毛蕊花糖苷通過激活PI3K/AKT通路促進(jìn)成年小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖

林慧敏，段偉兵，邵　瑞，韓立峰，朱　彥，高秀梅，王　彧

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　300193；2. 天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津　300457)

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毛蕊花糖苷通過激活PI3K/AKT通路促進(jìn)成年小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖

林慧敏1，2，段偉兵1，2，邵瑞1，2，韓立峰1，朱彥1，2，高秀梅1，王彧1，2

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193；2. 天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津300457)

摘要：目的觀察毛蕊花糖苷對原代成年小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法從成年C57BL/6小鼠腦室下區(qū)分離、培養(yǎng)原代神經(jīng)干細(xì)胞，并通過神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nestin免疫熒光染色，對分離得到的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。不同濃度毛蕊花糖苷(5、10、20、40 μmol·L-1)在無有絲分裂原(EGF/bFGF)的條件下處理細(xì)胞24 h。采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，免疫組化法計(jì)數(shù)BrdU陽性細(xì)胞率，檢測細(xì)胞增殖能力，Western blot方法檢測給藥后神經(jīng)干細(xì)胞Akt的磷酸化水平。結(jié)果毛蕊花糖苷在無有絲分裂原存在的條件下，能明顯促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，并明顯提高p-Akt的表達(dá)。而在加入PI3K/AKT信號通路阻斷劑LY294002后，這一作用被明顯抑制。結(jié)論毛蕊花糖苷對體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞具有明顯促增殖作用，該作用機(jī)制可能與化合物激活A(yù)kt通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：毛蕊花糖苷；成年小鼠；神經(jīng)干細(xì)胞；腦室下區(qū)；增殖；Akt通路

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs) 是能自我更新，并具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的細(xì)胞[1-2]。成年動物NSCs在正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，主要分布在海馬齒狀回顆粒下層(SGZ)和腦室管膜下區(qū)(SVZ)區(qū)域。在正常生理?xiàng)l件下，NSCs主要產(chǎn)生神經(jīng)元，而神經(jīng)損傷后，NSCs開始增生和遷移到損傷部位，SVZ來源的NSCs也能產(chǎn)生星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。相比SGZ區(qū)域，SVZ中產(chǎn)生的新的神經(jīng)元能夠更快地遷移，并且能夠遷移至更遠(yuǎn)的損傷部位，因此更受關(guān)注[3-4]。

毛蕊花糖苷為苯乙醇苷類化合物，最先在毛蕊花屬植物中被發(fā)現(xiàn)，但在其他科屬植物中也有發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，如馬鞭草科臭牡丹、列當(dāng)科肉蓯蓉等植物。毛蕊花糖苷具有很多對人類健康有益的藥理活性，包括抗炎、抗氧化以及抗腫瘤作用[5]。目前，越來越多的研究表明，毛蕊花糖苷還具有神經(jīng)保護(hù)作用。毛蕊花糖苷能夠緩解MPP+和谷氨酸在PC12細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)毒性造成的神經(jīng)損傷[6-7]；毛蕊花糖苷對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞以及小腦顆粒神經(jīng)元的凋亡具有明顯抑制作用[8-9]；毛蕊花糖苷可以改善小鼠由莨菪堿誘導(dǎo)產(chǎn)生的記憶障礙[10]等，提示毛蕊花糖苷可能在治療神經(jīng)系統(tǒng)性疾病方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)利用成年小鼠SVZ區(qū)分離培養(yǎng)的原代NSCs，觀察毛蕊花糖苷對其增殖的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

C57BL/6小鼠，6～8周，購于北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證編號SCXK-(軍)2012-0004；毛蕊花糖苷(acteoside)標(biāo)準(zhǔn)品(相對分子質(zhì)量624.59，含量≥98%)，購于中國食品藥品檢定研究院；DMEM/F12培養(yǎng)基、B27 supplement(50×)和0.25% Trypsin-EDTA均購于Gibco公司；表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維生長因子(fibroblast growth factor，bFGF)、聚-L-賴氨酸(poly-L-Lysine)和BrdU均購于Sigma公司；胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基添加劑(insulin-transferrin-sodium selenite supplement，ITSS)、Laminin購于美國 Roche 公司；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；BCA 蛋白定量試劑盒、Triton X-100、4%多聚甲醛(北京索萊寶公司)；兔抗小鼠Akt、兔抗小鼠p-Akt抗體、LY294002、Hoechst 33342(美國Cell signaling 公司)；β-actin單克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/山羊抗鼠 IgG (北京中杉金橋生物公司)；PVDF膜(美國 Millipore 公司)；Super Signal West Pico化學(xué)發(fā)光底物(美國 Thermo scientific 公司)；羊抗鼠BrdU多克隆抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記驢抗小鼠IgG(美國 Abcam 公司)。

