黔西北優(yōu)質(zhì)蜜環(huán)菌菌株的初步篩選

王彩云+王永+嚴(yán)顯進(jìn)

摘要：比較5株黔西北本地蜜環(huán)菌與引進(jìn)的A9菌株的生長速度、生物量、菌索形態(tài)、熒光強(qiáng)度等生物學(xué)特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各菌株間存在明顯差異，菌索平均生長速度依次為MHJ-3>MHJ-1=A9>MHJ-6>MHJ-7>MHJ-8，菌索平均生物量依次為MHJ-3>A9>MHJ-1>MHJ-6>MHJ-8>MHJ-7，MHJ-3在菌絲萌發(fā)速度、分枝狀況、熒光強(qiáng)度及暗培養(yǎng)20 d后菌索生物量等生長特性方面均優(yōu)于A9。5株本地天麻共生蜜環(huán)菌中，菌株MHJ-3活性最強(qiáng)、性狀最優(yōu)，MHJ-1菌株次之。

關(guān)鍵詞：天麻；蜜環(huán)菌；黔西北；優(yōu)質(zhì)菌株；生長特性

中圖分類號： Q949.329+.81 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0117-03

蜜環(huán)菌（Armillaria mellea）別稱榛蘑、榛子蘑，屬擔(dān)子菌亞門（Basiaiomycotina）傘菌目（Agaricales）白蘑科（Trichfomataceae）蜜環(huán)菌屬[1]。自1790年Vahl首次鑒定蜜環(huán)菌后，發(fā)現(xiàn)蜜環(huán)菌在全世界廣泛存在，且能侵染600多種樹木[2-4]，并導(dǎo)致林木根腐病，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但其致病性并非絕對的，有些植物被侵染后生長旺盛，如天麻（Gastrodia elata）、豬苓（Polyporus umbellatus），因此蜜環(huán)菌由于其致病性及特殊性成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)[5-6]。此外，蜜環(huán)菌又是一類藥食兼用菌，具有重要價(jià)值，其產(chǎn)品制劑是治療眩暈、頭痛、神經(jīng)衰弱的有效藥物，目前已廣泛應(yīng)用于臨床治療[7]；其深層發(fā)酵產(chǎn)物中富含多糖、必需氨基酸、倍半萜類及嘌呤類化合物等多種有效成分[8]，具有較強(qiáng)的增智健腦、鎮(zhèn)痙熄風(fēng)、神經(jīng)調(diào)節(jié)、延緩衰老以及抗癌等藥理作用[9-11]，并可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，與天麻藥理作用及臨床療效類似[12]。

目前由于野生天麻資源的大量采挖導(dǎo)致市場供求關(guān)系緊張，天麻仿野生種植成為開發(fā)市場、提高產(chǎn)量的重要手段。用于栽培天麻的蜜環(huán)菌經(jīng)連續(xù)無性繁殖，菌種會發(fā)生嚴(yán)重退化，從而導(dǎo)致天麻的產(chǎn)量和天麻素含量的急劇下降[13]，黔西北地區(qū)栽培天麻所用的蜜環(huán)菌大多為引進(jìn)種，且已出現(xiàn)菌索細(xì)、生長緩慢、易感雜、抗旱能力差等缺陷，仿野生栽培中出現(xiàn)菌索過細(xì)、“空窩”、菌索過早干枯等狀況[14]，這些問題嚴(yán)重影響了天麻的產(chǎn)量及質(zhì)量。此外，趙俊和趙杰研究表明，全國各個(gè)地區(qū)天麻種類不同且存在地域差異，跨區(qū)域引進(jìn)菌種或推廣存在不科學(xué)性[15]。因此，選育適宜當(dāng)?shù)胤N植的優(yōu)良蜜環(huán)菌菌株成為天麻仿野生栽培綜合配套技術(shù)研究的瓶頸，也是提高天麻產(chǎn)量與質(zhì)量的迫切問題。本研究針對黔西北地區(qū)長期引種造成的蜜環(huán)菌菌種退化及天麻產(chǎn)量、質(zhì)量下降等問題，比較5株本地野生蜜環(huán)菌及引進(jìn)種A9的菌索生長速度、平均生物量、熒光反應(yīng)強(qiáng)度等生物學(xué)特性，以期為黔西北地區(qū)篩選出較好的天麻伴生蜜環(huán)菌菌株，為解決蜜環(huán)菌的跨地區(qū)引種問題提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

蜜環(huán)菌MHJ-1、MHJ-3、MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8從黔西北地區(qū)野生天麻生長地長有蜜環(huán)菌的菌材上分離獲得（表1），蜜環(huán)菌A9購自陜西省西鄉(xiāng)食用菌研究所。

