• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鮭魚甲病毒E1基因高保守區(qū)融合表達(dá)及免疫特性的分析

    2016-07-28 03:12:58唐麗杰喬薪瑗管雪婷姜艷平李一經(jīng)
    淡水漁業(yè) 2016年4期
    關(guān)鍵詞:原核表達(dá)

    蔣 燁,杜 航,唐麗杰,喬薪瑗,王 麗,管雪婷,姜艷平,崔 文,李一經(jīng),劉 敏

    (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,哈爾濱 150030;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030)

    ?

    鮭魚甲病毒E1基因高保守區(qū)融合表達(dá)及免疫特性的分析

    蔣燁1,杜航1,唐麗杰2,喬薪瑗2,王麗2,管雪婷1,姜艷平2,崔文2,李一經(jīng)2,劉敏1

    (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,哈爾濱150030;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱150030)

    摘要:根據(jù)GenBank中公布的鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus,SAV)SAV 1、SAV 2和SAV3三個基因型中E1基因,選擇高保守序列702 bp(436-1137)合成基因,命名為SAV E1,將其克隆到原核表達(dá)載體pCold TF中構(gòu)建重組質(zhì)粒。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21中,經(jīng)終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE和Western blot鑒定,重組蛋白均獲得了表達(dá),表達(dá)E1重組蛋白約95 kD。用鎳離子親和層析柱純化重組蛋白,制備抗血清。間接ELISA結(jié)果顯示,鼠抗重組蛋白E1血清效價為1∶25 600;間接免疫熒光結(jié)果顯示,鼠抗重組E1蛋白血清可與SAV發(fā)生特異反應(yīng),由此表明表達(dá)的E1重組蛋白具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性,為SAV檢測方法的建立提供理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus,SAV);E1高保守蛋白;原核表達(dá);免疫特性

    鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus,SAV)隸屬于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus),主要感染大西洋鮭(salmosalar)和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)引起胰腺、心肌炎癥和昏睡等癥狀,致死率達(dá)1%~48%,并在水產(chǎn)養(yǎng)殖的各個階段均有爆發(fā)[1-2]。自從1995年Nelson等在愛爾蘭成功分離出該病毒,至此已發(fā)現(xiàn)六個基因型(SAV 1、SAV 2、SAV 3、SAV 4、SAV 5、SAV 6)[3-4]。SAV 2、SAV 3可感染虹鱒引起睡病(Sleeping disease,SD);SAV 1、SAV 2、SAV 4、SAV 5、SAV 6基因型可感染大西洋鮭引起胰腺病(Salmon pancreas disease,PD)。目前該病廣泛流行于蘇格蘭、挪威、愛爾蘭、法國等歐洲國家,據(jù)統(tǒng)計從1995年至2007年發(fā)病率逐年增加高達(dá)90%,每年由此疫病造成巨大的經(jīng)濟損失[5-6]。雖然我國目前尚未發(fā)現(xiàn)該病,但是隨著近年我國對鮭科魚類進(jìn)口的增加,該病傳入我國的風(fēng)險也日益增大,因此有必要盡早建立對鮭魚甲病毒快速靈敏的檢測方法,防止該病傳入我國。

    SAV病毒粒子呈球形,有囊膜,直徑為(65.5 ±4.3)nm[7],能夠通過敏感細(xì)胞系大鱗大馬哈魚(O.tshawytscha)胚胎細(xì)胞(CHSE-214)進(jìn)行分離和繁殖[8]。SAV是單股正鏈RNA病毒,基因組長11~12 kb,含有兩個開放閱讀框。其中3′ 端開放閱讀框編碼26S子基因的mRNA,最終產(chǎn)生5個結(jié)構(gòu)蛋白,依次是衣殼蛋白,糖蛋白E3和E2、6K和E1,已被證實衣殼蛋白、E1和E2在病毒復(fù)制時被表達(dá),其中衣殼蛋白構(gòu)成病毒的衣殼,E3、E2、6K和E1共同構(gòu)成了病毒的包膜糖蛋白。E2和E1為跨膜蛋白暴露于病毒粒子表面,E1和E2形成異源二聚體,E2位于遠(yuǎn)端并且最有可能同細(xì)胞的受體互作[9-10]。E2上有絕大部分的中和抗原決定簇,它的作用是識別并同細(xì)胞表面的受體結(jié)合;而E1中含有較多保守和交叉反應(yīng)性的抗原決定簇[11],各亞型之間E1蛋白具有很強的保守性,其中436~1137 bp這段基因在各亞型之間100%保守。

