雞血藤醇提物及其活性成分兒茶素抗輻射作用及機制研究

譚瀟 董憲喆 郭代紅 王石 李牧函 趙潤清 劉屏

[摘要]研究雞血藤乙醇提取物及其活性成分兒茶素的抗輻射作用，并探討初步作用機制。采用6Gy 60Coγ射線一次性全身照射ICR小鼠造成亞急性輻射損傷模型， 隨機分為正常組、模型組、陽性對照組（氨磷汀，436 mg·kg-1，iv）、雞血藤組（生藥10，20，40 g·kg-1）、兒茶素組（50，100，200 mg·kg-1），連續(xù)ig給藥28 d，每日1次。檢測給藥前1 d及給藥1，3，7，14，21，28 d后小鼠外周血WBC，RBC，PLT計數(shù)和HGB含量；觀察給藥7 d后小鼠胸腺及脾臟指數(shù)的變化；比色法測定給藥7 d血清SOD，GSHPx活性和MDA水平；采用半固體培養(yǎng)基測定給藥7 d后骨髓造血祖細胞集落形成能力；HE染色觀察給藥7，14 d股骨骨髓病理學改變；流式細胞術檢測給藥7 d后骨髓細胞的凋亡，Western blot測定骨髓細胞中cleaved caspase3和Bcl2的表達，免疫組化法檢測股骨骨髓中Bax的表達。結果表明，雞血藤醇提物和兒茶素均可促進輻射小鼠外周血象的恢復，增加免疫器官胸腺和造血器官脾臟的臟器指數(shù)，提高血清抗氧化酶SOD和GSHPx活性、降低MDA水平，促進骨髓造血祖細胞的增殖分化；增加骨髓腔內細胞數(shù)量、減輕立體支架結構損傷，改善造血微環(huán)境；抑制骨髓細胞凋亡，使凋亡相關蛋白Bcl2的表達顯著上調，cleaved caspase3和Bax的表達顯著下調。雞血藤醇提物和兒茶素對亞急性輻射損傷小鼠有明顯的保護作用，其機制與促造血、抗氧化、抗凋亡作用有關。

[關鍵詞]雞血藤；兒茶素；輻射損傷；外周血象；造血祖細胞；細胞凋亡

[Abstract]To study the antiradiation effect and mechanism of ethanol extracts from Spatholobus suberectus and its active component catechin， ICR mice were exposed to 6Gy irradiation and randomly divided into normal group， model group， positive control group （amifostine， 436 mg·kg-1， iv 30 min before irradiation）， SSD group （10， 20， 40 g·kg-1） and catechin group （50， 100， 200 mg·kg-1） The mice were administered the appropriate drugs once a day after irradiation for 28 consecutive days Blood samples were collected from the tail end and the number of peripheral blood cells was counted before irradiation and on day 1， 3， 7， 14， 21 and 28 using a microcell counter Changes of thymus and spleen index of mice on day 7 were observed The serum SOD， GSHPx activity and MDA level were detected by the colorimetric method The colony forming ability of bone marrow hematopoietic progenitor cells on day 7 was detected by semi solid culture method The HE staining was adopted to observe the pathological changes The apoptosis of bone marrow cells was detected by flow cytometry The expression of cleaved caspase3 and Bax of bone marrow cells were measured separately by westernblotting and immunohistochemistry method SSD and catechin can both significantly revert the irradiatedinduced decline in hematological parameters （RBC， WBC， PLT， Hb）， improve thymus and spleen index， significantly enhance serum SOD and GSHPx activity and decrease the MDA level The proliferation and differentiation of hematopoietic progenitor cells in bone marrow were promoted， the apoptosis of bone marrow cells was significantly upregulated and the expression of cleaved caspase3 and Bax was significantly reduced in SSD and catechin group SSD and catechin have significant antiradiation effect and its mechanism may be related to hematopoietic promoting， antioxidant and antiapoptotic effects