1.2 培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基（200 g馬鈴薯、20 g 蔗糖、8 g瓊脂、1 000 mL 水）、PDA半固體培養(yǎng)基（200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、5 g瓊脂、1 000 mL水）、PDA液體培養(yǎng)基（200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、1 000 mL水），按常規(guī)方法制作。試管PDA斜面培養(yǎng)基：配制PDA培養(yǎng)液（200 g馬鈴薯、20 g蔗糖、8 g瓊脂、1 000 mL 水），裝入試管中達(dá)試管1/3，滅菌后，45°傾斜放置至培養(yǎng)基冷卻。所有培養(yǎng)基均在101 kPa、121 ℃下滅菌 20 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蜜環(huán)菌菌索分離 將長有蜜環(huán)菌的菌材削去外層樹皮，用洗潔精清洗后于自來水下自然沖洗30 min。轉(zhuǎn)移到超凈工作臺中，75%乙醇浸泡45 s后用無菌水沖洗5次，再用0.1% HgCl2溶液中浸泡約8 min，取出后用無菌水沖洗5次，取出置于無菌培養(yǎng)皿中，用無菌濾紙吸凈表面水后，切成 1.0 cm×0.5 cm左右大小，置于PDA試管斜面上，每支試管放置一段時(shí)間。25 ℃暗培養(yǎng)，定期觀察記錄。

1.3.2 生長速度測定 在PDA培養(yǎng)皿上接種蜜環(huán)菌菌種，每皿接種量為1根長0.7 cm的成熟菌索段，在25 ℃下靜置暗培養(yǎng)，每3 d測量每組菌索的生長速率，直至菌索停止生長，然后計(jì)算菌索平均生長速率；觀察記錄菌索顏色、密度、粗細(xì)、分枝數(shù)等指標(biāo)，每組3次重復(fù)。

1.3.3 生物量測定 將100 mL PDA液體培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，用封口膜封口，121 ℃滅菌20 min，冷卻后挑取1塊0.5 cm×0.5 cm的菌塊于三角瓶中，在25 ℃下黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，每隔48 h觀察菌絲體和菌索的形態(tài)特征。20 d后在網(wǎng)袋上用自來水沖洗菌索上附著的培養(yǎng)基，洗凈后的培養(yǎng)物在50 ℃下烘干，冷卻后稱其質(zhì)量，每組3次重復(fù)。

1.3.4 其他培養(yǎng)性狀對比 在培養(yǎng)瓶中倒入30 mL PDA半固體培養(yǎng)基，并接種蜜環(huán)菌，每瓶接種1塊0.5 cm×0.5 cm的菌塊，接種后于25 ℃、相對濕度80%的條件下靜止暗培養(yǎng)，每24 h觀察1次生長情況，并記錄菌絲萌發(fā)和菌索開始生長的時(shí)間，菌索形態(tài)、生長狀況及熒光反應(yīng)等生長特性。

2 結(jié)果與分析

2.1 各蜜環(huán)菌的生長速度對比

6株蜜環(huán)菌在相同生長條件下菌索平均生長速度存在差異，其中蜜環(huán)菌MHJ-3的菌索生長速度最快，平均生長速度達(dá)1.17 cm/d；其次是MHJ-1和A9，其平均生長速度均為0.95 cm/d；MHJ-6、MHJ-7次之；MHJ-8菌株平均生長速度最慢，僅為0.60 cm/d。此外，MHJ-3和MHJ-1、A9的生長速度達(dá)到顯著差異，與MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8的生長速度達(dá)到極顯著差異；蜜環(huán)菌MHJ-1與A9在生長速度上無顯著差異，與MHJ-7、MHJ-8的菌索生長速度差異極顯著（表2）。

2.2 各蜜環(huán)菌的生物量對比

6株蜜環(huán)菌在25 ℃下暗培養(yǎng)20 d后生物量存在明顯差異，其中MHJ-3的生物量最大，平均生物量達(dá)1.580 6 g，比對照菌株A9的平均生物量（1.537 6 g）高約2.6%；其他4株菌株的生物量均低于A9，其中MHJ-7的平均生物量最小，僅為0.948 6 g。此外，蜜環(huán)菌MHJ-3與A9的生物量差異顯著，與MHJ-1、MHJ-6、MHJ-8、MHJ-7菌株的生物量差異極顯著；對照菌株A9的生物量與MHJ-1、MHJ-6、MHJ-8、MHJ-7菌株的生物量之間存在極顯著差異；MHJ-1與MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8的生物量間存在極顯著差異；菌株MHJ-8與MHJ-7的生物量差異不顯著（表3）。