1.2主要儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海施都凱儀器設(shè)備有限公司)；蛋白垂直電泳裝置(美國 Bio-Rad 公司)；酶標(biāo)儀(美國Molecular science公司)；臺式高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1NSCs的分離培養(yǎng)參照Walker等[11]的方法并稍加改進(jìn)。將8周齡C57BL/6小鼠脫頸處死，分離出SVZ，用0.25% Trypsin-EDTA在37 ℃條件下消化10 min，每間隔3 min輕搖1次，4 ℃ 500×g離心10 min后棄去上清液，加含有20 μg·L-1bFGF、20 μg·L-1EGF、10 mg·L-1ITSS和2% B27的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，接種于12孔板中，每孔1.5 ml，放入5% CO2，37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)，隔2～3 d傳代1次。2～3代后將生長狀態(tài)良好的懸浮培養(yǎng)的NSCs涂于poly-L-lysine、laminin預(yù)先包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿上，加入NSCs培養(yǎng)液，放入5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，用于后續(xù)研究。

1.3.2NSCs的鑒定將NSCs單細(xì)胞懸液以每毫升1×105個(gè)細(xì)胞的密度涂于預(yù)先包被的細(xì)胞玻片上，待細(xì)胞貼壁良好使用4%多聚甲醛固定30 min，室溫下用0.5% Triton X-100處理細(xì)胞15 min，1×PBS漂洗，1% BSA封閉30 min，加入Nestin一抗(1 ∶500)，4 ℃孵育過夜。次日1×PBS漂洗后，加入FITC標(biāo)記驢抗小鼠IgG(1 ∶250)，室溫孵育1 h，1×PBS漂洗，再用Hoechst 33342染核15 min，1×PBS漂洗，采用抗熒光淬滅封片。置于倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照。細(xì)胞克隆球的鑒定同上。

1.3.3CCK-8法檢測NSCs的細(xì)胞增殖將NSCs制成單細(xì)胞懸液，以每孔7×103個(gè)細(xì)胞的濃度接種于96孔白板，加入不同濃度的毛蕊花糖苷(5、10、20、40 μmol·L-1)處理24 h，每組3個(gè)復(fù)孔。加入CCK-8試劑，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，于酶標(biāo)儀的450 nm波長處測定各孔的吸光度(OD) 值。

1.3.4NSCs的BrdU染色將NSCs制成每毫升1×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先置有Poly-L-Lysine，Laminin包被的細(xì)胞玻片的24孔板中，貼壁后加入10 μmol·L-1的毛蕊花糖苷作用24 h，在毛蕊花糖苷作用18 h時(shí)加入BrdU。經(jīng)4%多聚甲醛固定后，用鹽酸變性，硼酸中和，然后以正常血清封閉。滴加BrdU多克隆抗體(1 ∶250)，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，具體操作過程按照實(shí)驗(yàn)說明進(jìn)行。光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。隨機(jī)抽取5張玻片，每張玻片200倍視野下隨機(jī)選取4個(gè)視野, 計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞總數(shù)(陽性率/%=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)。1.3.5Western blot檢測實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、毛蕊花糖苷組和抑制劑組。其中，空白對照組加入0.1%的DMSO，毛蕊花糖苷組加入10 μmol·L-1毛蕊花糖苷，抑制劑組先加入10 μmol·L-1LY294002 阻斷劑作用細(xì)胞 30 min后，再加入10 μmol·L-1毛蕊花糖苷。24 h后PBS(4 ℃)洗滌細(xì)胞3次(×5 min)，加入細(xì)胞裂解液 150 μL于冰上裂解30 min，反復(fù)吹打使其充分裂解后移入1.5 mL EP管，10 000×g4 ℃離心5 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。每組取 25 μg的總蛋白，10% SDS-PAGE分離蛋白，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜， 5% BSA室溫封閉2 h，分別加入兔抗小鼠Akt、p-Akt一抗(1 ∶1 000稀釋)，β-actin(1 ∶3 000稀釋)4 ℃過夜；TBST洗滌3次(×5 min)，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔二抗，37 ℃孵育2 h，洗膜3次(×5 min)，化學(xué)發(fā)光法ECL顯影。

1.4數(shù)據(jù)分析

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行各組均數(shù)間的比較，并采用Dunnett Multiple Comparisons Test 判斷差別。結(jié)果采用Graph Pad 5.0軟件實(shí)施分析。圖像利用Image J軟件處理。

