樟樹4捕磷酸胞苷2睠布諄睤渤噢捍技っ富因的克隆及表達(dá)分析

荊禮 鄭漢 姚娜 陳美蘭 申業(yè) 黃璐琦

[摘要]4二磷酸胞苷2C甲基D赤蘚醇激酶（4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol kinase，CMK）是植物萜類化合物生物合成途徑甲基赤蘚醇4磷酸途徑（methylerythritol4phosphate pathway，DXP/MEP）上的第4個(gè)關(guān)鍵酶。該研究根據(jù)樟樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用RTPCR（reverse transcriptionPCR）方法從藥用植物樟樹Cinnamomum camphora中克隆得到4二磷酸胞苷2C甲基 D赤蘚醇激酶基因，命名為CcCMK1（GeneBank登錄號 Ku376098），對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明該基因開放閱讀框（ORF）為1 212 bp，編碼403個(gè)氨基酸，推測其相對分子質(zhì)量為4446 kDa，等電點(diǎn)（theoretical pI）為499?？缒そY(jié)構(gòu)分析表明CMK蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。信號肽分析表明其為非分泌蛋白，不存在信號肽。亞細(xì)胞定位表明其定位于葉綠體中。利用熒光實(shí)時(shí)PCR檢測了龍腦樟、油樟、芳樟、腦樟和異樟5種化學(xué)型樟樹中CcCMK1基因的表達(dá)量，結(jié)果表明CcCMK1基因在油樟中的表達(dá)量最高，龍腦樟中表達(dá)量最低，為樟樹萜類化合物生物合成途徑關(guān)鍵酶基因元件挖掘提供研究基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]樟樹；4二磷酸胞苷2C甲基D赤蘚醇激酶（CMK）；基因克隆；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

[Abstract]The 4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol kinase was the fourth key enzymes in plant terpenoid biosynthesis pathway of methyl erythritol phosphate pathway（MEP） According to the study of Cinnamomum camphora transcriptome data，we abtained the 4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol kinase gene using RTPCR，and named CcCMK1，then deposited it in GeneBank（Accession number： Ku376098）Bioinformatics analysis showed the open reading frame （ORF） of the CcCMK1 was 1 212 bpThe putative protein encoded 403 amino acids，and its molecular weight was 4446 kDa and theoretically isoelectric point was 499Transmembrane structure analysis showed that there was no transmembrane structure Signal peptide analysis showed that it was a non secretory protein， and there was no signal peptide The subcellular localization showed that the chloroplast was located in the chloroplastAnalysis of the expression of CcCMK1 gene in five chemotypes of C camphora using Realtime PCR showed its expression level was highest in C longepaniculatum， and the lowest in Borneol camphorThis research provided a basis for characterizing the key enzyme genes of terpenoid biosynthetic pathway in C camphora

[Key words]Cinnamomum camphora； 4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol kinase（CMK）； gene cloning； bioinformation analysis； expression analysis

doi：10.4268/cjcmm20160902

樟樹Cinnamomum camphora （L） Presl不僅是一種常見的藥用植物，還是一種含天然精油的經(jīng)濟(jì)植物。樟樹的根、樹皮、葉子和果實(shí)均可入藥，可診療感冒頭痛，風(fēng)濕骨痛，胃腹冷痛等疾病。樟樹的枝、葉可提取樟腦和樟油，在醫(yī)藥及香料工業(yè)具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

樟樹中有效藥用成分為揮發(fā)油類物質(zhì)，如龍腦、樟腦、芳樟醇、水芥烯、欖香烯等，樟樹揮發(fā)油類化學(xué)成分以及樟樹化學(xué)類型之間化學(xué)成分種類和含量的研究已有大量報(bào)道[13]。近年，隨著新一代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們從基因組、轉(zhuǎn)錄組角度對樟樹進(jìn)行研究。江香梅等以樟樹5種化學(xué)型的葉片為材料，進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析[4]，共注釋55 955條unigene，其中424條unigene參與單貼、二萜、倍半萜和萜類骨架合成。Shi等做了蔗糖誘導(dǎo)的樟樹體細(xì)胞胚的比較轉(zhuǎn)錄組工作，注釋了114 229條unigene，發(fā)現(xiàn)了897個(gè)基因可能參與了體細(xì)胞胚的發(fā)生[5]。目前，從樟樹中克隆的基因并不多。李永鵬等利用同源克隆方法，從香樟克隆得到actin基因[6]。張力維等同樣利用同源克隆方法，克隆到香樟延伸因子EF1a基因片段[7]。Yang等從細(xì)毛樟C. tenuipilum中克隆得到一個(gè)香葉醇合成酶基因CtGers，并對其功能進(jìn)行驗(yàn)證[8]。

