蕹菜葉過(guò)氧化物酶功能基團(tuán)的化學(xué)修飾

王紅揚(yáng)，　孫才云，　黃　忙，　唐云明（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶400715）

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蕹菜葉過(guò)氧化物酶功能基團(tuán)的化學(xué)修飾

王紅揚(yáng)，孫才云，黃忙，唐云明*
（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶400715）

摘要：為研究蕹菜葉面的的功能基團(tuán)，將分離純化得到的電泳純的蕹菜過(guò)氧化物酶，分別用乙酰丙酮、順丁烯二酸酐，二巰基蘇糖醇、氯胺-T、溴代乙酸、對(duì)氯汞苯甲酸、苯甲基磺酰氟、N-乙酰咪唑選擇性地對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾，并測(cè)定修飾前后酶活力變化。結(jié)果表明：精氨酸殘基、賴氨酸殘基、組氨酸殘基和巰基可能是蕹菜過(guò)氧化物酶發(fā)揮活性的必需基團(tuán)，而甲硫氨酸硫醚基、絲氨酸殘基和酪氨酸酚羥基可能不是蕹菜過(guò)氧化物酶活性中心的必需基團(tuán)。

關(guān)鍵詞：蕹菜；過(guò)氧化物酶；功能基團(tuán)；化學(xué)修飾

過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）是一類(lèi)在生物體內(nèi)普遍存在的以血紅素為輔基可催化由過(guò)氧化氫（H2O2）參與的氧化還原反應(yīng)的氧化酶，例如參與胺類(lèi)[1]和酚類(lèi)[2]化合物的氧化反應(yīng)。POD作為一種抗氧化劑，參與分解吲哚乙酸[3]、合成木質(zhì)素[4]和植物體內(nèi)防御反應(yīng)[5]等多種生理反應(yīng)。當(dāng)今，該酶不僅廣泛用于免疫印跡[6]、酶聯(lián)反應(yīng)[7]和電鏡技術(shù)[8]等生物學(xué)研究，而且在污水處理[9]、生物傳感器[10]等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)共同決定其生物活性，在大多數(shù)情況下，蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變將導(dǎo)致生物活性的下降，甚至完全喪失[11]。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾中側(cè)鏈基團(tuán)的修飾是最成熟、最廣泛使用的技術(shù)，包括巰基修飾、氨基修飾、羧基修飾和其它側(cè)鏈修飾。因此，作者采用特定的化學(xué)修飾劑，分別為乙酰丙酮、二硫蘇糖醇、氯汞苯甲酸、順丁烯二酸酐、氯胺-T、苯甲基磺酰氯、N-乙酰咪唑和溴乙酸，破壞或者掩蔽側(cè)鏈基團(tuán)，通過(guò)測(cè)定該蛋白酶的酶活力是否受到抑制，判斷該側(cè)鏈基團(tuán)與該酶發(fā)揮活性的必需基團(tuán)的關(guān)系。由于該酶的主要來(lái)源辣根生長(zhǎng)條件苛刻，在我國(guó)種植范圍有限，價(jià)格昂貴，因此選取蕹菜這種種植范圍廣、產(chǎn)量高的植物作為提取原料分離純化過(guò)氧化物酶，并且對(duì)其功能基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，為深入了解其理化性質(zhì)及進(jìn)一步大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

作者所在實(shí)驗(yàn)室分離純化得到的蕹菜葉過(guò)氧化物酶純品，其中該酶的比活力為35 972.96 U/mg。

1.2主要試劑與設(shè)備

對(duì)氯汞苯甲酸：Sigma公司產(chǎn)品；苯甲基磺酰氟：Merck公司產(chǎn)品；溴代乙酸、二巰基蘇糖醇、乙酰丙酮、順丁烯二酸酐、氯胺-T、N-乙酰瞇唑以及其余試劑：國(guó)產(chǎn)分析純。UV-2550分光光度計(jì)：島津；Mill-Q plus超純水儀：Millipore；SevenEasy精密pH計(jì)：Mettler-Toledo。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

分別配置濃度為10 mmol/L的NAI、BD、pCMB、PMSF、BrAc、DTT、順丁烯二酸酐、氯胺-T溶液，作為母液。參考陳貽竹[12]等的方法，反應(yīng)體系為3 mL，包括2.775 mL、50 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）、0.1 mL、1% H2O2、0.1 mL 4%愈創(chuàng)木酚和0.025 mL酶液。將各種母液按一定比例分別加入到測(cè)酶活力緩沖體系中，得到不同濃度的化學(xué)修飾劑溶液，最后加入蕹菜POD，25℃下作用30 min后，測(cè)定過(guò)氧化物酶的活性。