[Key words]Spatholobus suberectus； catechin； irradiation injury； peripheral blood； hemopoietic progenitor cell； cell apoptosis

doi：10.4268/cjcmm20160924

輻射可直接導致多種DNA損傷，造成基因突變和染色體畸變；又會使機體產生大量內源性自由基，引發(fā)脂質過氧化，損傷組織器官[1]。輻射危害累及血液、免疫、消化、生殖等多個系統(tǒng)，甚至會誘發(fā)癌癥[2]。臨床上約70%的惡性腫瘤病人需放射治療，但放療后造成的骨髓抑制、造血功能障礙、外周血細胞下降、免疫功能受損等已成為制約其療效的瓶頸[3]。從天然中草藥中尋找毒性低、不良反應少的抗輻射作用有效成分具有重要意義。

雞血藤為豆科植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤莖，有補血活血、調經止痛、舒經活絡的功效，臨床上主治月經不調、風濕痹痛、麻木癱瘓、血虛萎黃等[4]。課題組以往研究表明[56]，雞血藤乙醇提取物用乙酸乙酯萃取后，經色譜柱分離得到9個化合物，以兒茶素含量最多，其次為沒食子兒茶素、表兒茶素等，并且兒茶素刺激造血祖細胞增殖作用最強，可通過誘導IL6和 GMCSF mRNA 的表達，使骨髓細胞跳出“G1期阻滯”進入增殖周期。本實驗通過檢測小鼠外周血象、臟器指數(shù)、抗氧化指標、造血祖細胞增殖、骨髓病理學改變、骨髓細胞凋亡及凋亡相關蛋白cleaved caspase3，Bcl2，Bax的表達變化，從促造血、抗氧化、抗凋亡3個方面探討雞血藤醇提物和兒茶素抗輻射作用及初步分子機制。

1材料

雞血藤中藥飲片（北京綠野藥業(yè)有限公司，產地福建）；兒茶素（Sigma公司）；注射用氨磷汀（大連美羅大藥廠，04 g/支）；MethoCult M3434培養(yǎng)基（Stemcell公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清（HyClone公司）；紅細胞裂解液（Solarbio公司）；超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX），丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物技術研究所）；細胞凋亡檢測試劑盒（凱基生物）；cleaved caspase3，Bcl2抗體（美國Cell Signaling technology公司）；Bax抗體（SANTA CRUZ）；βactin和相應的二抗（美國Abcam公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所）。

SPF級ICR小鼠，6～8周，18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）20120001。實驗在動物適應環(huán)境1周后正式進行。

BC2800Vet獸用全自動血液細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；60Coγ鈷源（軍事醫(yī)學科學院）；MCO15AC二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；IX51熒光倒置生物顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；VICTOR3多標記微孔板分析儀（美國PerkinElmer公司）；ABJ804NM電子天平（德國KERN）；FACSCalibur流式細胞儀（美國BD）；電泳儀，半干槽（美國BioRad）；UVP凝膠成像系統(tǒng)（美國EC3 Imaging Systems）。

2方法

21雞血藤乙醇提取物制備

雞血藤中藥飲片，8倍量體積75%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并濾液，減壓旋蒸至浸膏，凍干，得雞血藤乙醇提取物粉末（SSD）。

22分組與給藥

將健康ICR小鼠216只，雌雄各半，隨機分為正常組、模型組、陽性對照組（氨磷汀，436 mg·kg-1，照射前30 min尾靜脈注射給藥）、雞血藤組（生藥濃度10，20，40 g·kg-1）、兒茶素組（50，100，200 mg·kg-1），每組24只。除正常組外，各組均接受60Gy劑量60Coγ射線一次性全身照射（劑量率11729 cGy·min-1，時間4 min 50 s）。自照射當日起， 每只灌胃給予相應藥物02 mL，正常組、輻射組給予等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥28 d。

