克氏原螯蝦體表固著類纖毛蟲種類調(diào)查及硫酸鋅對其藥效研究

王建國，馮亞明，王　洲，顧海龍,陸宏達，王　權

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇泰州　225300；2.泰州市農(nóng)科所，江蘇泰州　225300；3.上海海洋大學，上?！?01306)

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克氏原螯蝦體表固著類纖毛蟲種類調(diào)查及硫酸鋅對其藥效研究

王建國1，馮亞明2，王洲1，顧海龍2,陸宏達3，王權1

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇泰州225300；2.泰州市農(nóng)科所，江蘇泰州225300；3.上海海洋大學，上海201306)

摘要：調(diào)查克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)容易感染的固著類纖毛蟲種類，并挑選寄生蟲種類較單一的寄生部位分割成若干小塊，分別放入不同濃度硫酸鋅溶液，觀察硫酸鋅對固著類纖毛蟲的藥效。結(jié)果顯示：容易感染克氏原螯蝦的種類主要有鐘蟲、聚縮蟲、累枝蟲及蓮蓬蟲。硫酸鋅對這幾種蟲體的24 h和48 h的LC50分別為5.63和2.18 mg/L、5.01和2.44 mg/L、6.28和2.93 mg/L、3.23和1.72 mg/L，對硫酸鋅敏感度蓮蓬蟲>鐘蟲>聚縮蟲>累枝蟲。結(jié)果表明硫酸鋅對克氏原螯蝦常見固著類纖毛蟲病有效。

關鍵詞：硫酸鋅；克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)；固著類纖毛蟲；藥效

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii) ,又稱紅色沼澤螯蝦、小龍蝦，屬甲殼綱十足目螯蝦科原螯蝦屬。原產(chǎn)于墨西哥北部和美國南部， 20世紀初傳入我國，是目前國內(nèi)外市場極為熱銷的淡水蝦類之一。養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴大，逐漸成為研究和開發(fā)的熱點[1]。固著類纖毛蟲病是甲殼動物容易罹患的疾病，附著在受精卵體表會妨礙卵的發(fā)育；大量附著在蝦苗和成蝦的鰓上時，影響鰓絲的氣體交換，會引起缺氧而窒息死亡[2]；大量附著于體表和附肢上，形成許多棕色或黃綠色絨毛，頭胸甲發(fā)黑，體表黏液增多，全身粘滿污物，會妨礙蝦的活動、攝食和蛻殼，影響生長[3-4]。除此之外還會感染貝類[5]、魚類[6]、龜鱉等其他動物[7-8]。由于其繁殖快，種類多[9]，防治難度大，對水產(chǎn)動物危害嚴重。目前國內(nèi)外學者已經(jīng)開展了分類、生理、繁殖、生態(tài)方面的研究[1-7]，探討了防治方法，但是許多實用有效的藥物已經(jīng)列為禁藥[2,7-8,10-17]，在生產(chǎn)中無法使用。硫酸鋅是一種較為安全的重金屬鹽類殺蟲劑，已經(jīng)在生產(chǎn)中用于防治固著類纖毛蟲疾病，但是該藥對不同種類固著類纖毛蟲殺蟲效果究竟如何缺乏有說服力的實驗數(shù)據(jù)。本實驗選擇克氏原螯蝦為研究對象，調(diào)查了寄生其體表的纖毛蟲種類，選擇優(yōu)勢種進行了硫酸鋅產(chǎn)品的殺蟲效果，試驗為水產(chǎn)養(yǎng)殖科學用藥提供參考依據(jù)。

1材料和方法

1.1固著類纖毛蟲采集

從菜市場及里下河地區(qū)野外河道采捕克氏原螯蝦樣品作為調(diào)查對象。采用顯微鏡活體觀察和染色法[18]觀察體表及鰓上的固著類纖毛蟲，按中國動物志無脊椎動物原生動物門的分類檢索表進行分類。

