特發(fā)性心房顫動相關(guān)TBX5基因新突變的識別

鄭洪珍　仇興標(biāo)　李若谷　袁　方　徐迎佳　楊奕清

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特發(fā)性心房顫動相關(guān)TBX5基因新突變的識別

鄭洪珍仇興標(biāo)李若谷袁方徐迎佳楊奕清

200030上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院心內(nèi)科

【摘要】目的：識別特發(fā)性心房顫動(房顫)相關(guān)TBX5基因新突變。方法：入選特發(fā)性房顫患者116例及健康對照者200名，獲取臨床資料和外周靜脈血標(biāo)本，抽提全部研究對象的基因組DNA，擴(kuò)增TBX5基因的全部編碼外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子，對擴(kuò)增片段進(jìn)行測序以尋找變異。檢索PubMed和SNP數(shù)據(jù)庫以明確所發(fā)現(xiàn)基因變異的新穎性。應(yīng)用MUSCLE軟件分析多物種TBX5蛋白，以顯示被改變氨基酸在進(jìn)化上的保守性，并應(yīng)用在線程序MutationTaster和PolyPhen-2分析基因變異的致病性。結(jié)果：在1例家族史陰性的特發(fā)性房顫患者發(fā)現(xiàn)了1個TBX5基因變異，其TBX5基因編碼核苷酸序列第314位的腺嘌呤變成了胸腺嘧啶(c.314A>T)，所編碼蛋白的氨基酸序列第105位的天冬氨酸變成了纈氨酸(p.D105V)。該突變不存在于200名對照者，也不存在于PubMed和SNP數(shù)據(jù)庫中。多序列比對分析顯示第105位的天冬氨酸在進(jìn)化上完全保守。在線程序分析表明所識別的基因變異具有致病性。結(jié)論：發(fā)現(xiàn)了1個特發(fā)性房顫相關(guān)TBX5基因新突變，提示TBX5基因突變可能是特發(fā)性房顫的少見遺傳病因。

【關(guān)鍵詞】心律失常；心房顫動；遺傳學(xué)；轉(zhuǎn)錄因子；TBX5

心房顫動(房顫) 是最常見的持續(xù)性心律失常，其在總體人群中的發(fā)病率約為1～2%，在老年人群中的發(fā)病率則高達(dá)10%以上。房顫可顯著增加患者的病殘率和病死率以及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。雖然房顫可繼發(fā)于高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心病等基礎(chǔ)疾病，但特發(fā)性房顫主要是由遺傳危險因素所致[1,3]。盡管如此，由于房顫具有顯著的遺傳異質(zhì)性，大部分房顫患者的遺傳缺陷仍有待識別。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，位于TBX5基因內(nèi)的單核苷酸多態(tài)與房顫的易感性增加有關(guān)[4-6]，而且TBX5基因突變可導(dǎo)致包括房顫在內(nèi)的Holt-Oram綜合征即心手綜合征[7]。這些研究結(jié)果提示TBX5基因突變有可能導(dǎo)致特發(fā)性房顫，因此本研究擬識別特發(fā)性房顫相關(guān)TBX5基因突變。

1對象與方法

1.1研究對象

選取2014年2月～2015年1月入本院治療的116例無血緣關(guān)系的中國漢族特發(fā)性房顫患者(男65例，年齡32～60歲，平均53歲)和200名無血緣關(guān)系的中國漢族健康對照者(男110例，年齡35～64歲，平均54歲)。詳細(xì)詢問病史、全面體檢、常規(guī)實驗室檢查、標(biāo)準(zhǔn)12導(dǎo)聯(lián)心電圖檢查以及心臟超聲檢查。特發(fā)性房顫的診斷及其分類依據(jù)2014年發(fā)布的房顫處理指南[8]。簡而言之，患者心電圖表現(xiàn)為P波消失、R-R間隔不等但無結(jié)構(gòu)性心臟病、高血壓病、心肌病等基礎(chǔ)性疾病即可診斷為特發(fā)性房顫。全部房顫患者均經(jīng)心電圖確診，排除繼發(fā)性或綜合征型房顫。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)范，經(jīng)研究對象知情同意后收集其血常規(guī)檢驗后原本丟棄的剩余血，使用基因組DNA純化試劑盒(美國Promega公司)，提取基因組DNA。

1.2方法

1．2．1TBX5基因擴(kuò)增使用以前報道的擴(kuò)增TBX5基因外顯子及側(cè)翼內(nèi)含子的引物序列[9-10]，由上海生工生物工程有限公司合成。以基因組DNA為模板，使用上述引物和HotStar Taq DNA聚合酶(德國Qiagen公司)等聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑，用Veriti型PCR儀(美國Applied Biosystem公司)擴(kuò)增TBX5基因片段。每一PCR反應(yīng)的體積為25 μL,其中5Q溶液5 μL，10×緩沖液2．5 μL， dNTP(各2.5 mmol/L)2 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL, 基因組DNA(200 ng/ μL)1 μL，HotStar Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，雙蒸水13.25 μL。PCR反應(yīng)的條件是：首先95℃預(yù)變性15 min，然后進(jìn)入35個循環(huán)，每個循環(huán)94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，最后72℃延伸5 min。使用凝膠回收試劑盒(德國Qiagen公司)純化所擴(kuò)增的DNA片段。

