甲魚養(yǎng)殖場抗污螺旋藻的分離及生長特性研究

羅金飛，蔣路平，朱建龍，朱杰胄

(1.嘉興市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江嘉興　314050；2.嘉興中清環(huán)?？萍加邢薰荆憬闻d　314006；3.嘉興市海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測站，浙江嘉興　314050)

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甲魚養(yǎng)殖場抗污螺旋藻的分離及生長特性研究

羅金飛1，蔣路平1，朱建龍2，朱杰胄3

(1.嘉興市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江嘉興314050；2.嘉興中清環(huán)?？萍加邢薰?，浙江嘉興314006；3.嘉興市海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測站，浙江嘉興314050)

摘要：從嘉興市某溫室甲魚養(yǎng)殖場廢水儲存池中分離出1株螺旋藻JXSC-S1。通過與典型鈍頂螺旋藻品系進(jìn)行比較，確定該藻種的藻絲顏色、形狀、螺距、螺寬、細(xì)胞大小等符合鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)的形態(tài)特征。在Zarrouk培養(yǎng)基中，JXSC-S1的生長速率為1.64/d，生長代時為13.96 h，與典型鈍頂螺旋藻種S6、S2相似，高于Ns-90020。在溫室甲魚廢水中，JXSC-S1的生長速率、外觀顏色和藻絲特征都與在Zarrouk培養(yǎng)基中相差不大，遠(yuǎn)高于S6(0.33/d)，而Ns-90020基本不長，S2死亡。上述結(jié)果表明，該本地藻種JXSC-S1可以在溫室甲魚廢水中快速生長，在用溫室甲魚廢水代替昂貴的Zarrouk培養(yǎng)基高效規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)飼料蛋白方面有很大應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)；形態(tài)鑒定；生長特性；藻絲性狀

螺旋藻(Spirulina)含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和生物活性物質(zhì)，對提高生物體免疫力，防治多種疾病有輔助作用[1]。螺旋藻生長繁殖快，光合效率高，近年來國內(nèi)外規(guī)模養(yǎng)殖較多。規(guī)模養(yǎng)殖中需要向水中投加小蘇打和氮磷等營養(yǎng)鹽。上述營養(yǎng)鹽價格貴且用量大，導(dǎo)致螺旋藻的生產(chǎn)成本較高，其中培養(yǎng)基成本一般占總生產(chǎn)成本的20%～30%[2]。

利用溫室甲魚廢水培養(yǎng)鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)，不僅可以實現(xiàn)溫室甲魚廢水的脫氮除磷，還可以降低螺旋藻的培養(yǎng)成本，收獲藻體作為飼料，解決市場上飼料級螺旋藻供應(yīng)不足的難題。與純培養(yǎng)相比，螺旋藻在廢水中的培養(yǎng)生長慢，產(chǎn)量低，性狀不良，粗蛋白含量不高[4]。為解決上述問題，篩選高耐污藻種是關(guān)鍵。Anaga等[5]在化肥廠廢水中分離到一株鈍頂螺旋藻并培養(yǎng)，7 d后生長(0.95/d)明顯優(yōu)于其它螺旋藻。Kosaric等[6]從廢水處理廠的二級廢水池中分離一株螺旋藻，在溫度30℃，光照4000 Lx下培養(yǎng)，與其它規(guī)模養(yǎng)殖的螺旋藻相比，該藻種生長最快(0.77/d)，粗蛋白含量最高(50.5%)。耿亞紅等[7]從生活污水中分離出一種螺旋藻，與一般螺旋藻生長生理特性顯著不同，在生活污水中的生長速率達(dá)到1.09/d，明顯快于其它一般螺旋藻。阮榕生等[8]在市政廢水中分離到一株耐污螺旋藻，生長速率平均達(dá)到0.82/d，明顯快于一般螺旋藻(FACHB439、FACHB350、FACHB792)在市政廢水中生長速率。

本研究旨在從溫室甲魚廢水中分離出生長速度快、產(chǎn)量高、抗逆性和適應(yīng)性強、藻絲性狀優(yōu)良、粗蛋白高的鈍頂螺旋藻藻種，為鈍頂螺旋藻的溫室甲魚廢水培養(yǎng)提供優(yōu)質(zhì)藻種。

1材料與方法

1.1儀器與材料

BX51熒光數(shù)碼顯微鏡(Olympus公司)；GZP450光照培養(yǎng)箱、DHG-9240干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；722s可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Sens ION+便攜式pH計(HACH公司)；AL204-1C精密電子天平(METTLER TOLEDO公司)；UV4802紫外分光光度計(尤尼科儀器公司)；SD-9011色度計(上海昕瑞公司)。