揮發(fā)油類的主要成分大多為萜類化合物，萜類化合物在植物體內(nèi)通過2條途徑獨(dú)立合成，即位于細(xì)胞質(zhì)的甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA）[9]和位于質(zhì)體中的脫氧木酮糖5磷酸途徑（1deoxyDxylulose5phosphate pathway，DXP）或甲基赤蘚醇4磷酸途徑（methylerythritol4phosphate pathway，MEP）[10]。CMK，即4二磷酸胞苷2C甲基D赤蘚醇激酶（4diphosphocytidyl2CmethylDerythritolkinase），是MEP途徑中的第4個(gè)酶促反應(yīng)所需的酶，是萜類合成的MEP途徑中唯一的一個(gè)激酶，它可以4二磷酸胞苷2C甲基赤蘚醇（4diphosphocytidyl2Cmethylerythritol，CDPME）為底物生成4二磷酸胞苷2C甲基D赤蘚醇2磷酸（4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol2phosphate，CDP_ME2P），經(jīng)一系列反應(yīng)后生成2條獨(dú)立途徑的共同中間體異戊烯基二磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）[11]，IPP在異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IDI）的作用下部分轉(zhuǎn)化為雙鍵異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），這2種物質(zhì)均是所有萜類化合物的前體物質(zhì)。目前，已經(jīng)從藥用植物丹參[12]、杜仲[13]、雷公藤[14]中成功克隆得到CMK基因，但尚未從樟樹中克隆得到萜類化合物生物合成MEP途徑的酶基因。

本研究基于樟樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中CMK基因序列，通過 RTPCR 技術(shù)成功地從樟葉片中擴(kuò)增到CcCMK1基因的cDNA，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量方法分析芳樟、異樟、油樟、腦樟、龍腦樟5種化學(xué)型樟樹中CcCMK1基因的表達(dá)量，以期為樟樹主要藥效成分揮發(fā)油類生物合成途徑的解析提供一定參考 。

1材料

11植物

樟樹（龍腦樟、腦樟、芳樟、油樟、異樟）均采集自江西省龍腦樟繁殖基地（歐陽少林教授惠贈），置于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所溫室中生長。

12儀器

9700實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀（ABI公司），TF 7500型Real Time PCR System（ABI公司），5810R 型低溫冷凍離心機(jī)（Eppendorf 公司），MM400冷凍混合研磨儀（Retsch公司），NanoDrop2000分光光度計(jì)（Thermo Scientific），紫外凝膠成像分析儀（Gene 有限公司）。

13試劑

RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司；Oligo（dT）18，10 mmol·L-1 dNTP，5×Reaction Buffer，RiboLock RNase Inhibitor，RevertAid Reverse Transcriptase購自賽默飛世爾科技（中國）；DL 2 000 DNA Marker，Ex Taq，SYBR Premix Ex TaqTM購自Takara有限公司；T4 DNA連接酶，pGEMT Easy 載體購自普洛麥格生物技術(shù)有限公司。

2方法

21總RNA的提取和cDNA的制備

采用華越洋核酸提取試劑盒，按照說明書提取樟葉片的總RNA，使用NanoDrop2000分光光度計(jì)進(jìn)行RNA濃度和質(zhì)量檢測，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。采用RTPCR方法，按以下體積進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成CcCMK1的cDNA： RNA 1 μg，Oligo（dT）18 1 μL，加ddH2O至12 μL，65 ℃加熱5 min，產(chǎn)物置于冰上冷卻；待產(chǎn)物冷卻后，加入5×Reaction Buffer 4 μL，10 mmol·L-1 dNTP 2 μL，RiboLock RNase Inhibitor 1 μL，RevertAid Reverse Transcriptase 1 μL，混勻，42 ℃加熱1 h，70 ℃加熱5 min，產(chǎn)物置于冰上冷卻，即為單鏈cDNA，于-20 ℃保存，用于基因克隆和表達(dá)分析。