1.2硫酸鋅對固著類纖毛蟲的藥效實驗

挑選寄生蟲種類較單一，寄生密度較大的蝦，小心地將其寄生部位分割成若干小塊備用。實驗在直徑為12.5 cm的培養(yǎng)皿中進行，實驗水體80 mL，水溫(22±2)℃，pH7.5～8.0，硬度約為120 mg/L，實驗藥液每2 h更換一次。根據(jù)預實驗結(jié)果設置6個實驗組和空白對照組，充氣72 h以上的自來水配制不同濃度的硫酸鋅溶液(國藥，分析純)，空白對照組只加曝氣自來水不加藥物。每組分別放入相同數(shù)量的寄生蟲組織塊，每濃度10塊。每2 h用解剖鏡(OLYMPUS)觀察1次寄生蟲的存活情況，做好記錄。蟲體死亡判斷的標準為纖毛停止擺動，伸縮泡不運動，內(nèi)部原生質(zhì)略模糊，其中累枝蟲頭部脫落，纖毛停止擺動，緊縮，伸縮泡不運動，內(nèi)部原生質(zhì)略模糊，固著柄肌絲斷裂才判斷為死亡。蟲體存活情況觀察方法為任意挑選5個組織塊，每組織塊任選一個視野，計數(shù)蟲體總數(shù)量和死亡數(shù)量求取平均數(shù)，蟲體死亡率計算方法為：死亡率=死亡數(shù)/總數(shù)×100%。

1.3數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用EXCEL2007求取平均值，數(shù)值采用平均值±標準差表示。蟲體24 h和48 h的LC50采用Martin等的軟件計算[19]。

2結(jié)果

2.1寄生纖毛蟲種類調(diào)查

實驗分別從5個菜市場和野外10個河道共采集了有固著類纖毛蟲的克氏原螯蝦54只。纖毛蟲在蝦體大量寄生后，呈“絨毛”狀，由于攝取的食物不同纖毛蟲顏色有微綠色、黃色或灰白色。根據(jù)在顯微鏡下對克氏原螯蝦樣品上的固著類纖毛蟲的觀察情況，按中國動物志無脊椎動物原生動物門的分類檢索將固著類纖毛蟲進行分類，結(jié)果見表1。共鑒別出10種纖毛蟲，主要為寡毛綱的固著亞目和動基片綱的吸管目的種類。固著亞目的種類8種，分別是鐘形蟲、獨縮蟲、聚縮蟲、擬單縮蟲、累枝蟲、杯體蟲、靴纖蟲、鞘居蟲；吸管蟲2種，分別是殼吸管蟲和蓮蓬蟲。寡毛綱的固著亞目出現(xiàn)的幾率遠多于動基片綱的吸管目。

表1　克氏原螯蝦體表固著類纖毛蟲調(diào)查結(jié)果

纖毛蟲中出現(xiàn)頻率高的為鐘蟲、累枝蟲、聚縮蟲、蓮蓬蟲。鐘蟲(VorticellaLinnaeus)為固著亞目鐘蟲屬種類，蟲體均為單體生活而不形成群體，具有螺旋收縮的柄，銀線系統(tǒng)為條紋狀[20]。聚縮蟲ZoothamniumBory de St.V incent，屬固著亞目聚縮蟲屬，蟲體均為群體生活，具有相互連接且延伸至柄基部的柄肌與“Z”形收縮的柄，銀線系為條紋狀[21]。累枝蟲EpistylisEhernberg，屬固著亞目累枝蟲屬，蟲體均為群體生活，具有相互連接的柄，但柄內(nèi)無肌絲，其個體特征與聚縮蟲相似，銀線系為條紋狀。動基片綱中的種類，以單體分散分布，生物量遠不及寡毛綱類纖毛蟲，常和寡毛綱纖毛蟲一起出現(xiàn)，很少見到單純的動基片綱纖毛蟲大量爆發(fā)。