本地分離藻種JXSC-S1取自浙江省嘉興市某溫室甲魚養(yǎng)殖場廢水儲存池。Ns-90020分離自云南滇池，購自中科院武漢植物所； S6和S2分別分離自河北省黃驊縣沿海和海南澄邁縣福山湖，購自武漢水生所。Ns-90020、S6、S2是國內(nèi)螺旋藻規(guī)?；B(yǎng)殖中常用的鈍頂螺旋藻品系。Ns-90020被廣東海大養(yǎng)殖公司使用，S2被福建省神六養(yǎng)殖公司使用，S6被山東海福生物工程有限公司使用。

溫室甲魚廢水取自嘉興某規(guī)模化溫室甲魚養(yǎng)殖場廢水池排水，經(jīng)自然沉淀、好氧生物處理和高級氧化脫色后，再經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后獲得。水質(zhì)如下：COD為(280±70)mg/L，氨氮為(2.5±0.5)mg/L，TN為(1200±250)mg/L，TP為(45±10)mg/L，總堿度為(8000±2000)mg/L，色度為(150±50)倍，pH為(8.5±0.5)。

1.2實驗方法

1.2.1本地藻種JXSC-S1的分離及其與典型鈍頂螺旋藻品系的外觀比較

各品系藻液用Milli-Q超純水清洗后搖勻，用吸管取約0.1 mL置于載玻片中央，蓋上蓋玻片，顯微鏡下(目鏡10×，物鏡20×)觀察并拍照。每個樣品重復(fù)3次。

1.2.2各品系藻種在Zarrouk培養(yǎng)基中的生長特性比較

250 mL錐形瓶中盛放90 mL Zarrouk培養(yǎng)液[9]，分別接種各品系對數(shù)生長期的藻液10 mL，使接種密度D560約為0.2。用封口膜封口，放置于溫度(25±2)℃，光照(6000±2000) lx，光暗比12 h∶12 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d，每天搖動混勻1次，測試D560，顯微鏡下(目鏡10×，物鏡20×)觀察藻細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)最后1d稱藻細(xì)胞干重，測試粗蛋白含量。每組培養(yǎng)試驗設(shè)3個平行樣。最大比生長速率K(/d)、生長代時G(h)用式按文獻(xiàn)計算[10]。

1.2.3各品系藻種在溫室甲魚廢水中的生長特性比較

用1.1節(jié)中的溫室甲魚廢水(TBW)代替Zarrouk培養(yǎng)基，其余試驗方法同1.2.2節(jié)。每組培養(yǎng)試驗設(shè)3個平行樣。

1.2.4JXSC-S1和S6品系在溫室甲魚廢水連續(xù)批次培養(yǎng)中的生長特性比較

分別使用1.1節(jié)中的溫室甲魚廢水原液、2倍稀釋液和5倍稀釋液，代替Zarrouk培養(yǎng)基，接種本地藻種和S6品系在光照培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)19 d。鑒于目前螺旋藻規(guī)模培養(yǎng)普遍采用連續(xù)批次培養(yǎng)、批次換水模式，以有效補充氮磷等營養(yǎng)并促進(jìn)細(xì)菌和有毒代謝物質(zhì)及時排出，所以本實驗在19 d的培養(yǎng)期間也進(jìn)行了批次換水：0～6 d為第1個培養(yǎng)周期，第7d藻密度達(dá)到D560=0.8可采收藻，新添加1/3甲魚廢水；第7～14 d為第2個培養(yǎng)周期，第14天當(dāng)D560=0.8時采收藻，新添加2/3甲魚廢水；第14～19 d為第3個培養(yǎng)周期，第19 d當(dāng)D560=0.8時采收藻，采收后濾液排掉。初始接種密度D560約為0.05，其余條件同1.2.2節(jié)。

1.3分析測試方法

螺旋藻細(xì)胞數(shù)用血球計數(shù)板計數(shù)[11]；D560采用722s可見分光光度計在560 nm下測定[12]；上浮率(%)為藻分層后上下層D560比值[13]；螺旋藻干重測定時先把一定容積的藻液用400目濾布過濾，之后在60℃下烘4 h，計算單位體積藻液烘干后的干重[14]，得出產(chǎn)量g/(m2·d)；粗蛋白采用考馬斯亮藍(lán)法測定[11]，得出粗蛋白含量(%)。顯著差異采用p值檢驗分析。常規(guī)水質(zhì)分析參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》第四版[15]。