22CMK1基因cDNA的全長克隆

根據(jù)CcCMK1基因最大開放閱讀框（ORF）設(shè)計(jì)引物，CMKL：5′CAACATGGCTGCCACCCAATTCC3′；CMKR：5′GACATTACTTAAATGGACAAGCGGTC3′。按以下體積進(jìn)行PCR：LA Taq 05 μL，10×LA taq BufferⅡ5 μL，25 mmol·L-1 dNTP 4 μL，cDNA 1 μL，Primer L 08 μL，Primer R 08 μL，加ddH2O至50 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)：94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測；選取在1 200 bp左右產(chǎn)生條帶的PCR產(chǎn)物，按以下體積同pGEMT easy vector連接：T4 DNA連接酶的 2×快速連接緩沖液 5 μL，pGEMT Easy vector 1 μL，PCR產(chǎn)物2 μL，T4 DNA連接酶1 μL，加ddH2O至10 μL，反應(yīng)條件為：22 ℃保溫10 min。將連接產(chǎn)物熱激發(fā)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，氨芐抗性篩選，用M13引物進(jìn)行菌落PCR后選擇陽性克隆送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司北京分公司進(jìn)行測序。

23CcCMK1的生物信息學(xué)分析

利用NCBI 的 ORF Finder 分析該CcCMK1基因的最大開放閱讀框（ORF）；利用InterProScan（http：//wwwebiacuk/interpro/）分析蛋白的理化性質(zhì)[15]；利用TMHMM Server v20（http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)[16]；利用SignalP 41 Server（http：//wwwcbsdtudk/services/SignalP/）進(jìn)行信號肽分析[15]；利用TargetP11（http：//wwwcbsdtudk/services/TargetP/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用SWISSMODEL（http：//swissmodelexpasyorg/）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的三維建模[15]；利用DNAMAN進(jìn)行多重序列比對及二級結(jié)構(gòu)分析；利用MEGA 6進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，bootstrap重復(fù)1 000次。

24不同化學(xué)型樟樹中CMK1基因表達(dá)量的分析

采用華越洋核酸提取試劑盒，按照說明書提取不同化學(xué)型樟樹葉片的RNA，采用RTPCR方法獲得不同化學(xué)型樟的cDNA。采用DNAMAN設(shè)計(jì)RealTime PCR引物，CMK1realtimeL：5′GAAGTCTTACCGTCTCTGAAACG3′；CMK1realtimeR：5′CACTGGTTCTCTTCCCGAGTGAG3′； actinrealtimeL：5′CCAGCCTTCACTCATTGGAATGG3′； actinrealtimeR：5′CTGTACTTCCTTTCTGGTGGTGC3′。進(jìn)行RealTime PCR檢測不同化學(xué)型樟中CMK1基因的表達(dá)量，所用儀器為ABI公司TF 7500型Real Time PCR System，反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，SYBR Premix Ex Taq 5 μL，PrimerL 02 μL，PrimerR 02 μL，ROX（Ⅱ）02 μL ，ddH2O 34 μL ，PCR 反應(yīng)條件為： 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s。每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT公式進(jìn)行分析。

3結(jié)果

31 CcCMK1基因cDNA的全長克隆

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中CMK1基因序列，在最大開放閱讀框上下游設(shè)計(jì)引物，對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖1，顯示在1 212 bp左右產(chǎn)生明亮、單一的條帶，與轉(zhuǎn)錄組基因庫中CMK1基因大小一致；將PCR產(chǎn)物同pGEMT Easy載體相連，熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，氨芐抗性篩選陽性克隆，見圖2。在1 400 bp左右產(chǎn)生明亮單一的條帶，選擇陽性菌落，利用pGEMT Easy載體通用引物SP6和T7測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對，顯示該序列為CMK基因家族成員，表明CcCMK1克隆成功。