2.2硫酸鋅對固著類纖毛蟲的藥效

2.2.1硫酸鋅對鐘蟲的藥效

克氏原螯蝦體表的鐘蟲在不同硫酸鋅濃度和浸泡時間內(nèi)死亡情況見表2。硫酸鋅濃度較低時鐘蟲幾乎不受影響，隨著浸泡時間增加死亡程度逐漸變大。在相同浸泡時間內(nèi)，硫酸鋅濃度越大，蟲體出現(xiàn)中毒死亡率越高。用藥4 h時，7.75 mg/L濃度有10%的蟲體失去活性，15.5 mg/L時有約30%失去活性。浸泡16 h時,1.94 mg/L有約5%失活，3.88 mg/L有15%失活，15.5 mg/L死亡率達到63%。用藥24 h內(nèi)0.48 mg/L出現(xiàn)少量死亡，15.5 mg/L死亡率達到78%。48 h內(nèi)1.94 mg/L死亡率達到52%，低于0.48 mg/L幾乎無顯著殺蟲效果，但該濃度可能對蟲體有抑制作用。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)計算硫酸鋅殺滅種蟲24 h和48 h的LC50分別為5.63 mg/L和2.18 mg/L。

表2　硫酸鋅對鐘蟲的殺蟲效果

對照組鐘形蟲蟲體口緣纖毛劇烈擺動，形成強大的回旋水流，可觀察到食物泡和收縮泡的運動，蟲體對刺激敏感，碰到異物后口緣纖毛立即停止擺動，縮回體內(nèi)，固著柄迅速收縮，呈折線狀，隨后口緣纖毛伸出繼續(xù)擺動，固著柄伸直。出現(xiàn)中毒癥狀時，蟲體口緣纖毛活動減弱，口盤周圍形成的水流減小，并不斷出現(xiàn)收縮反應。隨硫酸鋅濃度增大、浸泡時間加長中毒程度越深，口緣纖毛停止擺動，縮回體內(nèi)，體內(nèi)的食物泡和收縮泡活動逐漸減弱直至停止后即死亡。

2.2.2硫酸鋅對累枝蟲的藥效

克氏原螯蝦體表累枝蟲在不同硫酸鋅濃度和浸泡時間內(nèi)死亡情況見表3。累枝蟲呈群體生長，群體分枝常呈樹狀。運動時肌柄不能收縮，活動能力較差，肌柄內(nèi)肌絲清晰可見。對照組累枝蟲在試驗期間活力旺盛，口盤處的纖毛不停擺動，食物泡和伸縮泡不?；顒?。硫酸鋅濃度低于0.2 mg/L時累枝蟲幾乎無任何異常。浸泡4 h后4.04 mg/L以上濃度組的累枝蟲逐漸開始表現(xiàn)中毒癥狀，口盤纖毛擺動減弱，最后停止擺動，收回口盤，但食物泡和伸縮泡仍不?；顒?。隨浸泡時間延長食物泡和伸縮泡逐漸停止活動，蟲體部原生質(zhì)略模糊，一段時間后頭部從附著柄上脫落，肌絲逐漸斷裂成數(shù)段。浸泡4 h，4.04 mg/L以上濃度組累枝蟲開始出現(xiàn)死亡，20.19 mg/L時死亡率約30%。16 h內(nèi)2.02 mg/L有8%蟲體失活，20.19 mg/L死亡率達60%。24 h內(nèi)0.81 mg/L有5%蟲體失活，4.04 mg/L時死亡率達到45%，20.19 mg/L死亡率達90%。48 h內(nèi)0.81 mg/L有15%蟲體失活，2.02 mg/L死亡率達到50%。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)計算硫酸鋅殺滅累枝蟲24 h和48 h的LC50分別為5.01 mg/L和2.44 mg/L。