1．2．2TBX5基因序列分析以純化的DNA片段為模板，使用上述正向引物和BigDye?Terminator v3.1測序試劑盒(美國Applied Biosystem公司)在Veriti型PCR儀(美國Applied Biosystem公司)上進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)的總體積為10 μL,其中預(yù)混合液4 μL，上游引物(2 μmol/L)1 μL，純化的DNA片段(20 ng/ μL)2 μL，雙蒸水3 μL。測序反應(yīng)的條件是：共30個循環(huán)反應(yīng)，其中每個循環(huán)95℃變性20 s，50℃退火15 s，60℃延伸1 min。測序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后在3130 XL 型DNA測序儀(美國Applied Biosystem公司)上進(jìn)行電泳測序。使用 DNA序列分析軟件(美國Applied Biosystem公司)分析測序結(jié)果并與核苷酸數(shù)據(jù)庫中的已知TBX5基因序列(登陸號NG_007373.1)進(jìn)行對比以識別TBX5基因變異。如發(fā)現(xiàn)TBX5基因變異，則對200名健康對照者的TBX5基因進(jìn)行測序，同時檢索PubMed和SNP數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)以明確所發(fā)現(xiàn)基因變異的新穎性。

1．2．3TBX5變異的保守性分析應(yīng)用在線軟件MUSCLE(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，比對分析多物種TBX5蛋白的氨基酸序列，以評估被改變氨基酸在進(jìn)化上的保守性。

1．2．4TBX5變異的致病性分析對于所發(fā)現(xiàn)的TBX5基因變異，應(yīng)用在線軟件MutationTaster(http://www.mutationtaster.org)和PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)分析其致病性。

1．3統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。連續(xù)變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組連續(xù)變量的比較使用Student’st檢驗，分類變量的比較則根據(jù)需要使用Pearson’sχ2檢驗或Fisher 精確概率計算。雙側(cè)統(tǒng)計值P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2結(jié)果

2．1特發(fā)性房顫患者的基本臨床特點(diǎn)

房顫組與對照組的年齡和性別相匹配，心功能相似，均無明確的心血管疾病病史，但房顫組的左心房較大，部分患者有房顫家族史，而對照組中均無房顫家族史。本研究對象的基本臨床特點(diǎn)見表1。

表1　本研究對象的基本臨床特點(diǎn)

2．2發(fā)現(xiàn)TBX5基因新突變

通過對116例特發(fā)性房顫患者的TBX5基因進(jìn)行測序分析，在其中1例58歲男性患者發(fā)現(xiàn)TBX5基因雜合錯義突變，突變檢出率約為0.86%。該患者TBX5基因編碼核苷酸序列第314位的腺嘌呤變成了胸腺嘧啶(c.314A>T)，相應(yīng)地其編碼核苷酸序列第105位的谷氨酸變成了纈氨酸(p.D105V)。該患者在52歲時無明顯誘因突發(fā)心悸，經(jīng)心電圖確診為陣發(fā)性房顫，否認(rèn)房顫家族史。該突變不存在于200名健康對照者。經(jīng)檢索PubMed和SNP數(shù)據(jù)庫均未發(fā)現(xiàn)該突變，表明所識別的突變?yōu)樾峦蛔?。TBX5基因雜合突變及其正常對照序列分別見圖1A和1B。該突變在TBX5蛋白上的位置見圖1C。

2．3突變氨基酸在物種進(jìn)化上高度保守

如圖2所示，將人TBX5蛋白之氨基酸序列與大猩猩、猴子、狗、牛、小鼠、大鼠、家禽、斑馬魚和青蛙的進(jìn)行比對分析顯示，人TBX5蛋白之氨基酸序列第105位的谷氨酸在物種進(jìn)化上完全保守。

圖1　TBX5基因雜合突變序列(A)、正常對照序列(B)及突變氨基酸位置(C)(圖中箭頭所指為突變位點(diǎn)及其對照)

圖2　多物種TBX5蛋白之氨基酸序列比對分析結(jié)果(圖中陰影標(biāo)示突變氨基酸)

2．4TBX5新突變具有致病性

TBX5基因變異c.314A>T經(jīng)MutationTaster預(yù)測為致病性突變，預(yù)測正確的概率值為1。另外，TBX5變異p.D105V 也被PolyPhen-2預(yù)測為致病性突變，預(yù)測正確的概率值為1(預(yù)測的敏感性為0，特異性為1.00)。

3討論

本研究在1特發(fā)性房顫患者發(fā)現(xiàn)了1個TBX5基因新突變，該突變不存在于200名健康對照者，多物種TBX5蛋白之氨基酸序列比對分析顯示被改變氨基酸在物種進(jìn)化上完全保守，而且多個在線程序預(yù)測該基因變異具有致病性，因此該基因突變很可能是導(dǎo)致該患者房顫的分子病因。