23外周血象檢測

于照射前及給藥1，3，7，14，21，28 d后剪尾尖采血20 μL，測定外周血白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血小板（PLT）計數(shù)及血紅蛋白（HB）水平，觀察給藥28 d內小鼠外周血象的變化。

根據(jù)外周血象結果，分別選擇雞血藤組和兒茶素組中促進外周血象恢復作用最佳的劑量組，觀察其對抗氧化、造血祖細胞增殖、骨髓病理學、骨髓細胞凋亡及抗體表達等的影響，進行作用機制的研究。

24臟器指數(shù)和抗氧化指標測定

給藥7 d后取每組動物的胸腺、脾臟，稱重，計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=器官質量/體重×1 000。同時摘眼球取血，分離血清，按照試劑盒說明書方法測定給藥7 d后小鼠血清中SOD，GSHPX活性和MDA水平。

25HE染色檢測股骨骨髓病理改變

給藥7，14 d后，各取每組動物單側股骨，剝離肌肉組織后于4%多聚甲醛固定24 h，脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精伊紅染色，光學顯微鏡下觀察股骨骨髓病理形態(tài)學改變。

26造血祖細胞集落培養(yǎng)

給藥7 d后各取每組動物單側股骨，吸取RPMI 1640培養(yǎng)基沖出骨髓至培養(yǎng)皿中，正反各沖洗3次，直至沖洗液變清亮后停止。沖出的骨髓細胞1 000 r·min-1離心5 min，去上清，加入紅細胞裂解液裂解15 min，1 000 r·min-1離心10 min，去上清，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸，得骨髓單個核細胞，細胞計數(shù)。取5×104個細胞于6孔板中，每孔加入15 mL M3434培養(yǎng)基，每組設6個復孔，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于第10天記錄粒細胞巨噬細胞集落形成單位（CFUGM）、爆式紅細胞集落形成單位（BFUE）和混合細胞集落形成單位（CFUMix）集落數(shù)，多于50個細胞判為一個集落。

27流式細胞術檢測骨髓細胞凋亡

方法同上制得骨髓單個核細胞。每組取5×105細胞，用PBS洗滌2次（2 000 r·min-1離心5 min），加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞，加5 μL Annexin VFITC混勻后，再加5 μL PI，混勻，室溫避光反應15 min，在1 h內上機檢測。

28Western blot法檢測cleaved caspase3的表達

將27項中每組剩余的骨髓單個核細胞用PBS洗滌2次，加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑充分裂解，4 ℃，12 000 r·min-1離心30 min。取上清，BCA試劑盒蛋白定量，細胞總蛋白加上樣緩沖液煮沸變性。用10% SDSPAGE分離蛋白，轉膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫雜交2 h，洗膜后，加入ECL發(fā)光液，進行檢測。

29免疫組化法檢測Bax的表達

將25項中小鼠股骨骨髓蠟塊切片，烘干，逐步脫蠟和水化，而后進行抗原修復，滴加山羊血清于37 ℃溫箱中封閉20 min。取出切片加一抗Bax，4 ℃冰箱孵育過夜，再加入二抗37 ℃溫箱孵育30 min，DAB顯色復染后脫水，封片，晾干。切片隨機選10個視野于400倍光學顯微鏡下觀察陽性細胞分布程度，用Image Pro軟件進行半定量分析，Bax的蛋白表達以IOD值表示。

210數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 170統(tǒng)計軟件處理，結果均用±s表示，多組間比較采用單因子方差分析，P<005表示有顯著性差異。