2.2.3硫酸鋅對聚縮蟲的藥效

克氏原螯蝦體表的聚縮蟲在不同硫酸鋅濃度和浸泡時間內(nèi)死亡情況見表4。對照組聚縮蟲口盤處的纖毛不停擺動，食物泡和伸縮泡不?；顒樱斢幸粋€單體遇到外界刺激時，同一個主枝的所有單體迅速收縮。當受到環(huán)境毒物的影響時蟲體活力減弱，并逐漸收縮，最后縮成一團而死亡。該蟲的形態(tài)和單縮蟲及累枝蟲不同。硫酸鋅濃度低于0.20 mg/L聚縮蟲未發(fā)現(xiàn)異常。浸泡4 h內(nèi)4.04 mg/L以上濃度組聚縮蟲開始出現(xiàn)死亡，20.19 mg/L有35%停止活動，縮成一團。浸泡16 h時2.02 mg/L開始出現(xiàn)死亡，8.07 mg/L死亡率達到28%，20.19 mg/L達到68%。浸泡24 h時0.81 mg/L開始出現(xiàn)死亡，8.07 mg/L組死亡率達到60%。浸泡48 h時0.81 mg/L死亡率達到15%，2.02 mg/L濃度死亡率40%，20.19 mg/L有95%死亡。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)計算硫酸鋅殺滅聚縮蟲24 h和48 h的LC50分別為6.28 mg/L和2.93 mg/L。

表4　硫酸鋅對聚縮蟲的殺蟲效果

2.2.4硫酸鋅對蓮蓬蟲的藥效實驗結(jié)果

克氏原螯蝦體表的蓮蓬蟲在不同硫酸鋅濃度和浸泡時間內(nèi)死亡情況見表5。硫酸鋅濃度低于0.24 mg/L時蓮蓬蟲幾乎不受影響。0.24 mg/L時浸泡48 h以上對蓮蓬蟲有一定抑制作用。浸泡4 h時1.94 mg/L有少量死亡，15.5 mg/L有60%收縮成一團。16 h時0.48 mg/L組有少量縮成一團，7.75 mg/L濃度死亡率達50%，15.5 mg/L死亡率達85%。24 h內(nèi)0.48 mg/L死亡率約15%，7.75 mg/L以上濃度80%以上死亡。48 h內(nèi)0.24 mg/L組有少量蟲體死亡，7.75 mg/L以上濃度90%死亡。蓮蓬蟲中毒后口緣纖毛收回，縮成一團，食物泡逐漸停止活動，然后死亡。蓮蓬蟲對硫酸鋅毒性相對較敏感，0.24 mg/L以上濃度對蟲體有一定抑制作用或殺滅效果。硫酸鋅殺滅蓮蓬蟲24 h和48 h的LC50分別為3.23 mg/L和1.72 mg/L。

表5　硫酸鋅對蓮蓬蟲的殺蟲效果

3討論

固著類纖毛蟲分布廣，其附生譜廣，可感染貝類[5]、甲殼動物[9]、魚類[6]及龜鱉[7-8]，甚至在水草、樹枝[22]等表面均能生長。在水產(chǎn)動物的寄生部位通常為鰓和表皮。雖然固著類纖毛蟲可在許多動物及植物上生長，但是對固著基存在一定選擇性，水產(chǎn)動物卵、幼體、體殼及體表受損部位易被附著，使其最容易罹患固著類纖毛蟲病，常造成嚴重的經(jīng)濟損失。Mayén-Estrada等[23]對墨西哥地區(qū)克氏原螯蝦體表及鰓上15種緣毛類纖毛蟲進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)不同種類纖毛蟲對寄生部位有選擇性，其中14種選擇附生于步足和腹足上，1種選擇性寄生在鰓上。不同種類的水產(chǎn)動物附生的固著類纖毛蟲種類不完全相同，其中報道最多，危害最嚴重的主要有鐘蟲、獨縮蟲、聚縮蟲、累枝蟲及杯體蟲[24]等，靴纖蟲、鞘居蟲、殼吸管蟲及蓮蓬蟲等附生密度相對較小[16-17]，很少單獨大量爆發(fā)，所以本研究挑選的實驗對象為既容易感染克氏原螯蝦又容易感染其它甲殼動物的種類，具有廣泛的代表性。