2結(jié)果

2.1NSCs的培養(yǎng)及鑒定

nestin，又稱巢蛋白，屬于第Ⅳ類中間絲蛋白，僅在胚胎早期神經(jīng)上皮表達(dá)，出生后停止表達(dá)。在神經(jīng)前體細(xì)胞最先表達(dá)的是nestin，一旦神經(jīng)前體細(xì)胞朝向終末方向分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞后，nestin便停止表達(dá)，因此nestin被廣泛用于NSCs的鑒定[12]。傳代細(xì)胞克隆球或消化吹散成的單細(xì)胞經(jīng)免疫熒光化學(xué)染色后結(jié)果顯示(Fig 1)，我們從成年C57BL6小鼠SVZ區(qū)分離培養(yǎng)的原代NSCs中nestin陽性細(xì)胞率達(dá)0.95，具有NSCs表型。

Fig 1　Identification of NSCs

The cultured cells were Nestin-positive(green). The nuclei were counterstained with Hoechst 33342(blue). The amount of Hoechst-stained cells represented the total cell number. A-C: Neurosphere was identified by the representative marker Nestin (green). D-F: Neural stem cells were identified by the representative marker Nestin (green) as adherent monolayer culture. Scale bar:50 μm.

2.2毛蕊花糖苷促進(jìn)NSCs增殖

2.2.1在無有絲分裂原的情況下，不同濃度的毛蕊花糖苷均能促進(jìn)NSCs增殖目前普遍認(rèn)為,EGF和bFGF等有絲分裂原信號在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化中起重要作用，均可以維持神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新能力[13]。為了明確毛蕊花糖苷對NSCs增殖的影響，我們撤除培養(yǎng)基中的有絲分裂原。CCK-8結(jié)果顯示，與對照組相比，有絲分裂原組(含EGF和bFGF)和毛蕊花糖苷組的NSCs增殖活性均明顯升高(P<0.01)，說明有絲分裂原和毛蕊花糖苷均能促進(jìn)NSCs的增殖。并且10 μmol·L-1的毛蕊花糖苷處理NSCs 24 h后其增殖活性明顯高于有絲分裂原組(P<0.01)，而5、20、40 μmol·L-1的毛蕊花糖苷處理組與有絲分裂原組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見Fig 2。提示，在有絲分裂原缺失的條件下，不同濃度的毛蕊花糖苷仍可促進(jìn)NSCs的增殖。

Fig 2　Effects of different concentrations of acteoside on NSCs proliferation in absence of mitogen for 24 h

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vspositive control

2.2.2毛蕊花糖苷組BrdU陽性NSCs我們對NSCs進(jìn)行 BrdU標(biāo)記，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，如Fig 3中箭頭所示，細(xì)胞核呈黃棕色染色的細(xì)胞為BrdU陽性細(xì)胞。與對照組相比，毛蕊花糖苷組BrdU陽性細(xì)胞明顯增多(P<0.01,Fig 3)。

2.3毛蕊花糖苷對Akt磷酸化的影響

Western blot結(jié)果表明，毛蕊花糖苷可以明顯上調(diào)NSCs中p-Akt的表達(dá)(P<0.01)。然而，加入Akt通路抑制劑LY294002后，毛蕊花糖苷對p-Akt表達(dá)的上調(diào)作用可被阻斷(Fig 4)。

3討論

成年腦內(nèi)的NSCs處于靜止?fàn)顟B(tài)，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷或者某些因素刺激后，內(nèi)源性NSCs被激活，大量增殖并在某些趨化因子作用下遷移至病損部位，因此可應(yīng)用于帕金森病、脊髓損傷、腦血管疾病等的治療[14]。NSCs療法包括外源性干細(xì)胞移植和內(nèi)源性干細(xì)胞誘導(dǎo)兩種。近年來國內(nèi)外有很多用NSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動物模型，雖然可有效地改善患者的癥狀，但成體NSCs難以獲得，并且對其分化和功能修復(fù)機(jī)制還不清楚，移植后的細(xì)胞能否與體內(nèi)損傷細(xì)胞相整合，建立起正常的神經(jīng)系統(tǒng)突觸聯(lián)系還需進(jìn)一步研究。另外，NSCs的誘導(dǎo)分化及其移植是否存在社會學(xué)和倫理學(xué)方面的問題還有待考證。因此，用藥物誘導(dǎo)內(nèi)源性NSCs，即通過藥物來調(diào)節(jié)自身的NSCs增殖與定向分化潛能，以重建受損的功能細(xì)胞，恢復(fù)其生物學(xué)功能，成為當(dāng)今治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的首選[15]。