2結(jié)果與分析

2.1JXSC-S1的分離及其與典型螺旋藻品系的形態(tài)特征比較

JXSC-S1的基本形態(tài)特征及其與其他螺旋藻品系的比較結(jié)果如表1所示。JXSC-S1的藻絲呈藍(lán)綠色，細(xì)胞橫壁處略縮縊，螺旋寬29～30 μm，螺距46～48 μm，與S6接近，比S2略長，比Ns-90020略短；藻絲末端漸窄不明顯，與S6相似，但區(qū)別于Ns-90020和S2，后兩者藻絲末端漸窄明顯；末端細(xì)胞都呈寬圓，藻絲細(xì)胞寬3～4 μm，長4～5 μm，細(xì)胞大小與S6和S2接近，但比Ns-90020細(xì)胞小。以上形態(tài)特征符合鈍頂螺旋藻的基本特征，而與極大螺旋藻(S.maxima)和鹽澤螺旋藻(S.subsalsa)的基本特征差異很大。因此，通過形態(tài)特征判定本地分離種JXSC-SP1為S.platensis。

表1　本地螺旋藻種與典型螺旋藻品系的形態(tài)特征比較

2.2JXSC-S1與典型品系鈍頂螺旋藻種在Zarrouk和TBW培養(yǎng)基中的生長特性比較研究

JXSC-S1與典型鈍頂螺旋藻種Ns-90020、S6、S2在Zarrouk培養(yǎng)基中的生長曲線如圖1所示。4個品系都經(jīng)過2 d的停滯期后迅速進(jìn)入指數(shù)增長期，第9 d后進(jìn)入平衡期。本地分離藻種JXSC-S1生長速率與S6(p:0.255)、S2(p:0.184)接近，遠(yuǎn)高于Ns-90020(p:0.018)。從溫室甲魚廢水中的生長特性曲線可以看出，培養(yǎng)10天后，Ns-90020和S2基本未增殖；S6隨時間延長有所增殖，但增殖速度遠(yuǎn)低于本地藻種JXSC-S1；本地分離藻種JXSC-S1數(shù)量顯著增長，D560達(dá)到4.0以上。通過比較，發(fā)現(xiàn)本地分離藻種JXSC-S1在溫室甲魚廢水中的生長曲線與Zarrouk培養(yǎng)基差別不大，但其它品系的鈍頂螺旋藻在廢水中培養(yǎng)時生長均明顯受到抑制。由此說明，本地藻種JXSC-S1能適應(yīng)廢水的培養(yǎng)環(huán)境，這可能與藻在原生長地的長期馴化有關(guān)，也可能與藻種有關(guān)。

基于圖1計算各品系鈍頂螺旋藻在Zarrouk培養(yǎng)基中的生長指標(biāo)，如表2所示。同時與文獻(xiàn)報道中[14]國內(nèi)外規(guī)模養(yǎng)殖普遍使用的鈍頂螺旋藻品系在Zarrouk培養(yǎng)基中的生長指標(biāo)數(shù)據(jù)相比較。表2中非洲乍得品系為國外(如以色列Seambiotic公司、墨西哥Originoil公司)規(guī)模養(yǎng)殖所普遍采用，F(xiàn)ACHB439(分離自云南程海湖，購自中國科學(xué)院水生生物研究所)為國內(nèi)南方螺旋藻養(yǎng)殖公司(如云南綠A公司、廣東華粵生物公司和海南海之源養(yǎng)殖公司)所常用，S1品系(分離自內(nèi)蒙古鄂爾多斯某鹽堿湖)為鄂爾多斯螺旋藻養(yǎng)殖園區(qū)所使用。本地藻種JXSC-S1的最大比生長速率與生長代時分別為1.64/d、13.96 h，與S1(p:0.193)、S6(p:0.235)接近，略低和略慢于S2(p:0.342)，但遠(yuǎn)高和遠(yuǎn)快于Ns-90020(p:0.017)、非洲乍得(p:0.029)、FACHB439(p:0.011)。本地分離藻種具有氣浮性，氣浮率與其它幾個差異不大。本地分離藻種在Zarrouk培養(yǎng)中產(chǎn)量最高可達(dá)42 g/(m2·d)，明顯高于其它幾個品系(Ns-90020(p:0.014),S6(p:0.026),S2(p:0.012),Chad(p:0.014),FACHB439(p:0.036)and S1(p:0.029))；藻種粗蛋白含量62.8%±6%，低于Ns-90020(p:0.041)，高于S2(p:0.123)和S6(p:0.135)，與非洲乍得(p:0.581)、FACHB439(p:0.274)和S1(p:0.191),差別不大。表2中粗蛋白含量與生長速率呈負(fù)相關(guān)(k平均值：-13.8)，這與文獻(xiàn)報道相一致。殷春濤等[18]通過實驗發(fā)現(xiàn)不同鈍頂螺旋藻品系蛋白同化能力與細(xì)胞分裂速度有關(guān)，分裂越慢，代時越長，蛋白同化能力相對較強，相同生長周期積累蛋白量越大。