由于固著類纖毛蟲危害多種水產(chǎn)動物健康，尤其對幼苗影響極大[3]，國內(nèi)外學者嘗試了很多種方法來防治。換水法，固著類纖毛蟲主要以懸浮的有機物、細菌等為食，所以一些學者通過換水以降低有機物、細菌等含量或刺激甲殼動物蛻殼的方法防治[10]。但是也有人對此方法提出了異議，當固著類纖毛蟲已經(jīng)大量存在時，大量換水，環(huán)境改變的刺激會使其釋放大量的游泳體，游泳體在約2 h內(nèi)便能附著，因此僅采取換水而不采取其它措施的話，換水可能使病情更加嚴重[2]。藥物防治，甲殼動物生長過程中要蛻皮，施用10～15 mg/L茶籽餅[11]，促進甲殼動物蛻殼然后大量換水排掉有蟲附著的甲殼來防治，能起到一定效果，但不久后容易復發(fā)[12]，且對魚類無效。

許多學者在探尋能直接殺滅固著類纖毛蟲的藥物，發(fā)現(xiàn)抗生素、漂白粉、EDTA、生石灰及冰醋酸等防治效果不明顯，而食鹽[7]、制霉菌素[13]、孔雀石綠[14]、一些消毒劑[12]、代森類農(nóng)藥、重金屬鹽類[15]及某些中草藥[16]等對固著類纖毛蟲有一定療效。這些藥物在實際應用中大多存在一些問題，如：食鹽僅適于小水體高濃度浸泡，孔雀石綠、硝酸亞汞等是致畸致癌物質(zhì)已被禁用，其它有一些殺蟲效果不穩(wěn)定，高錳酸鉀對中國對蝦體表聚縮蟲有效，但對河蟹體表聚縮蟲無效[16]。硫酸鋅及其復配制劑作為一種重金屬鹽類殺蟲劑，在水中生成的鋅離子易與蟲體細胞蛋白質(zhì)結(jié)合成蛋白鹽而失活沉淀，當鋅離子與蟲體細胞酶的巰基相結(jié)合后就失去了活性，從而達到殺滅的目的，目前此類制劑是抗纖毛蟲的主要藥物之一。

本實驗對常見的四種纖毛蟲鐘蟲、聚縮蟲、累枝蟲及蓮蓬蟲在不同硫酸鋅濃度中浸泡時的死亡情況進行研究，發(fā)現(xiàn)四種纖毛蟲硫酸鋅中毒后的死亡情況存在一些共同特征：硫酸鋅濃度低于0.2 mg/L時，幾乎所有纖毛蟲都不受影響；硫酸鋅濃度越大，死亡率越高，隨著浸泡時間的增加死亡率逐漸變大。在用藥24 h內(nèi)，硫酸鋅對蟲體LC50分別是鐘蟲2.18 mg/L，累枝蟲2.44 mg/L，聚縮蟲2.93 mg/L，蓮蓬蟲1.72 mg/L，出現(xiàn)藥效的濃度分別是鐘蟲0.48 mg/L，累枝蟲0.81 mg/L，聚縮蟲0.81 mg/L，蓮蓬蟲0.24 mg/L，四種固著類纖毛蟲對硫酸鋅毒性的敏感性蓮蓬蟲>鐘蟲>累枝蟲>聚縮蟲。低濃度硫酸鋅浸泡下，蟲體未見明顯異常，但達到敏感濃度后浸泡48 h對蟲體有一定抑制作用。主要表現(xiàn)在有的蟲體伸縮泡收縮運動減少，分裂數(shù)量少，固著柄收縮量下降等。在高濃度組觀察到累枝蟲浸泡后蟲體頭部脫落現(xiàn)象，試驗中觀察了脫落的頭部纖毛停止擺動，緊縮，伸縮泡不運動，內(nèi)部原生質(zhì)略模糊，固著柄肌絲斷裂，可判斷為蟲體死亡。BAUFER等報道化學物質(zhì)刺激[25]、Utz等[26]報道宿主的死亡、脫皮等外界刺激因素都能刺激蟲體形成游泳體形式而脫離群體，但是宿主的受傷或不能游動卻不能觸發(fā)蟲體形成游泳體。在宿主死亡后的7 h內(nèi)，90%個體脫離宿主甲殼并在 2 h內(nèi)形成游泳體形態(tài)，游泳體能在水中存活 14 h[27]，有足夠的時間完成重新寄生的過程，這可能就是蝦類苗種生產(chǎn)時，固著類纖毛蟲越換水越多的原因。一些學者觀察藥物對蟲體的作用單純從蟲體是否從柄部斷裂來判斷[17,28]，筆者認為不妥，因為鐘蟲等許多蟲體和柄部連接處有一個較細的縊痕[29]，蟲體受到刺激后很容易從此斷裂，斷裂后可能形成游泳體再次進行感染而不是死亡。

