CAMP/PKA通路在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究

錢晶蔣學(xué)通徐傳奇王道榮

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CAMP/PKA通路在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究

錢晶1蔣學(xué)通2徐傳奇2王道榮2

【摘要】目的 構(gòu)建小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，探討CAMP/PKA通路在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。方法 采用皮下成瘤盲腸部位包埋的方法，建立結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組模型小鼠連續(xù)7天注射CAMP類似物，并于注射完成后7天、14天、28天處死小鼠，采用免疫組化的方法檢測(cè)兩組小鼠原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶內(nèi)CAMP、PKA、VEGF的表達(dá)，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)正常組織及癌組織內(nèi)MMP2、E-鈣粘蛋白的表達(dá)。結(jié)果 成功建立結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型，實(shí)驗(yàn)組較同期對(duì)照組原發(fā)灶變小，腹腔及肝臟轉(zhuǎn)移瘤少。兩組中轉(zhuǎn)移灶VEGF的表達(dá)高于原發(fā)灶，癌組織中E-鈣粘蛋白表達(dá)低于正常組織，MMP2高于正常組織。實(shí)驗(yàn)組中隨著藥物作用時(shí)間延長，CAMP、PKA、VEGF、MMP2的表達(dá)逐漸變?nèi)酢-鈣粘蛋白的表達(dá)逐漸升高。結(jié)論 CAMP/PKA可通過調(diào)節(jié)VEGF、E-鈣粘蛋白、MMP2的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移。

【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸腫瘤； 新生血管化，病理性； CAMP/PKA； 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

結(jié)直腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年升高。肝臟轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的主要因素，大約有20％～25％的結(jié)直腸癌患者確診時(shí)已發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移，即使行原發(fā)灶腫瘤切除術(shù)后，仍有30％可發(fā)生異時(shí)性肝臟轉(zhuǎn)移。目前結(jié)直腸肝臟轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍不明確，多項(xiàng)研究證實(shí)血管生成及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用至關(guān)重要［1-2］。

CAMP/PKA通路是一條經(jīng)典的G蛋白偶聯(lián)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，參與多項(xiàng)細(xì)胞生理活動(dòng)。而有研究證實(shí)CAMP/PKA參與VEGF的分泌及表達(dá)［3］，但其在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用未被研究，我們通過構(gòu)建結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的小鼠模型，研究CAMP/PKA通路在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用，并對(duì)其機(jī)制初步探討。

資料與方法

一、一般資料

SPF級(jí)4～6周齡的Bal b/c雄性小鼠，體重20～26克，夠買并飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；CT26細(xì)胞購于中國科學(xué)院，CAMP、PKA、VEGF蛋白單克隆抗體購于美國Santa Cruze生物公司，工作濃度為1：50；SP試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)公司。PCR試劑盒購于Takala公司。

二、模型建立

CT26細(xì)胞培養(yǎng)于1640培養(yǎng)基，通過細(xì)胞傳代，胰酶消化、吹打，制備CT26細(xì)胞株細(xì)胞懸液，于大鼠腋下注射，細(xì)胞注射量為1×107/200 μl，10 d左右長出直徑1 cm的腫塊，少量組織性HE染色。按照300 g/1.0 ml水合氯醛的給藥劑量，給大鼠麻醉，縱向切開左下腹皮膚約2 cm，將大鼠的盲腸拖出至皮下，將腫瘤塊縫合于腸組織上，縫合皮膚。

三、實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù)

將模型小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組，實(shí)驗(yàn)組予以8-溴-cAMP 60 mg/kg/d的劑量腹腔注射連續(xù)7 d，分別于第7 d，14 d，28 d處死小鼠，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。對(duì)照組無特殊處理，同期處死對(duì)照組小鼠，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

四、觀察的指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.皮下移植瘤形成情況，通過HE染色證實(shí)為腫瘤形成；2.盲腸原位包埋腫瘤后，腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤形成情況，包括肝臟轉(zhuǎn)移，腹腔轉(zhuǎn)移及大??；3.免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織內(nèi)CAMP、PKA、VEGF表達(dá)，PCR方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中MMP2及E-鈣粘蛋白的表達(dá)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為顯著性檢驗(yàn)。