32CcCMK1的生物信息學(xué)分析

321CcCMK1蛋白基因的理化性質(zhì)利用InterProScan（http：//wwwebiacuk/interpro/）對CcCMK1蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，推測其結(jié)構(gòu)式為C4886H8193N1581O2064S324，相對分子質(zhì)量為4446 kDa，等電點(diǎn) （theoretical pI）為499，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù) （instability index） 為4283，說明其較為穩(wěn)定，脂肪系數(shù) （aliphatic index） 為2758，親水性系數(shù) （grand average of hydropathicity， GRAVY）為0710。利用TMHMM Server v20（http：//www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明其位于膜外，不存在跨膜結(jié)構(gòu)。利用SignalP 41 Server（http：//wwwcbsdtudk/services/SignalP/）進(jìn)行信號肽分析，結(jié)果表明其為非分泌蛋白，不存在信號肽。利用TargetP11（http：//wwwcbsdtudk/services/TargetP/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明其定位于葉綠體中，與其他MEP途徑上的蛋白定位相一致[1718]。

322CcCMK1蛋白多重序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建選取與CcCMK1蛋白親緣關(guān)系較近的4條蛋白序列，利用DNAMAN進(jìn)行多重序列比對，結(jié)果見圖3。CcCMK1蛋白與其他物種的CMK蛋白同源性為7775%，并含有GHMP激酶家族的高度保守氨基酸序列：PXXXGL（G/S）SS（A/G）XX1225（K/R）（圖3中黑線所示），此家族還包括半乳糖激酶、高絲氨酸激酶、甲羥戊酸激酶和磷酸甲羥戊酸激酶[19]。

323CcCMK1蛋白的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測CcCMK1基因最大開放閱讀框含有1 212 bp，預(yù)測編碼403個(gè)氨基酸。利用DNAMAN分析該蛋白的二級結(jié)構(gòu)，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占67%、β折疊占33%、無規(guī)則卷曲占 159%。蛋白的功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，利用SWISSMODEL進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的三維建模，以大腸桿菌4二磷酸胞苷 2C甲基 D赤蘚醇激酶三斜晶型（2ww41）為模板，其序列相似性為033，覆蓋率為066，覆蓋范圍為93～388位氨基酸，結(jié)果見圖3。InterProScan搜索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示其具有IspE（CMK）功能結(jié)構(gòu)域，并屬于GHMP激酶家族，與之前多重序列比對結(jié)果相一致。IspE來源于結(jié)核分枝桿菌，是MEP途徑上的一種酶，是這種致病細(xì)菌生存所必需的酶。它可以在ATP存在的情況下，催化4diphosphocytidyl2Cmethylderythritol （CDPME）生成4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol 2phosphate （CDPME2P） [20]。

33不同化學(xué)型樟樹中CcCMK1基因表達(dá)模式分析

在同一時(shí)間，采集在相同條件下生長的不同化學(xué)型樟樹的葉片，稱取100 mg，采用華越洋核酸提取試劑盒，按照說明書步驟提取芳樟、異樟、油樟、腦樟及龍腦樟葉片的RNA，使用NanoDrop2000分光光度計(jì)檢測RNA含量，采用RTPCR方法使用1 μg RNA獲得不同化學(xué)型樟的cDNA，將cDNA稀釋20倍，-20 ℃保存待用。利用DNAMAN設(shè)計(jì)樟樹CcCMK1和actin基因的實(shí)時(shí)熒光定量引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測，結(jié)果見圖6。CcCMK1基因在油樟中表達(dá)量最高，在龍腦樟中表達(dá)量最低。