3結果

31雞血藤醇提物和兒茶素對輻射小鼠外周血象的影響

與正常組比，輻射組小鼠WBC，RBC，PLT，HGB水平均有所下降，而雞血藤醇提物組和兒茶素小鼠外周血象均有不同程度的改善，其中雞血藤醇提物和兒茶素高劑量組對小鼠外周血象恢復的作用最好。兒茶素高劑量組WBC從第7天，雞血藤高劑量組從第21天起明顯高于輻射組（P<001），至第28天仍有顯著性差異。雞血藤高劑量組RBC從第7天，兒茶素高劑量組從第14天開始明顯高于模型組（P<001），至第28天接近正常組水平。雞血藤高劑量組PLT從第14天到第21天，兒茶素高劑量組從第7天到第21天明顯高于模型組（P<001）。雞血藤兒茶素高劑量組HGB均從第7天到第21天顯著高于模型組（P<001）（圖1）。

32外周血象恢復作用最好的雞血藤醇提物組和兒茶素組促造血、抗氧化、抗凋亡作用

321對臟器指數(shù)的影響給藥7 d后，模型組與正常組比，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低

323對小鼠股骨骨髓病理學影響HE染色顯示，給藥7 d后，正常組小鼠骨髓結構完整，骨髓細胞密集，充滿于骨髓腔內，造血細胞增殖活躍；模型組骨髓細胞大量減少，僅殘存少量有核細胞，核染色質固縮或碎裂，骨髓網狀纖維結構的立體支架破碎，呈現(xiàn)空洞狀；與模型組比，雞血藤組和兒茶素組中骨髓細胞數(shù)有所增多，細胞核固縮減輕，空洞狀結構減少，立體支架結構損傷程度減輕；給藥14 d后，雞血藤組和兒茶素組骨髓結構改善更加明顯，骨髓細胞數(shù)顯著增多，可見明顯的造血細胞再生灶，立體支架結構逐漸恢復（圖2）。

324對造血祖細胞集落形成的影響給藥7 d后，模型組小鼠骨髓造血祖細胞增殖能力明顯受到抑制，CFUGM，BFUE和CFUMix數(shù)量與正常組比顯著降低（P<005）。與模型組比，雞血藤組小鼠骨髓形成CFUGM，BFUE和CFUMix的數(shù)量顯著

4討論

目前抗輻射藥物主要包括含硫化合物、激素類、細胞因子等[7]。含硫化合物抗輻射作用最強，但毒副作用明顯；細胞因子在促進造血干細胞（hemato

增殖和分化的同時也消減了其自我更新能力，加速HSCs的耗竭，加重骨髓遠期損傷[89]。目前，國內外學者發(fā)現(xiàn)許多天然藥物成分如多糖、生物堿、黃酮類等有一定的抗輻射損傷作用，可作用于不同時期的造血干/祖細胞，在蛋白質和基因水平參與增殖分化的調控，促進骨髓造血功能重建。由于中藥還具有藥源廣、毒性作用低等特點，中藥抗輻射活性成分的研究已成為近年來的熱點。

雞血藤為我國傳統(tǒng)中藥，課題組通過前期研究[1011]，闡明了雞血藤的主要活性部位，從中提取、分離、鑒定了以茶多酚類化合物為代表的主要活性成分，如兒茶素（catechin），表兒茶素（epicatechin），沒食子兒茶素（gallocatechin），表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）等化合物，單體中活性最強的是兒茶素。兒茶素在植物中分布廣泛，以豆科、茜草科、薔薇科、山茶科居多，可有效清除人體內多種自由基，延緩衰老。綠茶中也含有豐富的兒茶素類成分，其抗輻射作用多有研究報道[12]。造血系統(tǒng)，尤其骨髓是電離輻射主要的靶器官之一，機體受輻射后最明顯的變化是外周血象的降低。本研究結果顯示，輻射后小鼠WBC，RBC，PLT，HGB水平均有不同程度下降，其中降低最為顯著的為WBC。與輻射組比，雞血藤組和兒茶素組可以加速外周血象各項指標的恢復。外周血象的變化提示從給藥7 d起，各給藥組與輻射組WBC，RBC，PLT，HGB均開始有顯著性差異，給藥7 d左右是血象恢復的關鍵點，因此本文選擇給藥7 d的時間點研究其促造血、抗氧化、抗凋亡的作用。