圖1　各鈍頂螺旋藻品系在Zarrouk培養(yǎng)基和溫室甲魚廢水(TBW)中的生長曲線圖

表2　各品系在Zarrouk培養(yǎng)基中的生長指標(biāo)

基于圖3計算各品系鈍頂螺旋藻在溫室甲魚廢水中的生長指標(biāo)，如表3所示。本地分離藻種的最大比生長速率與生長代時分別為1.55/d和14.15 h，與Zarrouk培養(yǎng)相差不大，遠(yuǎn)高和遠(yuǎn)快于其它三個品系 (Ns-90020,p:0.028;S6,p :0.042;S2,p:0.034)。

表3　各品系鈍頂螺旋藻在溫室甲魚廢水培養(yǎng)中的生長指標(biāo)

4種鈍頂螺旋藻在溫室甲魚廢水中培養(yǎng)10 d的外觀顏色與藻絲性狀如圖2所示。本地分離藻種JXSC-S1在溫室甲魚廢水中的外觀顏色和藻絲特征與Zarrouk培養(yǎng)基中差別不大。在廢水中仍然呈藍(lán)綠色，平均螺旋數(shù)=10個，藻絲較長。而其它3個品系的顏色和藻絲形態(tài)發(fā)生明顯變化。廢水中的S6呈綠色，NS-90020呈淡綠色， S2呈黃色。S6雖然生長但螺旋數(shù)少、螺距大而松弛；Ns-90020外觀顏色雖然與接種時一樣，但是部分藻種變直，失去螺旋； S2藻絲斷裂嚴(yán)重，標(biāo)志基本死亡。

S2、S6和Ns-90020的螺旋藻體變松變直甚至斷裂，這可能與甲魚廢水的環(huán)境不利于生長有關(guān)。胡鴻鈞等[18-19]研究認(rèn)為，螺旋藻藻絲體在通常情況下是呈規(guī)則的螺旋形，但在外界環(huán)境條件改變或不良環(huán)境等條件的脅迫下，藻絲體會從正常螺旋形轉(zhuǎn)變?yōu)榫砬炔煌穆菪踔潦侵本€形，這直接影響到藻絲體在營養(yǎng)學(xué)、生理學(xué)及養(yǎng)殖特性上也會發(fā)生相應(yīng)的改變。藻絲體變異為直線形，會導(dǎo)致藻種退化、營養(yǎng)攝取效率降低，從而造成產(chǎn)量急劇下降、質(zhì)量變差、藻體難于采收及易受顫藻污染等一系列嚴(yán)重問題。

圖2　不同鈍頂螺旋藻品系在溫室甲魚廢水中培養(yǎng)的外觀顏色及形態(tài)

2.3JXSC-S1和S6在溫室甲魚廢水中多批次培養(yǎng)的生長情況比較

分別用溫室甲魚廢水原液、2倍稀釋液和5倍稀釋液培養(yǎng)兩種螺旋藻，生長曲線如圖3所示。第一個培養(yǎng)周期中，各稀釋濃度的廢水中，接種1d后2個品系螺旋藻種吸光度均有所下降，隨著時間的延長，螺旋藻逐漸被馴化，適應(yīng)了溫室甲魚廢水水質(zhì)環(huán)境，3 d后開始出現(xiàn)對數(shù)增長，7 d后本地品系JXSC-S1在廢水原液、2倍稀釋液、5倍稀釋液和S6 5倍稀釋液中D560達(dá)到0.8以上，最大比生長速率分別為1.49、1.42、1.04、0.82/d，但S6在廢水原液和2倍稀釋液中生長慢，D560均未達(dá)到0.8，JXSC-S1在廢水原液和2倍稀釋液生長差異不大，但好于JXSC-S1 5倍稀釋液和S6 5倍稀釋液培養(yǎng)；第2個培養(yǎng)周期中，本地品系JXSC-S1在廢水原液、2倍稀釋液、5倍稀釋液和S6 5倍稀釋液中D560均達(dá)到0.8以上，最大比生長速率分別為1.18、1.12、0.78、0.73/d，均較第一周期慢；第3個培養(yǎng)周期中，生長都有明顯減緩，除S6 5倍稀釋液外，其它均達(dá)到0.8以上。JXSC-S1每個周期培養(yǎng)均達(dá)到0.8，可以看出這個藻種應(yīng)用于廢水連續(xù)批次培養(yǎng)可行的，但隨每個周期生長變慢，可能細(xì)菌和有毒代謝物質(zhì)抑制。