結(jié) 果

一、模型建立情況

小鼠于皮下注射腫瘤細(xì)胞，最早5天形成轉(zhuǎn)移瘤，10天左右生長出皮下瘤可形成約1 cm腫塊。盲腸部位的包埋皮下瘤的方法，成功建立結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。見圖1。

二、原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶生長情況

隨著時(shí)間推移，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均表現(xiàn)為原發(fā)灶的生長，腹腔內(nèi)及肝臟轉(zhuǎn)移瘤的形成，但實(shí)驗(yàn)組原發(fā)灶生長更加緩慢，相同腹腔內(nèi)及肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)移腫瘤數(shù)目少、體積小。具體見表1。

圖1 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型

三、CAMP、PKA、VEGF表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中肝轉(zhuǎn)移灶中VEGF表達(dá)較原發(fā)灶升高。實(shí)驗(yàn)組中CAMP的表達(dá)隨著用藥時(shí)間的延長，表達(dá)量逐漸減少、且PKA、VEGF表達(dá)也呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。見圖2。

四、MMP2及E-鈣粘蛋白的表達(dá)

（一）MMP2的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中MMP2表達(dá)均較正常組織升高，但實(shí)驗(yàn)組中原發(fā)灶MMP2表達(dá)較對(duì)照組下降，且隨著藥物作用時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組原發(fā)灶MMP2的表達(dá)逐漸下降。見圖3。

表1 不同時(shí)期原發(fā)灶大小及轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目表

注：**表示兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）圖3 實(shí)驗(yàn)組及不同時(shí)間段對(duì)照組中MMP2表達(dá)

（二）E-鈣粘蛋白的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的原發(fā)灶中E-鈣粘蛋白的表達(dá)較正常組織下降，但實(shí)驗(yàn)組原發(fā)灶中較對(duì)照組中表達(dá)上升，且隨著藥物作用時(shí)間延長，E-鈣粘蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。見圖4。

討 論

CAMP/PKA通路是一條經(jīng)典的由G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，外界信號(hào)分子刺激膜體后，激活細(xì)胞內(nèi)的腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)CAMP水平升高，從而激活PKA，產(chǎn)生一系列的生物學(xué)反應(yīng)。目前已證實(shí)，其參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)新陳代謝、基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)［4］。PKA作為CAMP的下游分子，由催化亞基及調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成，催化亞基可介導(dǎo)多種底物蛋白的磷酸化，而調(diào)節(jié)亞基的兩種亞型RⅠ與RⅡ則主要參與細(xì)胞的增殖與分化。一旦外界因素導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)RⅠ型亞基優(yōu)勢(shì)表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞的無限的增殖，腫瘤形成。

注：**表示兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）圖4 實(shí)驗(yàn)組及不同時(shí)間段對(duì)照組的原發(fā)灶中E-鈣粘蛋白的表達(dá)

血管生成及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的形成是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的兩種重要的途徑。VEGF是誘導(dǎo)血管形成的重要的因子，在腫瘤的血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移中有重要的作用，有研究證實(shí)VEGF的表達(dá)與CAMP的激活相關(guān)。在皮下海綿移植的小鼠模型中，激活cAMP的合成能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF，從而促進(jìn)腫瘤血管的形成［5］。Namkoong等［3］發(fā)現(xiàn)腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑能促進(jìn)人血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF從而促進(jìn)血管形成。E-鈣粘蛋白及MMP2是介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要的因子，有研究表明，在子宮肌瘤中CAMP/PKA通路的激活能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞MMP2的表達(dá)［6］。E-鈣粘蛋白是上皮細(xì)胞的連接分子，在上皮細(xì)胞發(fā)生腫瘤及間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中，其表達(dá)常常會(huì)下降［7］。CAMP/PKA通路在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及對(duì)E-鈣粘蛋白表達(dá)的影響仍未被研究證實(shí)。