    大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成熟完善,具有繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定,目的基因表達(dá)水平高,抗污染能力強等優(yōu)點,被廣泛引用于重組蛋白藥物的研究和生產(chǎn)[12-13]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)載體眾多,筆者曾嘗試多種表達(dá)載體表達(dá)E1蛋白,如pProEX HTa、Pgex-6p-1和pET系列,但都未獲得可溶形式的重組蛋白。本研究利用原核表達(dá)載體pCold TF表達(dá)SAV E1蛋白的高保守區(qū)(702 bp),獲得可溶形式的重組蛋白E1,并制備抗血清,并初步研究重組蛋白E1的免疫特性,為E1蛋白在SAV檢測方面的研究奠定基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1實驗材料

    1.1.1毒株、菌株和質(zhì)粒

    SAV1(V4640)毒株由英國蘇格蘭海洋實驗室饋贈;CHSE-214、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TG1、BL21和pCold TF均由本實驗室保存。

    1.1.2主要試劑

    辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、異硫氰酸突光素(FITC)標(biāo)記羊抗鼠IgG和HIS標(biāo)簽抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

    1.2SAV E1保守基因的設(shè)計合成

    根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫已公布的SAV E1基因的基因序列及其蛋白空間構(gòu)象,分析其同源序列及保守區(qū)域,選取其共保守序列,設(shè)計了共737 bp的DNA序列,包括上下游酶切位點EcoRI、XbaI,終止密碼子,其中編碼E1基因的堿基702 bp(436~1137 bp),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,并連接到克隆載體pUC57。

    1.3重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-E1的構(gòu)建

    重組質(zhì)粒pUC57-E1與原核表達(dá)載體pCold TF,分別用EcoRI、XbaI雙酶切,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后,用膠回收純化試劑盒切膠回收兩段目的基因,將E1與pCold TF用T4DNA連接酶連接,16 ℃連接12 h,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)中,涂布于含有50 g/mL的Amp+LB平板上,待菌液全部被培養(yǎng)基吸收后放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi),倒置培養(yǎng)12 h。挑取單個菌落提質(zhì)粒,進(jìn)行單、雙酶切鑒定。

    1.4重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-E1的鑒定

    隨機挑取LB轉(zhuǎn)化平板中的若干菌落,接種于5 mL含100 g/mL Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h,提取質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒pCold TF-E1進(jìn)行EcoRI和XbaI單、雙酶切鑒定。0.8%瓊脂糖凝膠電泳觀察單雙酶切得到的目的片段大小是否與預(yù)期大小相符。測序確定E1基因是否正確的插入到pCold TF載體中。

    1.5重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定

    重組質(zhì)粒pCold TF-E1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中后,挑取轉(zhuǎn)化子至含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)物按1%的接種量接入10 mL LB培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約0.4時,取1 mL菌液作未誘導(dǎo)對照,剩余菌液添加IPTG至1 mmol/L,重組大腸桿菌pCold-E1/BL21,16 ℃,200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜,菌液經(jīng)超聲破碎后,制備蛋白樣品,用于SDS-PAGE檢測分析。用鎳離子親和層析柱純化重組蛋白。

    將制備好的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜,用HIS標(biāo)簽抗體作為一抗,進(jìn)行Western-blot鑒定。

    1.6抗血清的制備

    將純化好的蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合充分乳化,腹腔注射6~8周齡BALB/c雌鼠,每只小鼠100 g,分離接種前鼠尾靜脈血清作為陰性對照。第一次免疫14 d后,用純化好的蛋白與等量的弗氏不完全佐劑混合充分乳化進(jìn)行第二次免疫;之后再隔14 d后用第二次免疫的方法對小鼠進(jìn)行第三次免疫。第三次免疫后第7天小鼠眼球采血,無菌分離血清,-80 ℃保存。

    1.7抗體效價的測定

    用重組E1蛋白作為抗原包被ELISA板,用制備好的鼠抗E1蛋白血清和鼠陰性血清作為一抗,HPR標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為二抗,OPD避光顯色。結(jié)果判定:當(dāng)P/N(陽性血清OD490 nm值-空白孔OD490 nm值)/(陰性血清OD490 nm值-空白孔OD490 nm值)>2時,此孔記為陽性孔,陽性血清的最大稀釋度即為血清抗體效價。