造血干細胞是原始的全能造血細胞，可進一步分化為各系造血祖細胞（hematopoietic progenitor cells，HPCs），進而在特定造血微環(huán)境及造血調控下增殖分化為各類血細胞[13]。骨髓造血祖細胞集落培養(yǎng)實驗中集落形成數(shù)量可在一定程度上反映造血祖細胞的內在增殖活力[14]。本實驗結果顯示，與輻射組比，雞血藤組和兒茶素組可顯著提高骨髓造血祖細胞CFUGM和BFUE的集落形成能力，兒茶素組更易促進CFUGM的形成，而雞血藤組更易促進BFUE的形成，這與7 d后外周血象的變化相符。骨髓病理學結果顯示，給藥7 d后，雞血藤組和兒茶素組骨髓損傷已經有所減輕，給藥14 d后，骨髓細胞數(shù)顯著增多，造血細胞增殖活躍，骨髓微環(huán)境明顯改善。因此，雞血藤醇提物和兒茶素具有明顯的促進輻射小鼠造血功能恢復的作用。

輻射還會誘導機體產生大量的自由基，導致機體的抗氧化體系失去平衡，破壞DNA結構，損傷造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等，還可攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸而引起脂質過氧化，導致細胞代謝障礙[15]。研究發(fā)現(xiàn)[16]，輻射后機體中活性氧（reactive oxygen species， ROS）升高，會使造血系統(tǒng)應激能力下降而出現(xiàn)HSCs衰老，影響造血功能。體內SOD，GSHPx等能清除自由基，MDA是脂質過氧化的產物，三者的水平可間接反映出細胞氧化損傷的程度[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，雞血藤醇提物和兒茶素均能不同程度地降低輻射引起的MDA含量升高，提高血清SOD，GSHPx活性，減輕氧化損傷；同時，使造血器官脾臟和免疫器官胸腺的臟器指數(shù)增加，說明對造血和免疫系統(tǒng)也有一定的保護作用。

caspase3是調控細胞凋亡的關鍵蛋白，細胞凋亡的最后通路均與caspase3的活化有關[18]。caspase3的激活需要從沒有活性的全長35 kDa剪切有活性的17 kDa亞基和13 kDa亞基，即cleaved caspase3[19]。Bcl2和Bax是線粒體凋亡信號通路中的主要蛋白，線粒體途徑過程中，Bcl2被抑制而Bax和Bak等凋亡蛋白釋放，移位插入到線粒體外膜的Bax可引起線粒體膜通透性改變，促進細胞色素c的釋放，激活Apaf1，caspase9和caspase3，引起細胞形態(tài)學改變導致細胞凋亡[2021]。本研究發(fā)現(xiàn)，輻射可導致骨髓細胞中cleaved caspase3和Bax的表達上調，促進骨髓細胞凋亡。與輻射組比，雞血藤組和兒茶素組在下調cleaved caspase3和Bax，上調Bcl2表達方面有顯著性差異，雞血藤組下調2種蛋白的表達更明顯，這與雞血藤組骨髓細胞凋亡率最低也相一致。

綜上所述，雞血藤醇提物和其活性單體兒茶素可通過提高造血祖細胞內在增殖活力促進造血，改善外周血象；又可通過提高血清抗氧化酶活性，減少脂質過氧化物產生，減輕機體氧化損傷；還能下調cleaved caspase3和Bax的表達，上調Bcl2的表達抑制骨髓細胞的凋亡。本文從促造血、抗氧化、抗凋亡3個方面探討了雞血藤和兒茶素的抗輻射作用及其初步機制，但具體通過哪種通路發(fā)揮了造血調控還需進一步研究。

[參考文獻]

[1]Rajesh A， Damodar G， Ramam C， et al. Radioprotection by plant products. Present status and future prospects[J]. Phytother Res，2005，19：1.