Fig 3　Effect of acteoside on BrdU positive cells

**P<0.01vscontrol

Fig 4　Western blot analysis of p-AKT

EGF和bFGF等有絲分裂原信號在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化中起重要作用。成年嚙齒動物腦內(nèi)灌注EGF或bFGF均能引起SVZ區(qū)域細(xì)胞的增殖，但是對細(xì)胞的分化有不同的影響。EGF灌注刺激膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生，但神經(jīng)元的產(chǎn)生很少，而bFGF灌注可增加神經(jīng)元數(shù)量[13]。本實(shí)驗(yàn)利用成年小鼠SVZ區(qū)分離培養(yǎng)的原代NSCs，觀察毛蕊花糖苷對其增殖的影響，結(jié)果表明在無EGF和bFGF的情況下，毛蕊花糖苷能促進(jìn)體外培養(yǎng)的NSCs增殖，并且毛蕊花糖苷對NSCs增殖的影響具有濃度依賴性，并隨毛蕊花糖苷濃度的升高對NSCs增殖的作用不明顯，且促進(jìn)NSCs增殖的作用濃度為10 μmol·L-1。但是，由于有絲分裂原組bFGF、EGF 所用濃度為20 μg·L-1，而藥物有效的濃度是10 μmol·L-1，因此并不能簡單的從藥物劑量上來進(jìn)行分析。毛蕊花糖苷對于NSCs分化的影響還有待于進(jìn)一步的研究。

PI3K/Akt通路是經(jīng)典的與細(xì)胞增殖和存活密切相關(guān)的信號通路，它對于NSCs的活動也具有重要作用。PI3K/Akt通路能夠調(diào)控內(nèi)源性NSCs的增殖、分化和遷移[16]。研究表明，NSCs中Akt的過表達(dá)能夠增強(qiáng)細(xì)胞增殖而減少細(xì)胞分化。在成年NSCs中，Akt也能夠通過與其他生長因子或配體如bFGF、shh結(jié)合被激活[17]。因此，我們進(jìn)一步考察了毛蕊花糖苷對PI3K/Akt 信號通路的作用。結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷能明顯提高p-Akt的表達(dá)，而在加入 PI3K/Akt信號通路阻斷劑LY294002后，這一作用被阻斷。

本研究首次從毛蕊花糖苷促進(jìn)原代NSCs增殖的角度闡釋其類似神經(jīng)營養(yǎng)因子活性，為毛蕊花糖苷在臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，中藥新藥研發(fā)中心完成。感謝王彧、邵瑞、韓立峰、朱彥、高秀梅、韓靜、段偉兵等在實(shí)驗(yàn)上提供的支持與幫助。)

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Acteoside promotes proliferation of neural stem cells from adult mice by activating PI3K/AKT pathway

LIN Hui-min1,2，DUAN Wei-bing1,2，SHAO Rui1,2，HAN Li-feng1，ZHU Yan1,2，GAO Xiu-mei1，WANG Yu1,2

(1.TianjinKeyLaboratoryofModernChineseMedicine，TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300193，China;2.ResearchandDevelopmentCenterofChineseMedicine，TianjinInternationalJointAcademyofBiotechnologyandMedicine，Tianjin300457，China)

Abstract：AimTo clarify the effect of acteoside on proliferation of neural stem cells(NSCs) from adult mice，as well as the involved signaling pathway.MethodsNSCs were isolated from the subventricular zone(SVZ) of adult C57BL/6 mice，then identified by immunofluorescence staining with Nestin，the marker of NSCs. NSCs were exposed to acteoside(5，10，20，40 μmol·L-1)in absence of mitogen(EGF/bFGF)for 24 h. We employed CCK8 assay to detect NSCs viability and BrdU staining to identify NSCs proliferation. We performed Western blot to quantify the expression level of p-Akt induced by acteoside on NSCs.ResultsWithout mitogen，acteoside increased NSCs proliferation by activating p-Akt，which can be blocked by LY294002，the inhibitor of PI3K/AKT signaling pathway.ConclusionActeoside promotes the proliferation of NSCs from adult mice by activating PI3K/AKT pathway.Key words：acteoside；adult mice；neural stem cells(NSCs)；the subventricular zone(SVZ)；proliferation；Akt pathway

收稿日期:2016-01-29,修回日期:2016-03-02

基金項(xiàng)目：天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃一般項(xiàng)目(No 14JCYBJC42900)

作者簡介：林慧敏(1992-)，女，碩士，研究方向：神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化，E-mail：272996204@qq.com；

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.019

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0836-05

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R322.81；R329.24

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.038.html

王彧(1981-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化，通訊作者，E-mail：wangyu@tjutcm.edu.cn