    1.8間接免疫熒光(IFA)檢測免疫原性

    將無菌玻片放于6孔板中,將CHSE-214細(xì)胞接種于6孔板,使其長成致密單層。常規(guī)方法接種SAV1,同時設(shè)正常細(xì)胞對照。15 ℃培養(yǎng)7 d后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,用4%多聚甲醛室溫固定30 min,PBS洗滌3次,每次5 min;每孔加入2%Triton-100,37 ℃10 min,PBS洗滌3次,每次5 min;每孔加入1%BSA,37 ℃封閉1 h,PBS洗滌3次,每次5 min;加入鼠抗E1蛋白血清,37 ℃孵育1h,PBS洗滌3次,每次5 min;加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶5000),37 ℃避光孵育30 min,PBST洗滌3次,每次5 min;在免疫熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

    2結(jié)果與分析

    2.1重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-E1的單、雙酶切鑒定

    重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-E1用EcoRI或XbaI單酶切得到6 600 bp的片段,EcoRI和XbaI雙酶切得到5 800 bp和780 bp的目的片段(見圖1);結(jié)果表明已獲得攜帶有目的基因E1的重組質(zhì)粒。

    圖1 重組質(zhì)粒pCold-E1酶切鑒定結(jié)果

    M:DNA Marker8000bp;1:EcoRI單酶切結(jié)果;2:XbaI單酶切結(jié)果;3:EcoRI XbaI雙酶切結(jié)果

    2.2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

    重組表達(dá)載體pCold TF-E1中E1基因與His標(biāo)簽、分子伴侶融合表達(dá),His標(biāo)簽蛋白分子量約6 KD,分子伴侶蛋白分子量48 KD,目的蛋白E1約為29 KD,以及HRV 3C蛋白酶、凝血酶,則融合蛋白分子量大小約為95 KD。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在約95 KD處出現(xiàn)明顯的條帶,即為目的蛋白(見圖2)。對誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行超聲破碎,pCold-E1/BL21表達(dá)的蛋白主要存在于破碎上清,而破碎后的沉淀里只含有很少的一部分,表達(dá)形式為可溶形式。

    圖2 pCold-E1/BL21SDS-PAGE表達(dá)鑒定

    M:蛋白Marker;1:pCold-E1/BL21誘導(dǎo)前菌體; 2:pCold-E1/BL21誘導(dǎo)后菌體; 3:pCold-E1/BL21超聲后上清; 4:pCold-E1/BL21超聲后沉淀;

    將重組E1蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上,與抗His標(biāo)簽的單抗室溫作用2 h,再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG室溫作用2 h,ECL顯色液顯色后,可在預(yù)期位置觀察到明顯的特異性條帶,表明制備的重組E1蛋白表達(dá)(見圖3)。

    圖3 pCold-E1/BL21Western blot表達(dá)鑒定

    M:蛋白Marker;1:pCold-E1/BL21誘導(dǎo)前菌體;2:pCold-E1/BL21誘導(dǎo)后菌體;

    2.3抗體效價的測定

    將重組E1蛋白作為抗原,免疫前的鼠血清作為陰性血清,制備的鼠抗E1血清作為待檢樣品,進(jìn)行間接ELISA實驗。結(jié)果表明,制備的鼠抗E1血清與相應(yīng)的重組E1蛋白有較強的反應(yīng)性,血清最大稀釋度為1∶25 600,即為鼠抗E1蛋白血清效價(見表1)。

    2.4間接免疫熒光檢測免疫原性

    接種SAV 1的CHSE-214細(xì)胞和未接種病毒的CHSE-214細(xì)胞分別與制備的鼠抗E1血清作用,經(jīng)間接免疫熒光試驗檢測,結(jié)果顯示接種SAV的細(xì)胞能發(fā)出不同程度的綠色熒光,而細(xì)胞對照則未見熒光,說明鼠抗E1血清與SAV發(fā)生特異性反應(yīng)(見圖4)。

    表1 間接ELISA檢測SAV E1蛋白結(jié)果

    圖4 鼠抗E1血清與SAV的間接免疫熒光試驗(100×)

    3討論

    近年來鮭科魚類養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展,各養(yǎng)殖區(qū)之間貿(mào)易頻繁,SAV感染鮭科魚類引起鮭魚胰腺病和暈睡病已經(jīng)擴散至歐洲各國家[14-16],給鮭鱒的養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。我國目前尚未發(fā)現(xiàn)此病的發(fā)生,為防止該病傳入我國,建立 SAV 的快速、靈敏、特異的檢測方法,對防范外來水生動物疫病的傳入工作的開展尤為重要。