由此可以看出，在使用藥物或者換水等方法來防治固著類纖毛蟲病時低濃度藥物對蟲體的刺激可能加速蟲體形成游泳體，出現(xiàn)蟲越治越多的風險。生產(chǎn)中硫酸鋅及其復配制劑用于防治水產(chǎn)動物固著類纖毛蟲病已有很多年，有些蟲體對藥物產(chǎn)生了耐藥性，目前說明書使用濃度在0.3 mg/L左右，可能無法有效起到殺滅固著類纖毛蟲的目的，但可以刺激其蟲體脫落。在使用藥物防治固著類纖毛蟲的過程中，使用有效濃度藥物后24 h內(nèi)進行換水，可能降低游泳體數(shù)量而減少疾病再次大規(guī)模感染的風險。

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(責任編輯：鄧薇)

收稿日期：2015-08-11；

修訂日期：2016-04-25

第一作者簡介：王建國(1983-)，男，碩士，講師，從事水產(chǎn)動物增養(yǎng)殖與疾病防治技術教學與研究。E-mail:j.g.wang@163.com 通訊作者：馮亞明。E-mail:924013738@qq.com

中圖分類號：S945.4

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)04-0054-06

The investigation of sessilinasis and efficacy of zinc sulphate to sessilinasis of Procambarus clarkii

WANG Jian-guo1,FENG Ya-min2,WANG Zhou1,GU Hai-long2,LU Hong-da3,WANG Quan1

(1.JaingsuAgri-animalHusbandryVocationalCollege,Taizhou225300,Jiangsu,China;2.TaizhouAgriculturalScienceResearchInstitute,Taizhou225300,Jiangsu,China;3.ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Abstract：This paper investigated the pathogene of sessilinasis and the efficacy of zinc sulphate to sessilinasis by hydrostatic toxicity experiment method on crayfish (Procambarus clarkii).The tissues with single parasitic were divided into small pieces which were dipped in the different concentration of zinc sulfate solution,respectively.The results showed that the main pathogenes of sessilinasis were Vorticella sp,Zoothamnium sp,Epistylis sp and Ephelota sp.The LC50at 24 h and 48 h of zinc sulphate to these pathogenes were 5.63 mg/L and 2.18 mg/L,5.01 mg/L and 2.44 mg/L,6.28 mg/L and 2.93 mg/L,3.23 mg/L and 1.72 mg/L respectively.The sensitivity to zinc sulfate were Ephelota sp>Vorticella sp>Zoothamnium sp>Epistylis sp.The results indicated that zinc sulfate was an effective drug to prevente and cure sessilinasis.

Key words：zinc sulphate;Procambarus clarkii;sessilinasis;efficacy

資助項目：泰州市科技計劃項目(TN201401)；江蘇牧院校級項目(NSFPT201524)