圖3　本地品系JXSC-S1和S6在不同廢水稀釋液中

實驗結(jié)果表明，本地品系JXSC-S1對于本地溫室甲魚廢水的適應(yīng)性優(yōu)于S6品系螺旋藻。螺旋藻通過光合作用將廢水中N、P等營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成自身有機物。歇爾福德耐受定律表明，微藻在生長過程中對所有的環(huán)境影響因素均有其特定的承受范圍，超過其耐受范圍的環(huán)境條件會抑制微藻的光合作用[20]；經(jīng)預(yù)處理的廢水COD、色度等對螺旋藻種生長有明顯抑制作用的因子均降至一定水平(螺旋藻可承受范圍)，由此判斷影響螺旋藻生長的主要限制因子是氨氮濃度[14]。

本地品系JXSC-S1的增長速率隨廢水稀釋倍數(shù)的增加而減小，而S6品系螺旋藻則相反，生長速率隨廢水稀釋倍數(shù)增加而增大。這可能是因為本地藻種JXSC-S1對廢水中氨氮的濃度耐受性較高，廢水原液中氨氮不對其正常生長產(chǎn)生抑制，培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分含量是決定其生長速率的關(guān)鍵因素；而對于S6品系螺旋藻，廢水原液中氨氮有抑制作用，需要稀釋才能降低抑制。

3結(jié)論和討論

(1)從本地溫室甲魚廢水池中分離得到高耐污螺旋藻種，藻絲顏色，螺寬、螺距、末端細(xì)胞特征、細(xì)胞長寬等形態(tài)特征符合鈍頂螺旋藻基本特征。

(2)本地分離藻種JXSC-S1在Zarrouk培養(yǎng)基中的生長速率(1.64/d)和生長代時(13.96 h)與S6、S2相似，但在廢水中的生長速率(1.55/d)遠(yuǎn)優(yōu)于其它典型鈍頂螺旋藻。能夠在廢水原液中連續(xù)培養(yǎng)并快速生長，生長速率與Zarrouk培養(yǎng)基中的生長速率相同，外觀顏色和藻絲特征差別不大，意味著該本地藻種在用溫室甲魚廢水代替昂貴的Zarrouk培養(yǎng)基大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)飼料蛋白方面有很大應(yīng)用潛力。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

收稿日期：2015-05-18；

修訂日期：2015-11-24

第一作者簡介：羅金飛，男，助理研究員，主要研究方向為水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水資源化利用研究。E-mail:wsljf@126.com 通訊作者：蔣路平。E-mail:jlp196209@sina.com

中圖分類號：S963.21

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)04-0077-06

A Spirulina sp.isolated from greenhouse turtle breeding wastewater and its growth dynamics

LUO Jin-fei1,JIANG Lu-ping1,ZHU Jian-long2,ZHU Jie-zhou3

(1.FisheryTechnologyExtensionCenterofJiaxingcity,Jiaxing314050,Zejiang,China;2.EarthtechEnviromentalTechnologyCo.,Ltd.,JiaXing,Jiaxing314006,Zejiang,China;3.MarineEnvironmentMonitoringStationofJiaxingCity,Jiaxing314050,Zejiang,China)

Abstract：Spirulina sp.JXSC-S1 was isolated from a turtle-breeding wastewater pool in greenheuse in Jiaxing.Morphological studies revealed that the color,shape,spiral pitch,spiral wide and cell size of the strain fit the typical morphological characteristics of Spirulina platensis.Growth dynamics of the strain were then studied in both Zarrouk medium and turtle-breeding wastewater(TBW) in greenhouse,and the results were compared with those of several typical S.platensis strains S6,S2 and Ns-90020.All the strains grew well in Zarrouk medium.The strain JXSC-S1 demonstrated a maximum growth rate of 1.64/d,similar to that of S6 and S2,while faster than Ns-90020.When the culture medium was changed to TBW,all the strains grew seldomly except for the strain JXSC-S1 which grew fast and remained almost the same maximum growth rate as in Zarrouk medium.Rich in protein and bioactive mateirials,Spirulina sp.JXSC-S1 might be used for recycling nitrogen and phosphorus from TBW.

Key words：Spirulina platensis;morphological identification;growth characteristics;filaments

資助項目：浙江省科技項目(2015C32115) ：甲魚養(yǎng)殖廢水生態(tài)處理和循環(huán)再利用的關(guān)鍵技術(shù)研究