    建立特異靈敏的檢測方法,首先需要制備高效的檢測試劑。E1蛋白是SAV的結(jié)構(gòu)蛋白,大小為461個氨基酸,為跨膜糖蛋白暴露于病毒粒子表面。各基因型之間E1蛋白98%以上的氨基酸保守,其中436~1137 bp這段基因在各亞型之間100%保守,且沒有糖基化位點[17]。因此,選擇SAV各基因型E1蛋白(436~1137 bp)基因進(jìn)行原核表達(dá),制備的檢測試劑可以檢測已發(fā)現(xiàn)六個基因型的SAV。

    以純化的SAV病毒作為檢測試劑,存在操作繁鎖、穩(wěn)定性差、產(chǎn)量低、成本高和生物安全隱患等方面問題[18]。原核表達(dá)系統(tǒng)作為成熟的操作系統(tǒng),具有成本低、表達(dá)量高、操作簡單、穩(wěn)定性好等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于診斷試劑制備、蛋白功能研究和亞單位疫苗的生產(chǎn)等方面[19]。

    本研究將SAV E1 436~1137 bp這段高保守基因pCold TF表達(dá)載體連接并構(gòu)建重組表達(dá)系統(tǒng),獲得的重組pCold TF-E1蛋白作為免疫原免疫小鼠,制備抗血清。重組pCold TF-E1蛋白以可溶形式存在,且具有較好的反應(yīng)性,利于后期采用親和層析法純化目的蛋白,在實際應(yīng)用中可縮短生產(chǎn)時間,降低成本。通過間接免疫熒光實驗表明,鼠抗E1蛋白血清可與SAV發(fā)生特異反應(yīng),表明制備的可溶重組E1蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。這為E1高保守區(qū)蛋白作為SAV的檢測試劑及檢測SAV方法的建立提供了理論依據(jù)。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Crane M,Hyatt A.Viruses of fish:An overview of significant pathogens[J].Viruses,2011,3(12):2025-2046.

    [2]Jansen M D,Taksdal T,Wasmuth M A,et al.Salmonid alphavirus (SAV) and pancreas disease (PD) in Atlantic salmon,SalmosalarL.,in freshwater and seawater sites in Norway from 2006 to 2008[J].J Fish Dis,2010,33(5):391-402.

    [3]Fringuelli E,Rowley H M,Wilson J C,et al.Phylogenetic analyses and molecular epidemiology of European salmonid alphaviruses (SAV) based on partial E2 and nsP3 gene nucleotide sequences[J].J Fish Dis,2008,31(11):811-823.

    [4]Graham D A,F(xiàn)rost P,McLaughlin K,et al.A comparative study of marine salmonid alphavirus subtypes 1-6 using an experimental cohabitation challenge model[J].J Fish Dis,2011,34(4):273-286.

    [5]Graham D A,F(xiàn)ringuelli E,Rowley H M,et al.Geographical distribution of salmonid alphavirus subtypes in marine farmed Atlantic salmon,SalmosalarL.,in Scotland and Ireland[J].J Fish Dis,2012,35(10):755-765.

    [6]Braceland M,Bickerdike R,Tinsley J,et al.The serum proteome of Atlantic salmon,Salmosalar,during pancreas disease (PD) following infection with salmonid alphavirus subtype 3 (SAV3)[J].J Proteomics,2013,94:423-436.

    [7]Karlsen M,Villoing S,Rimstad E,et al.Characterization of untranslated regions of the salmonid alphavirus 3 (SAV3) genome and construction of a SAV3 based replicon[J].Virol J,2009,6:173.

    [8]Welsh M,Weston J,Jan Borghmans B,et al.Biochemical characterization of salmon pancreas disease virus[J].J Gen Virol,2000,81(3):813-820.

    [9]Rhême C,Ehrengruber M U,Grandgirard D.Alphaviral cytotoxicity and its implication in vector development[J].Exp Physiol,2005,90(1):45-52.

    [10]Guo T C,Johansson D X,Haugland ?,et al.A 6K-deletion variant of salmonid alphavirus is non-viable but can be rescued through RNA recombination[J].PLoS One,2014,9(7):e100184.

    [11]Metz S W,F(xiàn)eenstra F,Villoing S,et al.Low temperature-dependent salmonid alphavirus glycoprotein processing and recombinant virus-like particle formation[J].PLoS One,2011,6(10):e25816.

    [12]Baneyx F.Recombinant protein expression inEscherichiacoli[J].Curr Opin Biotechnol,1999,10(5):411-421.

    [13]Makrides S C.Strategies for achieving high-level expression of genes inEscherichiacoli[J].Microbiol Rev,1996,60(3):512-538.

