纈沙坦對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟TRPC6表達(dá)的影響

任直親，范慧，李芳芳青島市中心醫(yī)院腎病消化內(nèi)科，山東青島　266300

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纈沙坦對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟TRPC6表達(dá)的影響

任直親，范慧，李芳芳
青島市中心醫(yī)院腎病消化內(nèi)科，山東青島266300

［摘要］目的探討纈沙坦對(duì)糖尿病腎病（DN）大鼠腎臟TRPC6表達(dá)的影響。方法高脂高糖喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐霉素建立DN模型，將模型大鼠隨機(jī)分為兩組:模型對(duì)照組（DN組）與纈沙坦治療組（DV組），另設(shè)正常對(duì)照組（NC組）。干預(yù)8周末測生化指標(biāo)及24 h尿蛋白，光鏡觀察大鼠腎臟病理改變，免疫組化法測腎臟Nephrin、TRPC6表達(dá)并作半定量分析。結(jié)果與NC組相比DN組大鼠表現(xiàn)為高血糖、高血脂、胰島素抵抗和蛋白尿，病理出現(xiàn)系膜基質(zhì)增多，Nephrin表達(dá)減低而TRPC6表達(dá)增高。經(jīng)纈沙坦治療后Nephrin表達(dá)增加，TRPC6表達(dá)顯著降低。TRPC6與尿蛋白呈正相關(guān)，Nephrin的與尿蛋白呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論DN大鼠腎臟出現(xiàn)足細(xì)胞損傷和TRPC6表達(dá)增加，纈沙坦可通過下調(diào)TRPC6的表達(dá)而發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用。

［關(guān)鍵詞］纈沙坦；糖尿病腎??；TRPC6

足細(xì)胞損傷是糖尿病腎?。―N）發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。足細(xì)胞裂孔隔膜是腎小球?yàn)V過屏障的關(guān)鍵組成部分，瞬時(shí)受體電位陽離子通道蛋白6（TRPC6）是新近發(fā)現(xiàn)的裂孔隔膜蛋白，目前研究表明TRPC6是血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡過程中的重要分子，參與DN發(fā)生發(fā)展。目前纈沙坦對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織TRPC6的表達(dá)有何影響，國內(nèi)外報(bào)道較少。該研究觀察DN大鼠腎臟Nephrin、TRPC6的表達(dá)以及纈沙坦對(duì)其表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑

纈沙坦。STZ:用前溶解在0.01 mL/L枸櫞酸緩沖液中，pH4.5。血胰島素（INS）試劑盒。Nephrin、TRPC6（兔抗人多克隆抗體）。免疫組化試劑盒。

1.2動(dòng)物模型建立和分組

雄性SD大鼠50只，體重（200±20）g，隨機(jī)分為模型組（高糖高脂喂養(yǎng)，n=40）和正常對(duì)照組（NC組，n=10）。NC組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，模型組給予高糖高脂飲食，喂養(yǎng)8周后，模型組大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下予鏈脲佐菌素（STZ，30 mg/kg）一次性腹腔注射。NC組僅注射等量枸櫞酸緩沖液。模型組注射STZ 1周后，測定24 h攝食量、尿量，測定體重、尿白蛋白排泄率（UAL），鼠尾靜脈取血測定空腹血糖（FBG）、胰島素（INS）、血甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、血肌酐（Scr），并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（FBG×INS/22.5，HOMA-IR）。FBG大于正常大鼠血糖均值+3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差（該研究確定該值為FBG≥10.0 mmol/L），胰島素抵抗指數(shù)大于正常均值者為胰島素抵抗。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為兩組:模型對(duì)照組（DN組）和纈沙坦治療組［DV組，纈沙坦50 mg/（kg·d）］。NC組與DN組每日給予等量自來水灌胃。實(shí)驗(yàn)周期為8周。

1.3標(biāo)本檢測

INS按照試劑盒說明書，采用ELISA法測定。FBG、Scr、TG、TC、UAL用自動(dòng)生化分析儀檢測。

1.4腎臟組織病理

光鏡部分:腎組織置中性10%福爾馬林中固定，制成3 μm厚的切片，行常規(guī)HE染色。

1.5免疫組化方法

采用SP免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。一抗為Nephrin、TRPC6多克隆抗體（1: 200，1:150）。棕色為陽性信號(hào)。先低倍鏡下觀察，然后在200倍光鏡下，隨機(jī)分別采集皮質(zhì)區(qū)30個(gè)視野內(nèi)的腎小球，用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，計(jì)數(shù)其積分光密度（IOD）值，取其均值分析。