4討論

樟樹C. camphora是樟科Lauraceae樟屬Cinnamomum植物，是我國傳統(tǒng)的藥用植物，具有悠久的藥用歷史，其主要藥用成分為萜類物質(zhì)揮發(fā)油，有祛風(fēng)散寒、理氣活氣、止痛止癢、強(qiáng)心鎮(zhèn)痙和殺蟲等功效。樟屬植物具有明顯的種內(nèi)化學(xué)變異的現(xiàn)象，即由于化學(xué)成分的差異分化出不同化學(xué)型，樟樹劃分為芳樟（主成分芳樟醇）、腦樟（主成分樟腦）、油樟（主成分桉油素）、龍腦樟（主成分龍腦）和異樟（主成分異橙花叔醇）等化學(xué)型[21]。劉星星等對不同化學(xué)型樟樹葉揮發(fā)性成分組成進(jìn)行多變量分析，靜態(tài)頂空氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（SHSGCMS）的測定結(jié)果表明， 從25個(gè)樣品中共鑒定出171種化合物[1]，其中，β芳樟醇、莰烯、β愈創(chuàng)木烯、γ松油烯、α側(cè)柏烯、2乙基呋喃、α石竹烯和大牛兒烯8種化合物在所有樣品中均可檢測到。5種化學(xué)型樟樹葉揮發(fā)性成分種類及其含量存在較大差異。對12種成分進(jìn)行主成分分析表明，β愈創(chuàng)木烯、2乙基呋喃、α石竹烯、大牛兒烯、δ蓽澄茄烯、己醛和可巴烯7種揮發(fā)性成分是5種化學(xué)型樟樹分類的重要判定變量。

隨著功能基因組技術(shù)的發(fā)展和完善，人們迫切從基因組學(xué)角度揭示導(dǎo)致樟屬種內(nèi)的化學(xué)型差異的分子生物學(xué)機(jī)制等問題，利用Illumina測序技術(shù)對樟樹5種化學(xué)類型葉片轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序、組裝共獲得156 278個(gè)unigene，序列平均長度584 bp，共有3580%的unigene獲得了基因注釋， 其中1019%的基因注釋到次生代謝生物合成途徑，參與單萜、二萜、倍半萜和萜類骨架的合成 [5]。目前為止，已經(jīng)從樟樹中克隆得到6個(gè)基因的全長，其中只有1個(gè)基因?qū)儆趩屋坪厦讣易宄蓡T，即Yang Tao等從細(xì)毛樟中克隆得到1個(gè)香葉醇合酶基因CtGerS[8]。4二磷酸胞苷2C甲基D赤蘚醇激酶CMK是萜類物質(zhì)共同合成途徑之一質(zhì)體MEP途徑中的第四步催化反應(yīng)的酶，也是MEP途徑中唯一的激酶，有關(guān)CMK基因相關(guān)報(bào)道較少。在大腸桿菌中克隆了1個(gè)CMK家族成員IspE，編碼1個(gè)約31 kDa大小、含有233個(gè)氨基酸的多肽，其屬于保守的GHMP激酶家族[22]。重組IspE在大腸桿菌中具有4二磷酸胞苷2C甲基赤蘚醇激酶活性，在ATP存在的情況下，催化4二磷酸胞苷2C甲基赤蘚醇生成4二磷酸胞苷2C甲基D赤蘚醇2磷酸[22]。

本文首次克隆得到樟樹中4二磷酸胞苷2C甲基D赤蘚醇激酶CMK基因（CcCMK1）的cDNA，并進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析，CcCMK1是CMK家族基因并具有IspE功能結(jié)構(gòu)域，與其他物種的CMK基因有高度同源性。對不同化學(xué)型樟樹中CMK1基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示油樟中CcCMK1基因的表達(dá)量最高，江香梅等對單萜合成的代謝通路中9條可能編碼芳樟醇合成酶unigene的表達(dá)分析結(jié)果顯示，芳樟醇合成酶基因在芳樟化學(xué)類型中表達(dá)水平高， 而在油樟化學(xué)類型中表達(dá)水平較低[7]。由此可見，樟樹不同化學(xué)型中萜類物質(zhì)生物合成途徑不同階段的酶含量可能不同，需要更深入的研究才能揭示其本質(zhì)差別。本研究中CcCMK1基因的克隆和表達(dá)分析僅為藥用植物樟樹萜類物質(zhì)合成途徑解析提供了基本基因元件。

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