    [14]McLoughlin M F,Graham D A.Alphavirus infections in salmonids-a review[J].J Fish Dis,2007,30(9):511-531.

    [15]Weston J,Villoing S,Brémont M,et al.Comparison of two aquatic alphaviruses,salmon pancreas disease virus and sleeping disease virus,by using genome sequence analysis,monoclonal reactivity,and cross-infection[J].J Virol,2002,76(12):6155-6163.

    [16]Karlsen M,Gjerset B,Hansen T,et al.Multiple introductions of salmonid alphavirus from a wild reservoir have caused independent and self-sustainable epizootics in aquaculture[J].J Gen Virol,2014,95(Pt 1):52-59.

    [17]Weston J H,Graham D A,Branson E,et al.Nucleotide sequence variation in salmonid alphaviruses from outbreaks of salmon pancreas disease and sleeping disease[J].Dis Aquat Organ,2005,66(2):105-111.

    [18]Karlsen M,Tingb?T,Solbakk I T,et al.Efficacy and safety of an inactivated vaccine against Salmonid alphavirus (familyTogaviridae)[J].Vaccine,2012,30(38):5688-5694.

    [19]Porowińska D,Wujak M,Roszek K,et al.Prokaryotic expression systems[J].Postepy Hig Med Dosw,2013,67:119-129.

    (責(zé)任編輯:張瀟峮)

    收稿日期:2015-05-19;

    修訂日期:2016-03-25

    第一作者簡介:蔣燁(1988-),男,碩士研究生,專業(yè)方向為水產(chǎn)動物醫(yī)學(xué)。E-mail:356916269@qq.com 通訊作者:劉敏。E-mail:liumin-707@163.com

    中圖分類號:S941.41

    文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

    文章編號:1000-6907-(2016)04-0049-05

    Prokaryotic expression and analysis of a recombinant fusion protein of highly conserved region of salmonid alphavirus E1 gene

    JIANG Ye1,DU Hang1,TANG Li-jie2,QIAO Xin-yuan2,WANG Li2,GUAN Xue-ting1,JIANG Yan-ping2,CUI Wen2,LI Yi-jing2,LIU Min1

    (1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)

    Abstract:Highly conservative sequence of salmonid alphavirus E1 gene (702 bp) was synthesized according to sequences of E1 gene of SAV1,SAV2 and SAV3 published in GenBank.It was cloned into prokaryotic expression vector pCold TF to construct recombinant plasmid.The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 cells.The expression of recombinant plasmid pCold TF in E.coli BL21 was induced using IPTG at 1.0 mmol/L.The target protein of 95 kD was obtained and confirmed by SDS-PAGE and Western blot.The recombinant protein was purified by nickelionaffinity chromatography,and antiserum was produced.Indirect ElISA showed the antiserum against E1protein had OD values at least twice that obtained for the negative control serum at a dilution of 1∶25 600.IFA showed the antiserum against E1 protein reacted specifically with SAV.The results indicated that the recombinant E1 protein was immunogenical and antigenical,which established a foundation for further study on detection method of SAV.

    Key words:salmonid alphavirus,highly conserved E1 protein,prokaryotic expression,immunogenicity

    資助項目:國家科技支撐計劃(2013BAD12B02)