酶活測(cè)定過(guò)程如下：在加入底物和緩沖液后，再加入0.025 mL酶液并混勻，在25℃下測(cè)定2 min 內(nèi)OD470的變化值。以測(cè)定條件下每分鐘光吸收值變化0.01所需要的酶量作為一個(gè)酶活力單位（U）。以相同條件下不加化學(xué)修飾劑時(shí)測(cè)得的酶活力作為100%對(duì)照。

2　結(jié)果與分析

2.1精氨酸胍基的化學(xué)修飾

在堿性條件下，蛋白質(zhì)分子中的精氨酸殘基與乙酰丙酮（BD）能夠特異性地作用，影響側(cè)鏈基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變整個(gè)蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。在pH 8條件下，用乙酰丙酮（BD）處理蕹菜POD，結(jié)果表明：隨著乙酰丙酮（BD）濃度的增大，酶活力逐漸下降，當(dāng)濃度達(dá)到5 mmol/L時(shí)，活力只剩50%左右，見(jiàn)圖1。由此說(shuō)明精氨酸殘基可能是蕹菜葉POD活性中心的必需基團(tuán)。

圖1　BD濃度對(duì)蕹菜葉POD酶活力的影響Fig. 1　 Effect of BD on activity of POD from Ipomoea aquatica Forsk leaves

2.2賴氨酸殘基的化學(xué)修飾

順丁烯二酸酐與蛋白質(zhì)氨基酸殘基側(cè)鏈上的氨基相互作用，可以與氨基共價(jià)結(jié)合或者發(fā)生脫氨基作用，從而將氨基屏蔽起來(lái)[13]。結(jié)果表明：隨著濃度的增大，酶活逐漸降低。說(shuō)明賴氨酸殘基有可能是該酶活性中心的必需基團(tuán)，見(jiàn)圖2。

圖2　順丁烯二酸酐濃度對(duì)蕹菜葉POD酶活力的影響Fig. 2 Effect of maleic anhydride on activity of POD from Ipomoea aquatica Forsk leaves

2.3組氨酸殘基的化學(xué)修飾

溴乙酸（BrAc）在偏酸性的條件下與組氨酸中的咪唑基相互作用，生成羧甲基衍生物[14]。在pH 6條件下，用溴乙酸（BrAc）處理蕹菜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著B(niǎo)rAc濃度的增加，酶活力急劇降低，當(dāng)BrAc濃度為0.3 mmol/L時(shí)，酶活接近于0。由此說(shuō)明組氨酸殘基可能是該酶活性中心的必需基團(tuán)，見(jiàn)圖3。

圖3　BrAc濃度對(duì)蕹菜葉POD酶活力的影響Fig. 3 Effect of BrAc on activity of POD from Ipomoea aquatica Forsk leaves

2.4巰基的化學(xué)修飾氯汞苯甲酸（pCMB）做為巰基的常用修飾劑[15]，在酸性條件下，與蛋白質(zhì)分子中的巰基反應(yīng)。在pH 5條件下，用氯汞苯甲酸（pCMB）處理蕹菜POD。隨著氯汞苯甲酸（pCMB）濃度的增大，酶活急劇降低，在pCMB濃度為0.5 mmol/L時(shí)，酶活幾乎為零。說(shuō)明巰基很有可能是該酶活性中心的必需基團(tuán)，見(jiàn)圖4。

圖4　pCMB濃度對(duì)蕹菜葉POD酶活力的影響Fig. 4 Effect of pCMB on activity of POD from Ipomoea aquatica Forsk leaves

2.5甲硫氨酸硫醚基的化學(xué)修飾

氯胺-T能在堿性條件下與甲硫氨酸的硫醚基相互作用。當(dāng)pH 8時(shí)，用氯胺-T處理蕹菜POD，結(jié)果表明：氯胺-T對(duì)酶活無(wú)影響，說(shuō)明甲硫氨酸硫醚基可能不是該酶活性中心的必需基團(tuán)，見(jiàn)圖5。

圖5　氯胺-T濃度對(duì)蕹菜葉POD酶活力的影響Fig. 5 Effect of Chloramine-T on activity of POD from Ipomoea aquatica Forsk leaves

2.6絲氨酸殘基的化學(xué)修飾

苯甲基磺酰氟（PMSF）可以與蛋白質(zhì)中的絲氨酸殘基相互作用[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：PMSF對(duì)蕹菜葉POD酶活幾乎無(wú)影響，說(shuō)明絲氨酸殘基可能不是該酶活性中心的必需基團(tuán)，見(jiàn)圖6。

