時間分辨熒光技術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測乙型肝炎兩對半指標的比對分析

江培濤,楊　健,楊正南

(南京鼓樓醫(yī)院集團儀征醫(yī)院檢驗科,江蘇揚州 211900)

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·臨床研究·

時間分辨熒光技術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測乙型肝炎兩對半指標的比對分析

江培濤,楊健,楊正南

(南京鼓樓醫(yī)院集團儀征醫(yī)院檢驗科,江蘇揚州 211900)

摘要:目的通過比對時間分辨熒光技術(shù)(TRFIA)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)對血清標本中乙型肝炎兩對半指標的檢測結(jié)果，驗證這兩種方法是否具有等效性。方法分別用TRFIA及ELISA檢測160份臨床標本的兩對半指標，記錄檢驗結(jié)果并對檢驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果經(jīng)過配對資料χ2檢驗分析，兩種方法測定乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗體(HBeAb)、乙型肝炎核心抗體(HBcAb)時結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論兩種檢測方法均可用于臨床乙型肝炎兩對半指標的檢測，但TRFIA優(yōu)于ELISA的靈敏度和特異度。

關鍵詞:時間分辨熒光技術(shù)；酶聯(lián)免疫吸附試驗；乙型肝炎兩對半

乙型肝炎兩對半是目前國內(nèi)醫(yī)院最常用的乙型肝炎病毒(HBV)感染檢測血清標志物，兩對半檢查項目包括：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗體(HBeAb)、乙型肝炎核心抗體(HBcAb)。因為核心抗原的檢測方法較復雜，臨床上通常不做，所以在“乙型肝炎五項”檢查中，前四項是兩對，核心抗體是半對，因此被稱為乙型肝炎兩對半。兩對半的檢測對于乙型肝炎患者的診斷和治療以及健康人群病毒攜帶的篩查和預防免疫接種都具有重要意義。目前，用于檢測乙型肝炎兩對半的方法主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，該方法具有靈敏度高、特異度強、操作簡便等特點，但該法主要用于定性檢測[1]。隨著免疫分析技術(shù)的不斷進步以及臨床對實驗室要求的不斷提高，熒光免疫自動化分析技術(shù)已被逐漸應用于臨床，時間分辨熒光免疫技術(shù)(TRFIA)就是以抗原抗體反應與熒光物質(zhì)發(fā)光和時間分辨技術(shù)相結(jié)合的近代熒光廣譜技術(shù)。由于該方法具有靈敏度高、特異度好、檢測范圍寬、環(huán)境污染小等特點，是目前最具有發(fā)展前途的超微量分析技術(shù)，其檢測下限可達5×10-14mol/L[2]，能用于臨床定量檢測乙型肝炎兩對半指標。本研究通過比較TRFIA及ELISA的檢測結(jié)果，評價時間分辨熒光技術(shù)用于乙型肝炎兩對半檢測的價值。

1資料與方法

1.1一般資料收集本院2013年1月至2014年12月門診及住院乙型肝炎患者和健康體檢者共160例血清，其中健康體檢人員46例。標本無脂血、黃疸、溶血。

1.2儀器與試劑ANYTEST時間分辨熒光免疫分析儀、EFFICUTA全自動標本前處理系統(tǒng)及相關定量檢測試劑盒由蘇州新波生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；PW-960Plus全自動酶標洗板機由深圳匯松科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；乙型肝炎兩對半ELISA檢測試劑盒由上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)；BIO-RAD Model680酶標儀由美國伯樂公司生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1TRFIA檢測兩對半指標準備好洗滌液及銪標記物等試劑并將試劑與相應數(shù)量的微孔反應條置室溫中平衡；吸取100 μL樣品及校準品按相應順序加入微孔反應條中；室溫條件下震蕩孵育40 min；孵育結(jié)束后每孔注入洗滌液400 μL，重復洗滌4次；每孔加入100 μL銪標記物，室溫條件下震蕩孵育40 min；結(jié)束后同上重復洗滌6次；每孔中加入增強液100 μL，室溫條件下震蕩孵育5 min；上述步驟均由EFFICUTA全自動標本前處理系統(tǒng)自動完成。之后將微孔反應板條插入ANYTEST時間分辨熒光分析儀進行檢測分析。