本研究通過使用CAMP的類似物（8-溴-CAMP）干預(yù)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型，分別在在藥物處理后7天、14天、28天處死小鼠。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，8-溴-CAMP能夠抑制小鼠產(chǎn)生肝臟轉(zhuǎn)移及腹腔轉(zhuǎn)移，同時(shí)試驗(yàn)組發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移的數(shù)目及大小都較對(duì)照組減少，說明CAMP/PKA通路在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移尤其是肝轉(zhuǎn)移起作用。檢測(cè)原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中的CAMP、PKA、VEGF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)原發(fā)灶及肝轉(zhuǎn)移灶中VEGF的表達(dá)差異，說明VEGF在結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移中起到重要的作用。隨著用藥時(shí)間的延長，VEGF的表達(dá)逐漸下降，與CAMP及PKA的表達(dá)呈一致性，推測(cè)CAMP/PKA通路能夠通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌的肝臟轉(zhuǎn)移。

圖2 CAMP、PKA、VEGF的表達(dá)

利用PCR技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中腫瘤組織與正常組織中E-鈣粘蛋白及MMP2，其中E-鈣粘蛋白在癌組織中的表達(dá)是低于正常組織，且隨著藥物作用時(shí)間的延長，E-鈣粘蛋白的表達(dá)逐漸增高，推測(cè)在腫瘤組織內(nèi)的CAMP/PKA的激活可抑制E-鈣粘蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤侵襲能力增加，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。MMP2也是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的經(jīng)典分子，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示癌組織內(nèi)表達(dá)要高于正常組織，且隨著用藥時(shí)間的延長，MMP2在癌組織內(nèi)的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，且隨著MMP2表達(dá)的下降，肝臟轉(zhuǎn)移數(shù)目逐漸減少。推測(cè)CAMP/PKA激活可促進(jìn)癌組織內(nèi)MMP2的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示：CAMP/PKA通路促進(jìn)VEGF的表達(dá)參與腫瘤新生血管生成促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，同時(shí)促進(jìn)MMP2的表達(dá)和抑制E-鈣粘蛋白的表達(dá)，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的形成，導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。

參 考 文 獻(xiàn)

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（本文編輯：楊明）

錢晶， 蔣學(xué)通， 徐傳奇， 等. CAMP/PKA通路在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究［J/CD］. 中華結(jié)直腸疾病電子雜志，2016， 5（3）： 244-248.

The effect and mechanism of CAMP/PKA pathway in colorectal liver metastases

Qian Jing1， JiangXuetong2， Xu Chuanqi2， Wang Daorong2.1Department of General Surgery， Medicine School of Yangzhou University， Yizheng Hospital of Nanjing Gulou Hospital Group， Yangzhou 225001， China；2Gastrointestinal Centre， Clinical Medical College of Yangzhou University， Subei People?s Hospital，Yang zhou 225001， China Corresponding author: Wang Daorong， Email: daorong666@sina.com

【Abstract】Objective To establish a mouse model of colorectal liver metastasis，and to explore the mechanism of CAMP/PKA pathway in colorectal liver metastasis. Methods To establish a mouse model of colorectal liver metastasis by embedding subcutaneous tumor in the appendix， and randomly divided into experimental group and control group. The mice of experimental group were injected CAMP analogs for 7 days， the mice were sacrificed in 7 days， 14 days， and 28 days after injection. The expression of CAMP，PKA and VEGF in two groups were detected by immunohistochemical method. The expression of MMP2 and E-cadherin in normal tissue and cancer tissue were detected by quantitative PCR. Results It was succeed to establish a mouse model of colorectal liver metastasis. Comparing to control group， the number of liver metastasis and volume of primary tumor were small in experimental group. The expression of VEGF in the two groups was higher than that in the primary tumor. The expression of E-cadherin in the cancer tissues was lower than that in the normal tissues， and MMP2 was higher than that in the normal tissues. In the experimental group， the expression of CAMP、PKA、VEGF、MMP2 were gradually decreased， while the expression of E-cadherin was increased gradually. Conclusion CAMP/PKA promoted colorectal liver metastasis by regulating the expression of VEGF， E-cadherin and MMP2.

【Key words】Colorectal neoplasms； Neovascularization， pathologic； CAMP/PKA； Epithelial mesenchymal transition

DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.03.010

作者單位：225001 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院普外科1；225001 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院蘇北人民醫(yī)院胃腸中心2

通訊作者：王道榮，Email：daorong666@sina.com

收稿日期：（2016-04-02）