    猜你喜歡
    原核表達(dá)
    丹參蛋白激酶SmSnRK2.4的克隆及表達(dá)分析
    H7亞型禽流感病毒HA基因的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性分析
    結(jié)核分枝桿菌Erp蛋白PGLTS的4基序突變體的構(gòu)建
    棉花GhGGPase2基因克隆、功能序列分析、原核表達(dá)及煙草的遺傳轉(zhuǎn)化
    人FOXA1蛋白的原核表達(dá)、純化及蛋白互作分析
    柑橘CitSERK—LIKE基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
    信號分子與葉銹菌誘導(dǎo)下小麥病程相關(guān)蛋白1基因的表達(dá)分析
    山桃醇腈酶基因PdHNL1的克隆、序列分析與原核表達(dá)
    ShSAP1的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
    水稻抗白葉枯病基因xa5的原核表達(dá)及蛋白純化
    大香蕉久久网| 一区在线观看完整版| 免费av中文字幕在线| 毛片一级片免费看久久久久| 人妻少妇偷人精品九色| 一级爰片在线观看| 欧美三级亚洲精品| 97超视频在线观看视频| 免费观看的影片在线观看| 一级av片app| 两个人免费观看高清视频 | 春色校园在线视频观看| av黄色大香蕉| 国产精品久久久久久久电影| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲国产色片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品一区二区免费观看| 一级毛片我不卡| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 18+在线观看网站| 高清黄色对白视频在线免费看 | 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产免费福利视频在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 男女边摸边吃奶| 亚洲av不卡在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 国产免费又黄又爽又色| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 久久热精品热| 日本vs欧美在线观看视频 | 性色av一级| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品熟女少妇av免费看| 久久99蜜桃精品久久| 国产成人免费观看mmmm| 日本av手机在线免费观看| 婷婷色综合www| 国产精品久久久久久精品古装| 一级爰片在线观看| 久久久国产精品麻豆| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美xxⅹ黑人| 美女主播在线视频| www.色视频.com| 亚洲av.av天堂| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲欧美清纯卡通| 国产 精品1| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 九九爱精品视频在线观看| 久久狼人影院| 男人添女人高潮全过程视频| 18+在线观看网站| 人体艺术视频欧美日本| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 91aial.com中文字幕在线观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产精品欧美亚洲77777| 卡戴珊不雅视频在线播放| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产日韩欧美在线精品| 久久久久久久久久成人| 国产男女超爽视频在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 丰满少妇做爰视频| 亚洲三级黄色毛片| 交换朋友夫妻互换小说| 青青草视频在线视频观看| 久久精品久久久久久久性| 99国产精品免费福利视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久97久久精品| 如何舔出高潮| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲综合色惰| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 高清在线视频一区二区三区| 永久免费av网站大全| 九色成人免费人妻av| 久久精品夜色国产| 久久鲁丝午夜福利片| 最黄视频免费看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 熟妇人妻不卡中文字幕| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 婷婷色综合www| 国产免费又黄又爽又色| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 99九九线精品视频在线观看视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 黄色一级大片看看| 亚洲综合色惰| 少妇 在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 26uuu在线亚洲综合色| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产有黄有色有爽视频| 97在线视频观看| 一级黄片播放器| 午夜福利,免费看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 久久婷婷青草| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产综合精华液| 欧美成人精品欧美一级黄| 波野结衣二区三区在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 久久久久国产网址| 国产一区亚洲一区在线观看| 三级国产精品片| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产一区二区在线观看日韩| 丰满少妇做爰视频| 蜜桃在线观看..| 日本午夜av视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| a级一级毛片免费在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国精品久久久久久国模美| 老熟女久久久| 亚洲精品亚洲一区二区| 色视频在线一区二区三区| 99热这里只有精品一区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲精品国产色婷婷电影| 热re99久久精品国产66热6| 黄色配什么色好看| 国产亚洲91精品色在线| 男人狂女人下面高潮的视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久久人妻精品一区果冻| 久久精品久久久久久久性| 久久久国产精品麻豆| 日韩大片免费观看网站| 免费在线观看成人毛片| 国产高清不卡午夜福利| 日韩强制内射视频| 涩涩av久久男人的天堂| 免费高清在线观看视频在线观看| 人妻人人澡人人爽人人| 久久av网站| 少妇人妻 视频| 99久久精品国产国产毛片| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 丰满少妇做爰视频| 亚洲无线观看免费| 精品午夜福利在线看| 少妇人妻精品综合一区二区| 波野结衣二区三区在线| 我要看日韩黄色一级片| 久久久久久久国产电影| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 色视频在线一区二区三区| 乱码一卡2卡4卡精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 丰满迷人的少妇在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产精品人妻久久久影院| 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美最新免费一区二区三区| 97在线视频观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 少妇的逼好多水| 