2.3 各蜜環(huán)菌的培養(yǎng)特征比較

6株菌株在25 ℃下培養(yǎng)時(shí)，各菌株菌絲萌發(fā)時(shí)間、菌索開始生長時(shí)間、菌索分枝狀況及熒光反應(yīng)強(qiáng)度等生長特性有所不同，尤其是菌索的分枝特征和熒光反應(yīng)強(qiáng)度尤為明顯（表4）。其中，蜜環(huán)菌MHJ-3的菌菌絲萌發(fā)最快，菌索粗壯且分枝多，培養(yǎng)過程中無黑色素產(chǎn)生，生長均勻，熒光反應(yīng)強(qiáng)烈，生長特性最好。對照菌A9菌索黃白色、粗壯、分枝多，但菌索部分卷曲，且有少量黑色素產(chǎn)生，其活性及生長特性弱于蜜環(huán)菌MHJ-3。蜜環(huán)菌MHJ-1生長狀態(tài)及活性與A9相當(dāng)，雖然其菌索不及A9粗壯，但其菌索有網(wǎng)狀分枝，且各菌索生長均勻，在培養(yǎng)過程中無黑色素產(chǎn)生，整體生長性狀較優(yōu)良。蜜環(huán)菌MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8在培養(yǎng)過程中，菌索由白色逐漸變?yōu)榧t棕色，且有黑色素產(chǎn)生，但各菌株的生長狀態(tài)也有差異，MHJ-6菌索較粗、分枝多，但生長不均勻，部分卷曲；MHJ-7、MHJ-8的菌索均稍細(xì)、分枝少，生長狀態(tài)及活性整體弱于對照菌A9。

3 結(jié)論與討論

蜜環(huán)菌進(jìn)行多代天麻栽培后出現(xiàn)明顯的菌種退化與變異，如用已發(fā)生退化的菌種伴栽天麻則會導(dǎo)致天麻產(chǎn)量與品質(zhì)急劇下降[16]。不科學(xué)性的跨地區(qū)引種及長期引用同樣的菌種會造成天麻減產(chǎn)，因此本研究加大了對黔西北地區(qū)蜜環(huán)菌的篩選力度，致力于選出適合于本地種植的優(yōu)良蜜環(huán)菌。

目前，篩選優(yōu)良蜜環(huán)菌主要依據(jù)菌索生長速度、生物量、分枝數(shù)量、生長勢、菌索的粗細(xì)、菌絲萌發(fā)和菌索產(chǎn)生的時(shí)間、熒光反應(yīng)強(qiáng)度等標(biāo)準(zhǔn)[17]。本試驗(yàn)基于以上幾點(diǎn)，對黔西北本地5株野生天麻共生蜜環(huán)菌和1株外來優(yōu)良天麻共生蜜環(huán)菌菌株進(jìn)行了研究，本地菌株MHJ-3菌索生長速度、分枝狀況、菌索生物量、熒光反應(yīng)強(qiáng)度等特性均強(qiáng)于A9，為所有篩選菌株中表現(xiàn)最突出的菌株。菌株MHJ-1除生物量弱于A9外，生長速度等指標(biāo)均與A9基本持平，其余3株蜜環(huán)菌菌株的菌索平均生長速度、平均生物量、熒光強(qiáng)度等實(shí)驗(yàn)室生理性狀指標(biāo)均弱于A9。從基本試驗(yàn)性狀來看，5株本地蜜環(huán)菌中，MHJ-3菌株的活性最強(qiáng)、性狀最優(yōu)，MHJ-1次之。

大量研究表明，蜜環(huán)菌不同菌株對天麻產(chǎn)量會產(chǎn)生不同的影響[18]，且不同的蜜環(huán)菌-天麻組合對天麻素含量有顯著影響[15]，在實(shí)際生產(chǎn)中，培養(yǎng)蜜環(huán)菌主要是為了伴栽天麻，因而蜜環(huán)菌的品質(zhì)直接影響到天麻的產(chǎn)量和品質(zhì)。由于不同的地理區(qū)域分布著不同種類的蜜環(huán)菌[15]，且蜜環(huán)菌種類繁多，因此并非所有的蜜環(huán)菌都與黔西北地區(qū)天麻具有良好的共生關(guān)系。而本地蜜環(huán)菌MHJ-3、MHJ-1菌株與黔西北地區(qū)天麻是否具有良好的共生關(guān)系、能否有效提高天麻產(chǎn)量及質(zhì)量，還有待于進(jìn)一步的野外觀察證明。

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