堆肥中高效纖維素降解菌的篩選與鑒定

李丹花等

摘要：從邯鄲地區(qū)堆肥中分離出5株具有纖維素降解能力的菌株，纖維素降解能力的初步鑒定結(jié)果顯示，M1菌株具有較強的纖維素降解能力。對M1菌株進行分子鑒定和生長特性的初步鑒定，結(jié)果表明，M1菌株應(yīng)當歸屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），菌株的溫度生長范圍為10～45 °C，最適生長溫度為30 °C，pH 6～8菌株均可生長，最適條件為pH 6。

關(guān)鍵詞：土著菌；纖維素降解；假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）；生長特性

中圖分類號：X705 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）16-3884-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.013

Isolation and Identification of Cellulolytic Bacteria for Composting

LI Dan-hua， QIAO Li-juan， YUE Dan，ZAN Li-feng， DUAN Bao-ning， BAI Lan-suo

（College of Biology Science and Project， Handan College， Handan 056005，Hebei， China）

Abstract：Five cellulolytic bacteria were isolated from composting of Handan region. Cellulose degradation ability was preliminarily measured. The results showed that strain M1 has strong ability of cellulose degradation. Molecular identification and growth characteristics then were identified. The results showed that strain M1 should belong to the Pseudomonas sp.Growth temperature ranged from 10 ℃ to 45 ℃. The optimum growth temperature was 30 ℃. The strain could grow under the pH value from 6 to 8， the optimum growth pH value was 6.

Key words：indigenous bacteria；cellulose degradation；Pseudomonas；growth characteristics

當前，農(nóng)村環(huán)境污染日趨嚴重，尤其是農(nóng)村生活垃圾、畜禽養(yǎng)殖廢棄物及農(nóng)作物秸稈等主要農(nóng)村固體廢棄物已成為污染農(nóng)村環(huán)境的主要因素，影響著農(nóng)村建設(shè)的進程。堆肥化處理技術(shù)是解決農(nóng)村固體廢棄物問題的一個重要途徑，是目前使廢棄物無害化、減量化和資源化的關(guān)鍵技術(shù)[1]。在高纖維含量的堆肥或者添加秸稈、木屑等調(diào)節(jié)劑[2]的堆肥處理中，其成分和結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以被大多數(shù)微生物直接作為碳源物質(zhì)而轉(zhuǎn)化利用，已成為縮短堆肥周期、提高堆肥效率的限制性因素，因此，纖維素的生物降解成為堆肥技術(shù)處理有機固體廢棄物的關(guān)鍵，一些研究者就堆肥纖維素分解菌進行了研究，篩選出很多高效的降解菌株[3，4]。

有研究表明，在堆肥過程中強化接種高效微生物菌株可以增加堆體中的微生物數(shù)量，利用微生物菌群間的相互協(xié)同作用促進堆肥材料的腐熟，提高堆肥效率，但是由于堆肥物料成分復(fù)雜，接種外源微生物菌株與堆肥土著微生物之間有時也存在競爭，致使二者均不能充分發(fā)揮其作用[5，6]。因此，如能將土著菌的高效菌株強化接種到堆肥中，將能更好地發(fā)揮微生物菌劑的作用，加快固體廢棄物中有機物的分解，提高堆肥腐熟度。

本研究從邯鄲地區(qū)堆肥中篩選到一株降解纖維素的高效土著菌，并對其進行分子鑒定，初步研究其生長特性，旨在為堆肥提供優(yōu)良纖維素分解菌株，加快堆肥中纖維素的分解，以進一步優(yōu)化堆肥進程。同時也為構(gòu)建土著菌組成的高效微生物菌劑奠定基礎(chǔ)[7]。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和處理

豬糞堆肥樣品采自邯鄲市種豬場常年堆肥車間。取腐熟堆肥發(fā)酵物帶回實驗室。取腐熟發(fā)酵物1 g放入無菌錐形瓶中，加入9 mL蒸餾水稀釋至0.1 g/mL，加入玻璃珠振蕩培養(yǎng)1 h備用。

1.2 培養(yǎng)基配方

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基組分為：CMC-Na 10.00 g、KH2PO4 1.00 g、NaCl 0.10 g、MgSO4 ·7H2O 0.30 g、NaNO3 2.50 g、FeCl3 0.01 g、CaCl2 0.10 g、瓊脂 18.00 g、蒸餾水1 L；剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基組分為：CMC-Na 10.00 g、KH2PO4 1.00 g、NaCl 0.10 g、MgSO4 ·7H2O 0.30 g、NaNO3 2.50 g、FeCl3 0.01g 、CaCl2 0.10 g、剛果紅 0.20 g、瓊脂 18.00 g、蒸餾水1 L；LB培養(yǎng)基組分：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。所有培養(yǎng)基于121 ℃下滅菌30 min備用。