婷婷色av中文字幕| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产成人a∨麻豆精品| 国产日韩欧美在线精品| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 久久久久国产网址| 精品一区在线观看国产| 特大巨黑吊av在线直播| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲第一av免费看| 又大又黄又爽视频免费| 午夜激情福利司机影院| 人体艺术视频欧美日本| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 日本91视频免费播放| 男女啪啪激烈高潮av片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 一个人免费看片子| 国产 一区精品| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久99蜜桃精品久久| 婷婷色综合www| 午夜福利,免费看| av免费在线看不卡| 纯流量卡能插随身wifi吗| 制服丝袜香蕉在线| 一区二区三区四区激情视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 看非洲黑人一级黄片| 国产淫片久久久久久久久| 国产一区二区三区综合在线观看 | 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 男女边吃奶边做爰视频| 极品教师在线视频| 边亲边吃奶的免费视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久久久久久久久久免费av| 人人澡人人妻人| 99热6这里只有精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲自偷自拍三级| 免费黄网站久久成人精品| a级毛片在线看网站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久狼人影院| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产69精品久久久久777片| 全区人妻精品视频| 国产成人a∨麻豆精品| 人妻 亚洲 视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 在线 av 中文字幕| av天堂中文字幕网| 亚洲精品久久午夜乱码| 99热这里只有是精品50| 亚洲欧洲国产日韩| 国产黄色视频一区二区在线观看| 熟女电影av网| 高清不卡的av网站| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 中文字幕免费在线视频6| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 人妻 亚洲 视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 丝袜在线中文字幕| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久狼人影院| 国产精品福利在线免费观看| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美区成人在线视频| 综合色丁香网| a级片在线免费高清观看视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 成人二区视频| 日韩欧美 国产精品| 欧美精品一区二区大全| 午夜老司机福利剧场| a级片在线免费高清观看视频| 亚州av有码| 亚洲精品国产av蜜桃| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产有黄有色有爽视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 女人久久www免费人成看片| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲av在线观看美女高潮| av在线观看视频网站免费| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲三级黄色毛片| 国产一区二区在线观看av| 国产69精品久久久久777片| 交换朋友夫妻互换小说| 女性被躁到高潮视频| 国产精品.久久久| 搡老乐熟女国产| 成人综合一区亚洲| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 91精品国产九色| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产美女午夜福利| 国产精品一区二区性色av| 美女内射精品一级片tv| 在线精品无人区一区二区三| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久久欧美国产精品| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美日韩在线观看h| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 视频中文字幕在线观看| 亚洲无线观看免费| a级毛片免费高清观看在线播放| av在线老鸭窝| 久久久久久伊人网av| 嘟嘟电影网在线观看| 久久免费观看电影| 久久久久精品性色| 永久免费av网站大全| 国产在视频线精品| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲内射少妇av| videos熟女内射| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 欧美 日韩 精品 国产| 一区二区三区精品91| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 性色avwww在线观看| 少妇高潮的动态图| 免费观看无遮挡的男女| 国产在线视频一区二区| 视频中文字幕在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久午夜综合久久蜜桃| av视频免费观看在线观看| 一级片'在线观看视频| 十八禁高潮呻吟视频 | 亚洲第一av免费看| 亚洲av福利一区| 国产日韩欧美亚洲二区| 日韩大片免费观看网站| 一个人免费看片子| av又黄又爽大尺度在线免费看| 老熟女久久久| 99热网站在线观看| av黄色大香蕉| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 九九爱精品视频在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 中文字幕制服av| 免费观看a级毛片全部| 性色av一级| 国产极品天堂在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 成年人午夜在线观看视频| 中文字幕人妻丝袜制服| av不卡在线播放| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲色图综合在线观看| 国产欧美亚洲国产| av卡一久久| 黄色一级大片看看| 美女福利国产在线| av天堂中文字幕网| 最近手机中文字幕大全| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 男女边摸边吃奶| 51国产日韩欧美| 交换朋友夫妻互换小说| 少妇人妻精品综合一区二区| 只有这里有精品99| 亚洲精品456在线播放app| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产乱来视频区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 熟女人妻精品中文字幕| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲av综合色区一区| av播播在线观看一区| 国产日韩欧美视频二区| 国产精品偷伦视频观看了| 青春草国产在线视频| 久久99精品国语久久久| 91精品国产九色| 精品久久久久久久久亚洲| 香蕉精品网在线| 69精品国产乱码久久久| 自线自在国产av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 九九爱精品视频在线观看| 一区二区av电影网| av黄色大香蕉| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 丝袜喷水一区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久狼人影院| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 97超碰精品成人国产| 中国国产av一级| 高清视频免费观看一区二区| 久久青草综合色| 久久久久国产网址| 丰满少妇做爰视频| 成人毛片60女人毛片免费| 欧美日韩av久久| 亚洲精品自拍成人| 啦啦啦啦在线视频资源| 日韩中字成人| 精品人妻一区二区三区麻豆| 在线观看三级黄色| 久久毛片免费看一区二区三区| 丰满乱子伦码专区| 亚洲性久久影院| 天堂8中文在线网| 亚洲在久久综合| 日本爱情动作片www.