的表達(dá)在腫瘤轉(zhuǎn)移的多個(gè)步驟發(fā)揮作用，從而成為腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià)及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)，通過(guò)抑制促轉(zhuǎn)移miRNA或增加抑制轉(zhuǎn)移miRNA的表達(dá)，從而在治療乳腺癌轉(zhuǎn)移方面提供新的策略。

4 乳腺癌多藥耐藥相關(guān)的miRNA

腫瘤的多藥耐藥（MDR）是目前抗腫瘤治療中面臨的嚴(yán)重問(wèn)題，MDR的出現(xiàn)使腫瘤不僅對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥，而且對(duì)其它化學(xué)結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制不同的多種化療藥物產(chǎn)生交叉，廣譜的耐藥性。乳腺癌多藥耐藥主要與細(xì)胞相關(guān)蛋白、雌激素受體及信號(hào)通路等改變有關(guān)，隨著對(duì)miRNA研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在MDR的產(chǎn)生中發(fā)揮著重要的作用。

4.1 miRNA調(diào)控乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）

乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）與乳腺癌的多藥耐藥關(guān)系密切，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行基因敲除或化學(xué)抑制，發(fā)現(xiàn)BCRP可以限制腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物堆積，而許多miRNA可以對(duì)其進(jìn)行調(diào)控。Li等［21］研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌耐藥細(xì)胞株 MCF－7／MX100，轉(zhuǎn)染 miR－328或miR－519c后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)米托蒽醌顯著增加，進(jìn)一步研究證實(shí)，miR－328和 miR－519c可通過(guò)靶向作用于BCRP的3＇－UTR區(qū)，從而下調(diào)BCRP的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR－520h后，BCRP的表達(dá)量并未發(fā)生明顯改變。而Pelletier等［22］研究證實(shí)某些miRNA可以干擾BCRP的3＇－UTR區(qū)多態(tài)性，從而改變其與3＇－UTR的結(jié)合能力，影響乳腺癌耐藥性的產(chǎn)生。

4.2 miRNA調(diào)控P糖蛋白（P－gp）

P糖蛋白（P－gp）過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致藥物外排，是參與乳腺癌多藥耐藥性產(chǎn)生的經(jīng)典機(jī)制之一。Kovalchuk等［23］研究發(fā)現(xiàn)，耐阿霉素的乳腺癌細(xì)胞 MCF－7／DOX中miR－451表達(dá)水平下降，并且調(diào)節(jié)miR－451活性的酶Dicer及Argonaute2表達(dá)失調(diào)，而MDR1及P－gp的表達(dá)增加，轉(zhuǎn)染miR－451后，可增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，提示miR－451能負(fù)向調(diào)節(jié)P－gp的表達(dá)，從而恢復(fù)耐藥細(xì)胞的敏感性。而zhu等［24］研究與之相反，miR－451在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)具有差異性，miR－451上調(diào)P－gp的mRNA及蛋白的表達(dá)，從而增加卵巢癌細(xì)胞A2780的耐藥性。

4.3 miRNA調(diào)控多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）

MRP對(duì)乳腺癌多藥耐藥性也很重要，Liang等［25］研究證實(shí)，miR－326可參與調(diào)控MRP的表達(dá)，從而參與乳腺癌的多藥耐藥，該研究通過(guò)芯片篩查了MRP高表達(dá)的乳腺癌耐藥細(xì)胞株 MCF－7／VP及親本細(xì)胞 MCF－7，發(fā)現(xiàn)多種miRNA表達(dá)具有差異性，如 miR－326、miR－429、miR－187、miR－7、miR－92、miR197等，其中miR－326顯著低表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR－326可作用于 MRP mRNA的3＇－UTR區(qū)，轉(zhuǎn)染 miR－326可提高 MCF－7／VP對(duì)化療藥物的敏感性。Pogribny等［26］在探討耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF－7／CDDP及親本細(xì)胞 MCF－7，是否存在相應(yīng)的miRNA能夠針對(duì)藥物輸出泵的潛在靶點(diǎn)，該研究發(fā)現(xiàn)miR－7及miR－345能夠直接作用于 MRP1基因的3＇－UTR區(qū)，將 miR－7及 miR－345轉(zhuǎn)染到耐藥細(xì)胞株 MCF－7／CDDP，可以使 MRP1含量顯著下降，明顯提高對(duì)順鉑的敏感性。

4.4 miRNA參與乳腺癌多藥耐藥的其它機(jī)制

14－3－3ζ蛋白是14－3－3蛋白家族的一員，可與多種靶蛋白結(jié)合，通過(guò)與配體蛋白相互作用，對(duì)細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡和多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮調(diào)控作用。Anna等［27］研究發(fā)現(xiàn)14－3－3ζ在他莫昔芬耐藥的乳腺癌細(xì)胞 MCF－7（TamR）中表達(dá)上調(diào)，而miR－451顯著下調(diào)，并且經(jīng)他莫昔芬處理后，對(duì)14－3－3ζ上調(diào)及miR－451下調(diào)的作用呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性，進(jìn)一步使用熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)miR－451可靶向作用于14－3－3ζ的3＇－UTR區(qū)，轉(zhuǎn)染 miR－451后，可通過(guò)下調(diào)14－3－3ζ、p－MAPK及p－AKT等途徑，恢復(fù)耐藥細(xì)胞的敏感性。Zhao等［28］研究發(fā)現(xiàn)miR－221和miR－222可直接調(diào)節(jié)ERα，其在ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，可降低細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的敏感性。Miller等［29］研究也發(fā)現(xiàn)在他莫昔芬耐藥的MCF－7細(xì)胞系中miR－221和miR－222過(guò)表達(dá)，并且和HER2＋的乳腺腫瘤的內(nèi)分泌治療耐藥相關(guān)。Erik等［30］發(fā)現(xiàn) miR－519c可以調(diào)節(jié) BCRP的表達(dá)，miR－21和miR－214可作用于PTEN，從而調(diào)節(jié)PI3K／AKT信號(hào)通路。

展望

miRNA作為促癌或抑癌因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥等方面發(fā)揮著重要的作用，特異性惡性腫瘤相關(guān)的miRNA編碼基因的發(fā)現(xiàn)，為腫瘤治療提供了新的策略。基于miRNA的診療手段，如利用特異性miRNA早期診斷乳腺癌，在已發(fā)生轉(zhuǎn)移或產(chǎn)生耐藥性的乳腺癌患者中，運(yùn)用miRNA靶向治療控制腫瘤發(fā)展及逆轉(zhuǎn)耐藥性，指導(dǎo)術(shù)前分期及手術(shù)后化療方案的制定等，都需要對(duì)miRNA的作用靶點(diǎn)及機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)深入的研究。

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