1.3 菌種的分離純化

發(fā)酵物菌液按照梯度稀釋法稀釋，取稀釋度為10-2～10-5的懸濁液200 μL分別涂布于羧甲基纖維素鈉分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)物放入28 ℃恒溫箱培養(yǎng)，將長出的菌落接種至LB培養(yǎng)基上進行劃線純化。

1.4 分解纖維素能力鑒定

將純化好的菌株點接到剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫箱培養(yǎng)5 d，量取透明圈直徑（D）和菌圈直徑（d），并計算出比值HC（D/d），從而判定菌株的纖維素分解能力。

1.5 菌株的分子鑒定

用細菌DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取細菌基因組DNA，以基因組DNA為模板，27F和1 492R為16S rDNA引物進行分子鑒定。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）回收大約1.5 kb的目的條帶，連接到pGM-T載體（北京索萊寶科技有限公司）上，轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細胞中，將陽性重組子送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。將測定得到的16S rDNA序列通過BLAST軟件與GenBank中相關(guān)序列進行比對，并利用MEGA 5.0軟件進行聚類分析構(gòu)建進化樹。

1.6 不同溫度對菌株M1生長的影響

將M1菌株的菌液以1%的接種量接種于5 mL LB培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)于10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55和60 ℃系列搖床內(nèi)，搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min，2 d后測定菌株的生長量。每個處理重復(fù)3次。

1.7 不同pH對菌株M1生長的影響

將M1菌株的菌液以1%的接種量分別接種于pH 2.0、4.0、6.0和8.0的5 mL LB培養(yǎng)基中，置于30 ℃、100 r/min 的搖床上培養(yǎng)，2 d后測定菌株的生長量。每個處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分解纖維素能力鑒定

腐熟發(fā)酵物樣品經(jīng)羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和LB培養(yǎng)基劃線純化培養(yǎng)后共得到5株形態(tài)不同的菌株，分別命名為M1-M5。5株菌都可以在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上生長，具有降解纖維素的能力。同時測定菌株在剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基中生長時的HC值（D/d），對篩選到的菌種進行分解纖維素能力的初步鑒定，結(jié)果如表1所示。

M1-M5菌株的HC值表明，M1菌株的HC值最高。前人研究表明[4]，HC值超過2.50的菌株纖維素酶活性高，M1菌株的HC值為2.50，具有較強的纖維素降解能力。

2.2 菌株鑒定結(jié)果

將菌株M1的16S rDNA測序結(jié)果用BLAST軟件進行同源性比較，菌株M1的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。結(jié)果表明，M1菌株序列與多個假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）菌株的16S rDNA序列相似性都達到99%，與Pseudomonas sp. JC5菌株處在同一個分支上，因此，將菌株M1歸屬于Pseudomonas sp.。

2.3 M1菌株生長特性

M1菌株生長特性如圖2所示，由圖2可知，菌株的溫度生長范圍為10～45 ℃，最適生長溫度在30 ℃左右，當溫度高于45 ℃時，菌株幾乎不能生長。pH 6～8條件下菌株均可生長，最適條件為pH 6，pH<4或pH>10，菌株均不能生長。

3 小結(jié)與討論

本試驗從腐熟堆肥發(fā)酵物中篩選到5株形態(tài)不同的菌株。分別命名為M1-M5。5株菌都可以在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上生長，具有降解纖維素的能力。同時測定菌株在剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基中生長時的HC值，M1菌株的HC值最高（2.50），具有較強的纖維素降解能力。

對菌株M1進行分子鑒定，結(jié)果表明，M1菌株序列與多個假單胞菌屬菌株的16S rDNA序列相似性都達到99%，與Pseudomonas sp. JC5菌株處在同一個分支上，因此，將菌株M1歸屬于Pseudomonas sp.。對假單胞菌屬菌株降解性能的研究多集中于降解有毒有害物質(zhì)[8]，如降解蛋白質(zhì)、淀粉及脂肪等[9]，但對該屬中纖維素降解菌的研究較少，因此，該菌在菌株綜合應(yīng)用中具有較大的潛力。

初步測定菌株M1的生長特性，結(jié)果表明，菌株的溫度生長范圍為10～45 ℃，最適生長溫度為30 ℃，高于45 ℃時菌株幾乎不能生長，可以據(jù)此判定此菌為中溫型細菌。pH 6～8條件下菌株均可生長，最適條件為pH 6，pH<4或pH>10時菌株均不能生長。

本研究著眼于篩選邯鄲地區(qū)堆肥中具有較高纖維素降解能力的土著菌，并對高效的土著菌菌株進行分子鑒定和生長特性的初步鑒定。此研究為具有高效纖維素降解能力的土著菌的堆肥應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)，具有較大的應(yīng)用潛力。同時為制備高效的新型微生物菌劑奠定基礎(chǔ)。

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