圖6　PMSF濃度對(duì)蕹菜葉POD酶活力的影響Fig. 6 Effect of PMSF on activity of POD from Ipomoea aquatica Forsk leaves

2.7酪氨酸酚羥基的化學(xué)修飾

N-乙酰咪唑（NAI）能對(duì)蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的酚羥基進(jìn)行修飾，從而改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和特性[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：N-乙酰咪唑（NAI）對(duì)蕹菜葉POD活性幾乎無(wú)影響，見(jiàn)圖7。由此說(shuō)明酪氨酸的酚羥基可能不是該酶活性中心的必需基團(tuán)。

2.8二硫鍵的化學(xué)修飾

巰基化合物二硫蘇糖醇（DTT）是一種強(qiáng)的還原劑，能特異性的與蛋白質(zhì)中二硫鍵作用，阻止半胱氨酸之間形成分子內(nèi)或分子間二硫鍵，并穩(wěn)定了蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基。當(dāng)DTT濃度升高時(shí)，酶活力逐漸升高，進(jìn)一步說(shuō)明巰基很有可能是蕹菜POD活性中心的必需結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖8。

圖7　NAI濃度對(duì)蕹菜葉POD酶活力的影響Fig. 7 Effect of NAI on activity of POD from Ipomoea aquatica Forsk leaves

圖8　DTT濃度對(duì)蕹菜葉POD酶活力的影響Fig. 8 Effect of DDT on activity of POD from Ipomoea aquatica Forsk leaves

3　結(jié)語(yǔ)

蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)共同決定其生物活性，如果其化學(xué)結(jié)構(gòu)不變，而空間結(jié)構(gòu)遭到破壞從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的喪失，稱為蛋白質(zhì)變性或去折疊；反之，如果蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變才稱為蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾。在有些情況下，蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)改變并不影響本身的活性，這些修飾是非必需部分的修飾。但是在大多數(shù)情況下，蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變將導(dǎo)致生物活性的下降，甚至完全喪失[11]。因此，為了分析蛋白質(zhì)中處于活性部位并為蛋白質(zhì)發(fā)揮特定功能所必需的氨基酸，人們研制出各種小分子化學(xué)修飾劑。常見(jiàn)的修飾劑包括乙酰咪唑、鹵代乙酸、N-乙基馬來(lái)酰亞胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、聚乙烯吡咯烷酮、乙二酸／丙二酸的共聚物、羧甲基纖維素、乙烯／順丁烯二酰肼共聚物、聚氨基酸、葡聚糖、環(huán)糊精、PEG等[18-19]。

作者利用專一性化學(xué)修飾劑乙酰丙酮（BD）、二巰基蘇糖醇（DTT）、氯胺-T、溴代乙酸（BrAc）、對(duì)氯汞苯甲酸（PCMB）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、N-乙酰咪唑（NAI）分別對(duì)精氨酸殘基、二硫鍵、甲硫氨酸硫醚基、組氨酸殘基、巰基、賴氨酸殘基、絲氨酸、酪氨酸酚羥基進(jìn)行了修飾。結(jié)果表明：精氨酸殘基、賴氨酸殘基、組氨酸殘基和巰基是蕹菜過(guò)氧化物酶發(fā)揮活性的必需基團(tuán)，而甲硫氨酸硫醚基、絲氨酸殘基和酪氨酸酚羥基可能不是蕹菜葉過(guò)氧化物酶活性中心的必需基團(tuán)。

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Chemical Modification of Functional Groups of Peroxidase from Leaves of Ipomoea aquatica Forsk

WANG Hongyang，SUN Caiyun，HUANG Mang，TANG Yunming*
（School of Life Science，Southwest University，Chongqing 400715，China）

Abstract：In order to identify the functional groups of peroxidase from the leaves of Ipmoea aquatica Forsk，peroxidas were isolated，purifiedandselectively modified by using BD，DTT，pCMB，Maleic anhydride，Chloramine-T，PMSF，NAI and BrAc separately and the change on activity were determined. The result showed that Arg，Lys，His and sulfhydryl involving in the composition of the enzyme active center should be considered as indispensable functional groups of peroxidase，while Met，Ser and Tyr residues should not be because they were not directly related to the activity of peroxidase from Ipomoea aquatica Forsk.

Keywords：Ipomoea aquatica Forsk，peroxidase，functional groups，chemical modification

*通信作者：唐云明（1960—），男，四川武勝人，農(nóng)學(xué)博士，教授，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程方面的研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn

基金項(xiàng)目：重慶市重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（CSTC，2011AB1027）。

收稿日期：2014-07-29

中圖分類(lèi)號(hào)：Q 55

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）02—0192—05