T-box基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，其特點(diǎn)是均有1個被稱為T-box的高度保守結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域不僅能特異性地識別并結(jié)合靶基因啟動子DNA元件，而且還能與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，協(xié)同調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[11]。目前在人和哺乳動物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了至少17種TBX基因，其中在心臟高表達(dá)的TBX基因有6種，即TBX1、TBX2、TBX3、TBX5、TBX18和 TBX20，它們在心肌分化和心臟發(fā)育方面起著關(guān)鍵作用[11]。作為TBX家族的重要1員，TBX5基因定位于12q24.1，編碼由518個氨基酸所組成的轉(zhuǎn)錄因子蛋白，調(diào)節(jié)動物心血管等的正常發(fā)育[11]。本研究所識別的TBX5基因突變位于T-box結(jié)構(gòu)域，因此推測該突變可能通過影響TBX5與靶基因啟動子DNA元件的特異性結(jié)合而影響靶基因的表達(dá)，也有可能影響轉(zhuǎn)錄因子的相互作用如協(xié)同作用而影響靶基因的表達(dá)，進(jìn)而使心血管發(fā)育異常，導(dǎo)致房顫[11-13]。盡管如此，該基因突變導(dǎo)致房顫的確切機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入研究。

以前的研究支持TBX5基因突變可能通過影響心血管發(fā)育而導(dǎo)致房顫。動物實驗發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育期TBX5基因大量表達(dá)于心臟，在心血管發(fā)育尤其是心肌細(xì)胞增殖、分化、特化、遷移、定型及形態(tài)發(fā)生等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。在小鼠，TBX5基因廣泛表達(dá)于心芽、線型心管、心房、心室、上下腔靜脈以及房室結(jié)和室內(nèi)束支等傳導(dǎo)系統(tǒng)[11]。TBX5基因敲除純合子小鼠由于心臟環(huán)化障礙、竇房和左心室發(fā)育不良而在胚胎期死亡；而TBX5基因敲除雜合子小鼠則表現(xiàn)為房間隔缺損、室間隔缺損、心內(nèi)膜墊缺損、左心室發(fā)育不良及傳導(dǎo)系統(tǒng)形態(tài)和功能異常，包括房室及束支傳導(dǎo)阻滯[14]。在胚胎和成年人心臟，TBX5基因表達(dá)于全部四個心腔的心肌和心外膜以及左心室心內(nèi)膜[15]，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多TBX5突變可導(dǎo)致包括先天性心血管畸形、心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)缺陷和房顫在內(nèi)的Holt-Oram綜合征[7,16,17]。不僅如此，多項研究顯示，心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)異常是房顫的獨(dú)立危險因素[7]，而且有多個關(guān)聯(lián)研究顯示TBX5基因變異與特發(fā)性房顫密切相關(guān)[4-6]。這些研究結(jié)果均支持TBX5基因異常促發(fā)房顫。

總之，本研究首先報道人類TBX5基因突變與特發(fā)性房顫有關(guān)，這有助于揭示房顫的新的分子機(jī)制。

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(收稿：2015-12-20修回：2016-03-02 )

(本文編輯：丁媛媛)

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81270162, 81470372, 81400244)

通信作者：楊奕清，Email: dryyq@#edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1673-6583.2016.03.011

Identification of a novel TBX5 mutation associated with idiopathic atrial fibrillationZHENGHongzhen,QIUXingbiao,LIRuogu,YUANFang,XUYingjia,YANGYiqing.DepartmentofCardiology,ShanghaiChestHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200030,China

【Abstract】Objective:To identify a novel TBX5 mutation associated with idiopathic atrial fibrillation (AF). Methods:A cohort of 116 unrelated patients with idiopathic AF and a total of 200 unrelated healthy individuals used as controls were enlisted. The clinical data and peripheral venous blood samples were obtained from all the study participants. The genomic DNA was isolated by DNA purification kit. The whole coding exons and flanking introns of the TBX5 gene was amplified by polymerase chain reaction, with the genomic DNA as a template. The amplified products were sequenced for variation with DNA sequencing kit on a DNA Analyzer. The PubMed and SNP databases were retrieved to confirm the novelty of an identified TBX5 variation. Multiple alignments of TBX5 proteins across species were performed by the MUSCLE software to show whether the altered amino acid was evolutionarily conserved. The disease-causing potential of the identified variation was evaluated by using the online programs MutationTaster and PolyPhen-2. Results:A substitution of thymine for adenine at coding nucleotide 314 (c.314A>T), predicting the transition of aspartic acid at amino acid position 105 to valine (p.D105V), was identified in TBX5 in a patient with idiopathic AF, who had a negative family history of AF. The mutation was absent in 400 control chromosomes and not found in the PubMed and SNP databases. Alignment of multiple TBX5 proteins among various species displayed that the aspartic acid at position 105 was completely conserved evolutionarily. Furthermore, the variation was predicted to be causative by MutationTaster and PolyPhen-2. Conclusion:Identification of a novel TBX5 mutation associated with idiopathic AF suggests that TBX5 mutation is likely to be a rare genetic cause of idiopathic AF.

【Key words】Cardiac arrhythmia; Atrial fibrillation; Genetics; Transcription factor; TBX5