1.3.2ELISA檢測兩對半指標準備好洗滌液及相應數(shù)量的微孔反應板條，核心抗體的檢測標本用生理鹽水作1∶30稀釋；加入50 μL待測標本和陰、陽性對照于反應微孔中，預留空白對照；在待測標本及陰陽性對照孔中加入酶結(jié)合物50 μL;將反應板條用封板紙覆蓋并在振蕩器上震蕩混勻10 s后置37 ℃孵育30 min；取出反應板撕去封板紙，洗滌反應板5次；洗滌結(jié)束后每孔加入顯色劑A液、顯色劑B液各50 μL，充分混勻，封板后置37 ℃孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，混勻；用酶標儀讀數(shù)，取波長450 nm，先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。

1.3.3兩種方法的線性范圍及最低檢測濃度的比較將1例HBsAg強陽性血清進行倍比稀釋后分別用兩種方法檢測并記錄結(jié)果。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1TRFIA及ELISA檢測結(jié)果采用TRFIA及ELISA檢測160份標本乙型肝炎兩對半指標，見表1。TRFIA和ELISA對160份標本中HBsAg的陽性檢出率分別為58.75%和56.88%，對HBsAb的陽性檢出率為52.50%和46.25%，對HBeAg的陽性檢出率為35.00%和30.00%，對HBeAb的陽性檢出率為46.88%和43.75%，對HBcAb的陽性檢出率為70.00%和63.13%，兩種方法的結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2兩種方法檢測HBsAg的線性范圍及最低濃度將1份HBsAg強陽性血清進行倍比稀釋后分別用兩種方法檢測HBsAg的線性范圍及檢測最低濃度，見表2。

表1　TRFIA及ELISA檢測結(jié)果(n)

表2　兩種方法檢測HBsAg的線性范圍及最低濃度

3討論

有資料表明，我國大約有0.93億HBV攜帶者[3]，乙型肝炎血清抗原抗體檢測是臨床診斷HBV感染及判斷預后的傳統(tǒng)指標。(1)HBsAg主要在感染HBV后1～2個月在血清中出現(xiàn)，陽性常見于乙型肝炎潛伏期和急性期，慢性遷延性肝炎、活動性肝炎、肝硬化、肝癌及慢性HBsAg攜帶者。(2)HBsAb是針對HBsAg產(chǎn)生的中和抗體，表明機體具有一定的免疫力，一般在HBsAg轉(zhuǎn)陰后出現(xiàn)，是疾病恢復的開始，陽性提示機體曾感染過HBV或接種過乙型肝炎疫苗，可持續(xù)多年，其滴度與特異性保護作用相平行。(3)HBeAg陽性表明患有乙型肝炎，是病毒復制活躍傳染性強的標志，常在HBsAg陽性的血清中檢出，其持續(xù)陽性者易轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝住?4)HBeAb出現(xiàn)于急性感染的恢復期，陽性多見于HBeAg轉(zhuǎn)陰的患者，意味著HBV被部分清除，傳染性減低，部分慢性肝炎，肝硬化，肝癌患者可持續(xù)陽性。(5)HBcAb是反映肝細胞受到HBV侵害的一種指標，抗HBc-IgG在機體感染HBV后1個月左右開始升高，高滴度的抗HBc-IgG表明患有乙型肝炎[4-6]。

本研究表1結(jié)果顯示，TRFIA和LEISA對乙型肝炎兩對半指標的檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本研究表2結(jié)果顯示，TRFIA對HBsAg的最低檢出濃度為0.13 ng/mL，與國內(nèi)報道一致[7]。而ELISA則為0.49 ng/mL。這表明ELISA對低濃度的標本存在假陰性的問題，這是由于ELISA雙抗體夾心法檢測小分子半抗原的過程中，若待測抗原濃度過高則易產(chǎn)生鉤狀效應[1]，使最終測定結(jié)果低于實際濃度。另有文獻[8]報道,低濃度的HBsAg可能與S基因的變異和自身免疫狀況有關。臨床實驗室在遇到超過檢測下限的可疑標本時，應進一步用其他方法測定。

TRFIA是以抗原抗體反應與鑭系元素螯合物被激發(fā)后產(chǎn)生特異熒光相結(jié)合的近代熒光技術(shù)，具有高特異度，高敏感度，不污染環(huán)境等優(yōu)點 。ELISA方法中，HBeAb和HBcAb采用競爭一步法測定，其方法上的局限性和人為因素的干擾相對較多，而TRFIA方法操作自動化，避免了孵育時間、溫度及手工加樣等因素的干擾，因而測定結(jié)果相對更為客觀、準確[9]。但由于銪標記物易受環(huán)境中粉塵污染而造成假陽性的可能，因而也需要進一步完善和優(yōu)化。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.059

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)13-1877-03

(收稿日期：2016-03-15修回日期：2016-04-18)