[2]Coleman N E， Blakely W F， Fike J R， et al. Molecular and cellularbiology of moderatedose（110 Gy） radiation and potential mechanisms of radiation protection. Report of a workshop [J]. Radia Res，2003，159：812.

[3]陳曉，萬芝清，韓根成，等. 六君子湯合左金丸治療小鼠急性放射性十二指腸炎的療效及機制研究[J]. 中國中藥雜志，2014，29（2）：278.

[4]中國藥典. 一部[S]. 2010：180.

[5]劉屏，王東曉，陳若蕓，等. 兒茶素對骨髓細胞周期及造血生長因子基因表達的作用[J]. 藥學學報，2004，39（6）：424.

[6]劉屏，王東曉，陳桂蕓，等. 雞血藤單體化合物對造血祖細胞增殖的調控作用研究[J]. 中國藥理學通報，2007，23（6）：741.

[7]Hosseinimehr S J. Trends in the development of radioprotective agents[J]. Drug discov Today，2007，12（19）：794.

[8]Zhao W， Robbins M E. Inflammation and chronic oxidative stress in radiationinduced late normal tissue injury：therapeutic implications[J]. Curr Med Chem，2009，16（2）：130.

[9]高月，馬增春. 輻射損傷防治藥物發(fā)展歷史與發(fā)展[J]. 輻射防護通訊，2009，29（5）：30.

[10]王東曉，陳孟莉，殷建芬，等. 雞血藤活性成分SS8對骨髓抑制小鼠造血祖細胞增殖的作用[J]. 中國中藥雜志，2003，28（2）：152.

[11]Hu Y， Cao J J， Liu P， et al. Protective role of tea polyphenols in combination against radiationinduced haematopoietic and biochemical alterations in mice[J]. Phytother Res，2011，25（12）：1761.

[12]王舟，曾令福，肖元梅，等. 綠茶抗輻射損傷作用研究 [J]. 四川大學學報，2003，34（2）：303.

[13]路璐，孟愛民. HSCs輻射損傷機制研究進展[J]. 生命科學，2015，27（2）：161.

[14]郭平，梁乾德，胡劍江. 四物湯對放射線致血虛癥小鼠骨髓Epo和GCSF基因表達的影響[J]. 中國中藥雜志，2005，30（15）：1173.

[15]胡彥武，劉凱，閆夢彤. 淫羊藿苷對大鼠糖尿病心肌缺血再灌注損傷模型的治療作用及機制研究[J]. 中國中藥雜志，2015，40（21）：4234.

[16]Gazit R， Weissman H， Rossi D J. Hematopoietic stem cells and the aging hematopoietic system[J]. Semin Hematol，2008，45（4）：218.

[17]Kouji K， Kenjirou K， Kazuya S，et al. Intracellular signal transduction of interferon on the suppression of haematopoietic progenitor cell growth[J]. Brit J Haematol， 2003， 123：528.

[18]Rebecca O， Mark L， Benjamin B，et al. Protection from radiationinduced apoptosis by the radio protector amifostine （WR2721） is radiation dose dependent[J]. Cell Biol Toxicol，2014，30：55.

[19]Wang Z Y， Wang D M， Loo T Y， et al. Spatholobus suberectus inhibits cancer cell growth by inducing apoptosis and arresting cell cycle at G2/M checkpoint[J]. J Ethnopharmacol， 2011， 133：751.

[20]Lee B J， Jo I Y， Bu Y，et al. Antiplatelet effects of Spatholobus suberectus via inhibition of the glycoprotein Ⅱb/Ⅲa receptor[J]. J Ethnopharmacol， 2011，134：460.

[21]Thomas M Seed， Cynthia E Inal， Vijay K Singh. Radioprotection of hematopoietic progenitors by low dose amifostine prophylaxis[J]. Int J Radiat Biol， 2014， 90（7）：594.

[責任編輯馬超一]