1.6統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，各組間均數(shù)差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。指標(biāo)之間的關(guān)系采用Peasson直線相關(guān)分析。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠物理及生化指標(biāo)變化

28只大鼠成功造模，出現(xiàn)TG、TC明顯升高及胰島素抵抗，造模成功率70%。DN組TG、TC、KW、KW/BW明顯高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DV組TG、TC、KW、KW/BW比DN組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。DN組UAL明顯高于NC組（P＜0.05），DV組UAL明顯低于DN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1　各組大鼠常規(guī)指標(biāo)的比較（±s）

表1　各組大鼠常規(guī)指標(biāo)的比較（±s）

注:與NC組相比，*P＜0.05；與DN組相比，**P＞0.05；與DN組相比，△P＜0.05。

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2.2腎臟病理學(xué)態(tài)觀察

光鏡檢查結(jié)果:HE染色顯示，與NC組比較DN組表現(xiàn)出腎小球體積增大，腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)增生，腎小球毛細(xì)血管壁狹窄；經(jīng)纈沙坦治療后，以上改變較DN組改善。

2.3免疫組化結(jié)果

NC組可見Nephrin在大鼠腎小球呈線性分布，DN 組nephrin表達(dá)明顯減少，纈沙坦治療后Nephrin表達(dá)上調(diào)。NC組TRPC6在腎小球呈弱表達(dá)，主要分布在腎小球，沿腎小球毛細(xì)血管袢及系膜區(qū)分布，DN組TRPC6表達(dá)顯著增強(qiáng)，纈沙坦治療后腎小球TRPC6表達(dá)明顯下調(diào)，但仍強(qiáng)于NC組。DN組大鼠TRPC6蛋白IOD均值顯著高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。nephrin蛋白IOD均值顯著低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DV組大鼠TRPC6蛋白IOD均值較DN組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但仍高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。nephrin蛋白IOD均值高于DN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但仍低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2　各組大鼠腎小球TRPC6、Nephrin蛋白的比較（x-±s）

2.4相關(guān)性分析

TRPC6與UAL呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r= 0.96，P＜0.01）；Nephrin與UAL呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=-0.88，P＜0.01）。

3　討論

該實(shí)驗(yàn)在南京軍區(qū)總醫(yī)院郭嘯華［1］動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，應(yīng)用高脂高糖喂養(yǎng)8周誘導(dǎo)出胰島素抵抗，再聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射造成胰島β細(xì)胞輕度損傷，同時(shí)減少對(duì)其他臟器損傷，成功建立了2型糖尿病大鼠模型。較符合人類2型糖尿病的發(fā)病過程及代謝特征。

糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，近來研究表明足細(xì)胞損傷是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能異常是DN發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)，Nephrin 及TRPC6為重要的足細(xì)胞膜蛋白并在維系足細(xì)胞正常生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用［2］。越來越多的證據(jù)表明，糖尿病時(shí)腎臟局部的RAS是激活的［3］。作為RAS激活的產(chǎn)物血管緊張素II（Angll）的活性逐漸受到關(guān)注。Tom Nijenhuis研究［4］證實(shí)Ang II通過NFAT信號(hào)通路上調(diào)TRPC6的表達(dá)，引起體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞的損傷。近年大量的研究表明，血管緊張素受體阻斷劑或者血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑可以降低DN患者及糖尿病腎病鼠的尿蛋白，從而延緩DN的進(jìn)展［5］。

為研究DN的發(fā)病機(jī)制及DN早期改變，越來越多的研究關(guān)注糖尿病足細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)。Nephrin可以作為足細(xì)胞損傷的一個(gè)早期指標(biāo)［6］。該研究觀察纈沙坦對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟病理改變和腎組織Nephrin、TRPC6表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DN組大鼠腎組織Nephrin表達(dá)明顯減少，而TRPC6表達(dá)顯著增強(qiáng)，兩者與尿蛋白增加明顯相關(guān)。纈沙坦治療后Nephrin表達(dá)上調(diào)，纈沙坦治療后腎小球TRPC6表達(dá)明顯下調(diào)，蛋白尿明顯減少。提示纈沙坦可能通過調(diào)節(jié)Nephrin、TRPC6的表達(dá)，減輕糖尿病大鼠腎臟足細(xì)胞的損傷，發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用。有關(guān)具體信號(hào)通路機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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［中圖分類號(hào)］R4

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1672-4062（2016）06（a）-0048-02

DOI:10.16658/j.cnki.1672-4062.2016.11.048

收稿日期:（2016-03-07）

［作者簡介］任直親（1986.8-），女，山西運(yùn)城人，碩士研究生，住院醫(yī)師，研究方向:糖尿病腎病。