在线观看| 免费大片黄手机在线观看| 高清不卡的av网站| 在线天堂最新版资源| 男人和女人高潮做爰伦理| 制服丝袜香蕉在线| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲精品456在线播放app| 最新中文字幕久久久久| tube8黄色片| 高清av免费在线| 国产午夜精品一二区理论片| 日本爱情动作片www.在线观看| 女人久久www免费人成看片| 99九九在线精品视频 | 日韩一区二区三区影片| 精品久久久久久久久亚洲| 丝瓜视频免费看黄片| 久久久久久伊人网av| 国产成人精品一,二区| 有码 亚洲区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 日本av手机在线免费观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 大片免费播放器 马上看| 欧美三级亚洲精品| 最近2019中文字幕mv第一页| 一区在线观看完整版| 久久精品国产亚洲av天美| 精品久久久久久电影网| 久久狼人影院| 国产综合精华液| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 大话2 男鬼变身卡| 一级黄片播放器| 免费观看a级毛片全部| 国产在线一区二区三区精| 久久久久视频综合| 日韩一区二区视频免费看| 18禁在线播放成人免费| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美区成人在线视频| 亚洲精品日本国产第一区| 久久久午夜欧美精品| 免费看日本二区| 精品一区二区免费观看| 美女中出高潮动态图| 国产高清国产精品国产三级| 成人免费观看视频高清| 能在线免费看毛片的网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 又大又黄又爽视频免费| 国产成人精品一,二区| 伦理电影免费视频| 精品一区二区免费观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 我的女老师完整版在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 综合色丁香网| 最近中文字幕2019免费版| 丝袜脚勾引网站| 免费高清在线观看视频在线观看| 自线自在国产av| 777米奇影视久久| 久久久欧美国产精品| 久久97久久精品| av.在线天堂| 最近的中文字幕免费完整| 日本午夜av视频| 老女人水多毛片| 亚洲欧洲日产国产| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 美女视频免费永久观看网站| 各种免费的搞黄视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 毛片一级片免费看久久久久| 中文天堂在线官网| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 一本色道久久久久久精品综合| 日韩视频在线欧美| 日本av手机在线免费观看| h日本视频在线播放| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 大香蕉久久网| 亚洲国产色片| av福利片在线| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 18禁在线播放成人免费| 欧美区成人在线视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久久久精品久久久久真实原创| 日韩视频在线欧美| 国产黄片视频在线免费观看| 精品熟女少妇av免费看| 日本黄色片子视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 97超碰精品成人国产| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 22中文网久久字幕| 亚洲国产成人一精品久久久| 少妇的逼好多水| 久久久久国产网址| 亚洲国产精品成人久久小说| 美女主播在线视频| 男人添女人高潮全过程视频| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲国产欧美在线一区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 在线观看免费高清a一片| 我的老师免费观看完整版| 妹子高潮喷水视频| 日韩大片免费观看网站| 高清视频免费观看一区二区| 国内精品宾馆在线| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 久久久久精品久久久久真实原创| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产av国产精品国产| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日韩伦理黄色片| 秋霞伦理黄片| 大片免费播放器 马上看| 亚洲精品视频女| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 伦理电影免费视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产乱来视频区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 午夜福利,免费看| 大香蕉97超碰在线| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 久热久热在线精品观看| 2018国产大陆天天弄谢| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产美女午夜福利| www.色视频.com| 日韩成人伦理影院| 亚洲综合精品二区| 国产黄频视频在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 两个人的视频大全免费| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美另类一区| 亚洲中文av在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产伦精品一区二区三区视频9| 蜜桃在线观看..| 婷婷色综合www| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产极品天堂在线| 99热这里只有是精品50| 中文字幕av电影在线播放| 日韩av不卡免费在线播放| 日日啪夜夜爽| 欧美性感艳星| 我的老师免费观看完整版| 九九爱精品视频在线观看| av天堂久久9| 欧美三级亚洲精品| 午夜精品国产一区二区电影| 伦理电影免费视频| 欧美三级亚洲精品| 三上悠亚av全集在线观看 | 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产在线视频一区二区| 日韩 亚洲 欧美在线| 一级毛片 在线播放| 99re6热这里在线精品视频| 人妻少妇偷人精品九色| 麻豆成人午夜福利视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲无线观看免费| 亚洲国产精品成人久久小说| 99久久精品热视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 久久99蜜桃精品久久| 美女中出高潮动态图| 国产免费一区二区三区四区乱码| 91aial.com中文字幕在线观看| 日韩视频在线欧美| 久久午夜福利片| 亚洲天堂av无毛| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 少妇的逼好多水| 久久国产精品大桥未久av | 亚洲精品乱久久久久久| 大香蕉久久网| 国产视频内射| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 波野结衣二区三区在线| 成人二区视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 精品熟女少妇av免费看| 欧美成人午夜免费资源|